不同基因型顆石藻(Emiliania huxleyi)對海洋酸化及 高光耦合的生理響應

林燕妮,王寅初,任慶敏,唐永政

(1.煙臺大學海洋學院,山東 煙臺 264005;2.中國科學院煙臺海岸帶研究所,山東 煙臺 264003;3.國家基礎學科公共科學數據中心 北京 100190;4.中國科學院海洋大科學研究中心,山東 青島 266071)

顆石藻(Coccolithophore)為具有鈣質外殼的單細胞海洋浮游植物,屬于定鞭藻門(Haptophyta),定鞭藻綱(Prymnesiophyceae)[1]。作為海洋中鈣化生產力最高的浮游植物類群,顆石藻的年碳酸鈣產量為海洋年碳酸鈣總產量的三分之一,遠洋沉積物中的碳酸鈣約有一半是由顆石藻生產沉降[2]。顆石藻是海洋初級生產力的重要貢獻者,通常占初級生產力的1%到10%,在形成季節性水華時占40%[3]。顆石藻在生長過程中通過光合作用捕獲二氧化碳,并在鈣化作用中釋放二氧化碳,兩者對二氧化碳捕獲和釋放的差異是模擬海洋碳循環的重要因素[4],因此,顆石藻在生物地球化學循環和氣候調節方面扮演重要角色[5-6]。Emilianiahuxleyi是分布最廣的顆石藻物種,也是海洋碳循環研究中的“模式生物”。

隨著人類生產活動對化石燃料消耗增加,大量CO2釋放到大氣中對全球氣候及環境造成一系列問題,包括海洋酸化、全球變暖等。進而對海洋生態系統產生嚴重危害,影響海洋浮游植物的生長[7-8]。全球變暖會導致海洋上層混合層變淺,使生活在海洋混合層中上部分的顆石藻暴露在高光的海洋環境中[9-10],導致顆石藻會受到海洋酸化和更強光照輻照[11],不同環境因素的耦合對顆石藻的影響也會有差異。

顆石藻如何應對環境的變化受到眾多關注。有研究表明顆石藻鈣化作用產生的顆石粒鈣質外殼可以保護藻細胞避免受光損傷[12],顆石粒對光照輻射起遮蔽作用,保護細胞耐受強光脅迫,使紫外輻射(UVR)和有效光輻射(PAR)的透過效率降低[9]。

CO2對不同種類E.huxleyi的鈣化有著不同影響,有促進、抑制及無變化,有研究指出這種差別是由于遺傳基礎不同導致的種間差異所致[12]。蔡小霞等[14]對E.huxleyi在不同濃度CO2下的鈣化作用進行了研究,發現CO2增加到一定濃度時能促進鈣化作用,但濃度過高則抑制生長、鈣化停止。不同種顆石藻鈣化的響應程度不同,甚至同種的不同株系之間表現也有區別:隨著二氧化碳濃度p(CO2)增加,E.huxleyi和Gehyrocapsaoceanica的鈣化被抑制[15-16]。當p(CO2)從150 μatm增加到915 μatm時,Calcidiscuspelagicus的鈣化對p(CO2)上升的響應很微弱,其鈣化速率呈現非線性變化,當p(CO2)高于或低于現今水平時,其鈣化作用都減弱[17]。因此研究海洋酸化對顆石藻鈣化作用時具有種間特異性。

BENDIF等研究表明E.huxleyi分為α與β兩個清晰的進化枝[18],兩者之間有較為顯著的生理與形態差異。本研究采用E.huxleyi兩種不同基因型——采集自秘魯上升流同一海域的藻株PERU41和PERU46。經進化分析表明,PERU41和PERU46分別屬于α、β進化支,兩者有遺傳可比性,且經電鏡觀察發現PERU41具有較厚的鈣質外殼而PERU46的外殼較薄。本研究考慮了兩株顆石藻在不同p(CO2)下的生理響應及酸化條件下對短期高光脅迫的響應。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗藻種及培養條件

實驗所用的鈣化顆石藻E.huxleyiPERU41和PERU46由法國歐洲環境地球科學教育研究中心Luc Beaufort教授提供。經系統發育分析證明,PERU41和PERU46分別屬于E.huxleyi的α進化支與β進化支[19]。

實驗藻株的培養光照為100 μmol·m-2·s-1,培養溫度為15 ℃,光暗周期設置為12L∶12D。本實驗p(CO2)設置兩種:0.04%(低)和0.1%(高),其中0.04%是實驗室目前空氣中二氧化碳的分壓,0.1%是預測至21世紀末大氣中二氧化碳的濃度[10],通過在二氧化碳光照培養箱(HGZ-CO2-250,躍進醫療,中國上海)中控制純二氧化碳與空氣混合獲得。培養基使用前,在相應二氧化碳分壓下預先平衡。首先進行細胞馴化,在相應p(CO2)下培養實驗藻株,當細胞濃度達到105個/mL后,再次進行馴化,使實驗藻株適應相應的實驗條件。接種起始密度為500 個/mL,當細胞濃度達到105個/mL以上時,將馴化適應實驗條件后狀態良好的藻株,轉接到125 cm2的透氣蓋細胞培養瓶中進行正式實驗,兩藻株各設置三個平行。

正式實驗培養周期10 d后(約12代),細胞密度達到5×104～1×105個/mL時收樣,并測定藻細胞對短期高強度光照(400 μmol·m-2·s-1)的響應。

1.2 培養液碳酸鹽系統參數測定

pH值的測定:使用pH計(上海雷磁)測定。

堿度(TA)的測定:使用總堿測試儀測定。

碳酸鈣飽和度ΩCa的計算公式如下:

式中,Ksp為碳酸鈣解離常數,單位為mol2·kg-2。

1.3 細胞生長率及粒徑測定

藻細胞密度為5×104～1×105個/mL時收樣,計算生長率,公式如下:

μ=(lnc2-lnc1)/(T2-T1),

式中,μ為生長率,c1為T2時的細胞濃度,c2為T1時的細胞濃度。

收樣后對藻液進行稀釋,由流式細胞攝像系統FlowCAM進行藻細胞粒徑測量。

1.4 顆粒無機碳(PIC)和顆粒有機碳(POC)的含量測定

將0.7 μm的玻璃纖維膜進行預處理,經錫紙包裹后在馬弗爐中450 ℃燃燒12 h以上,以除去濾膜上的碳。收藻時將100 mL藻液過濾收集到膜上,濾膜冷凍保存。用于測POC的玻璃纖維濾膜提前濃鹽酸酸熏過夜,以除去膜上無機碳。將濾膜于60 ℃烘干2 h之后,錫紙包裹制樣并在元素分析儀中進行PIC和POC含量測定。將細胞中POC和PIC含量與生長率(μ)相乘,計算PIC和POC的生產速率:

PIC產率=PIC含量×μ,

POC產率=POC含量×μ。

1.5 細胞外殼的結構觀察

用25 mm聚碳酸酯濾膜(1 μm孔徑)抽濾2 mL藻液,過濾前搖勻使藻細胞在膜上均勻分布,將收集到的細胞在烘箱50 ℃干燥2 h,使用掃描電子顯微鏡(SEM)拍照觀察。

1.6 細胞色素含量測定

細胞色素使用100%甲醇4 ℃黑暗條件下過夜進行提取。將浸取液使用掃描分光光度計進行200～800 nm波長下掃描,用以下公式計算類胡蘿卜素[21]、葉綠素a和葉綠素c[22]的含量(μg/mL):

ρ(葉綠素a)=16.29×(A665-A750)-8.54×

(A652-A750),

ρ(葉綠素c)=28.819 1×(A632-A750)-

6.013 8×(A665-A750),

ρ(類胡蘿卜素=7.6×(A480-A750)-1.49×

(A510-A750)。

1.7 葉綠素熒光參數測定

最后一天收樣時,使用葉綠素熒光儀(PAM,AquaPen-C,捷克PSI)對顆石藻細胞的葉綠素熒光進行測定。測量獲得最大光化學效率(Fv/Fm)及在0、3、6、9、15、27和48 min時有效光化學效率(YPSⅡ)和非光化學淬滅(NPQ),并通過Origin擬合計算光系統Ⅱ(PSⅡ)的損傷/修復速率來反映細胞對短期高光脅迫的響應。

快速光響應曲線設置6個光強梯度(光合有效輻射PAR分別為10,20,50,100,300,500 μmol·m-2·s-1),每個光強時長為60 s,計算相對電子傳遞速率(rETR):

rETR=YPSⅡ×PAR×0.5,

其中,常數0.5表示細胞吸收的光能的50%傳遞到光系統Ⅱ(PSⅡ)。

表觀光合效率(α)、飽和光強(Ik)及最大相對電子傳遞速率(rETRmax)通過Origin將rETR數據回歸擬合得到。

光系統Ⅱ的修復速率k(min-1)及短期高光脅迫處理時光系統Ⅱ的修復速率r(min-1)的計算公式如下[23-24]:

k=-[ln(Yn/Y0)]/t,

r=k×Yn/(Y0-Yn)。

其中Yn和Y0表示YPSⅡ在時間tn和t0時的值。

1.8 統計分析

2 結 果

2.1 碳酸鹽系統參數

表1 初始培養基碳酸鹽系統參數

2.2 細胞生長率及粒徑

在高p(CO2)條件下,PERU41和PERU46生長率均下降,但相同p(CO2)條件下PERU46的生長率高于PERU41且差異具有統計學意義(圖1(a))。

不同小寫字母表示相同p(CO2)下不同藻株間差異有統計學意義(P<0.05);不同大寫字母表示相同藻株在不同p(CO2)下差異有統計學意義(P<0.05)。

PERU41細胞平均粒徑均顯著大于PERU46。與低p(CO2)相比,在高p(CO2)條件下PERU46和PERU41的細胞粒徑均顯著減小(P<0.05)(圖1(b))。PERU41細胞粒徑較大,可能是其鈣化能力較強,產生較厚的碳酸鈣外殼,增大了細胞尺寸。PERU41細胞較小,可能是因為其具有較高的生長的速率,在脅迫條件下將更多的能量用于增殖。

2.3 PIC和POC的含量及產率

如表2所示,PERU46與PERU41中的PIC含量組間差異有統計學意義(P<0.05)。尤其是在高p(CO2)時,PERU41細胞內PIC含量有顯著提高(P<0.05),而PERU46細胞內的PIC含量降低,說明酸化條件下PERU46的鈣化作用顯著降低。隨著p(CO2)增加,藻株的PIC含量和產率均有所減少。PERU46的POC含量及產率均顯著高于PERU41(P<0.05),細胞內POC含量高與PERU46高生長速率相符。在p(CO2)較高時,會導致顆石藻的生長速率下降及顆石藻細胞內的POC含量升高。在本實驗中,PERU41的PIC/POC比值隨著p(CO2)的增加而增加,但PERU46的PIC/POC比值隨著p(CO2)的增加而減少,PERU46的變化規律與前人試驗研究的規律相同[27-28]。

表2 酸化條件下POC和PIC的含量及產率

2.4 細胞外殼的鈣化情況

由電鏡觀察結果(圖2、3)可見,在高p(CO2)條件下,藻株的顆石粒大多會產生畸形狀況,同時也有正常鈣化的顆石粒。PERU46在高p(CO2)條件下觀察到較多的畸形顆石粒,PERU41顆石粒的總體完整程度較PERU46更好。PERU41在不同的p(CO2)下都有完整的顆石粒,低p(CO2)條件下,電鏡觀察到破損的顆石粒多,而在較高p(CO2)培養條件下仍能發現較多的完整的顆石粒。據此推測,顆石藻PERU41適應酸性環境,高p(CO2)對其生物鈣化作用沒有產生明顯的抑制作用。

圖2 不同p(CO2)條件下顆石藻PERU41細胞形態及顆石粒狀態

圖3 不同p(CO2)條件下顆石藻PERU46細胞形態及顆石粒狀態

2.5 細胞色素含量

與低p(CO2)相比,在高p(CO2)下兩藻株細胞的光合色素含量均有所增加,PERU46細胞的葉綠素c及類胡蘿卜素含量顯著增加(P<0.05),分別增加了52%、21%,PERU41胞的葉綠素c含量增加顯著(P<0.05),增加了15.3%(圖4)。

不同大寫字母表示相同藻株在不同p(CO2)下差異有統計學意義(P<0.05)。

2.6 基于葉綠素熒光的光合生理變化

如圖5所示,兩種p(CO2)對PERU41與PERU46細胞的Fv/Fm無顯著影響(P>0.05),兩株藻細胞間的Fv/Fm差異無統計學意義(P>0.05)。

不同小寫字母表示相同p(CO2)下不同藻株間差異有統計學意義(P<0.05),不同大寫字母表示相同藻株在不同p(CO2)下差異有統計學意義(P<0.05)。

在低p(CO2)條件下,兩藻株之間的表觀光合效率α差異無統計學意義,PERU46的最大電子傳遞速率rETRmax顯著低于PERU41(P<0.05),在高p(CO2)條件下,兩藻株之間的α和rETRmax差異均無統計學意義(P>0.05),但PERU41的飽和光強Ik顯著高于PERU46(P<0.05)。與低p(CO2)相比,高p(CO2)條件下PERU41和PERU46的Ik、α和rETRmax均顯著下降(P<0.05),PERU41分別下降16.6%、35%、22.5%,PERU46分別下降22.1%、21.7%、18.8%(表3)。

表3 高p(CO2)與低p(CO2)下的電子傳遞鏈參數α、rETRmax、Ik

2.7 對高光的短期光化學響應

低p(CO2)條件下適應后,PERU41和PERU46的有效光化合效率YPSⅡ在48 min的高光處理中具有相同的變化趨勢,先顯著下降30 min后趨于穩定。正常培養光照下的兩藻株具有最高的YPSⅡ,高光脅迫下YPSⅡ均顯著降低(圖6(a)),其抑制率為50%左右,結果表明高光處理對顆石藻細胞的光合作用具有負面影響。在高光條件下,兩藻株的NPQ變化趨勢與YPSⅡ相反(圖7(a)),表明藻細胞在高光條件下受到脅迫。短期高光處理后,與低p(CO2)條件相比,高p(CO2)條件下的PERU46的YPSⅡ顯著下降,而PERU41細胞則無顯著差異(圖6(b))。

圖6 不同p(CO2)下顆石藻的YPSⅡ

圖7 不同p(CO2)顆石藻的NPQ

高p(CO2)條件下適應后,PERU46及PERU41的NPQ在高光處理下有所上升但差異無統計學意義。高p(CO2)短期高光處理下PERU46的NPQ更高(圖7(b)),其通過增強NPQ耗散多余光能來應對高光脅迫,表明鈣化較弱的藻株更容易受高光脅迫。

2.8 在高光下PSⅡ的損傷及修復速率

相同p(CO2)條件下,PERU41及PERU46的修復速率在正常光照下的修復速率均高于高光條件的修復速率,組間差異有統計學意義(P<0.05),兩藻株之間的修復速率在相同光照處理下差異無統計學意義(P>0.05)。與低p(CO2)相比,高p(CO2)條件下適應的PERU46細胞在正常光照及高光下PSⅡ的修復速率均下降,但PERU41細胞PSⅡ的修復速率均上升(圖8(a))。

不同小寫字母表示相同p(CO2)下不同藻株間差異有統計學意義(P<0.05);不同大寫字母表示相同藻株在不同p(CO2)下差異有統計學意義(P<0.05);*表示正常光照和高光處理組間差異有統計學意義(P<0.05)。

低p(CO2)適應下高光處理導致兩藻株PSⅡ的損傷速率均顯著升高(P<0.05)。高p(CO2)條件下,兩藻株PSⅡ的損傷速率在正常光照及高光處理下的差異均無統計學意義(P>0.05)。相比于低p(CO2)條件,高p(CO2)條件下細胞PSⅡ的損傷速率上升(圖8(b))。

在正常光照低p(CO2)條件下生長的細胞其修復/損傷比值均大于1,說明PSⅡ修復速率大于損傷速率。高光處理下兩藻株PSⅡ的修復/損傷比值顯著下降。與低p(CO2)條件相比,高p(CO2)條件下的PERU46的PSⅡ修復/損傷比值顯著下降約60%(P<0.05),且PERU41的修復/損傷比值顯著高于PERU46(P<0.05)(圖8(c))。

3 討 論

3.1 酸化條件下細胞的生理響應

本實驗探究E.huxleyi兩種不同基因型的藻株PERU41和PERU46在不同p(CO2)下的生理響應差異。掃描電鏡下觀察細胞形態及顆石粒形態發現PERU41和PERU46的鈣化存在差異,PERU41的鈣化作用更強,酸化對其鈣化具有促進作用,而PERU46的鈣化作用較弱,酸化條件會抑制其鈣化作用。高p(CO2)條件下,PERU46的生長率及POC的含量和產率均顯著高于PERU41,這表明兩株基因型不同的顆石藻對海洋酸化的響應方式不同,PERU41具有更強的鈣化作用可以抵御海洋酸化的負面影響,而PERU46通過強的增殖能力來抵御海洋酸化。

酸化條件導致顆石藻細胞的飽和光強、表觀光合效率及最大電子傳遞速率均降低,表明酸化條件抑制細胞的光合作用效率。高p(CO2)下PERU46細胞的葉綠素c及類胡蘿卜素含量顯著增加,分別增加了52%、21%。這可能是PERU46細胞受到更強的氫離子脅迫,細胞通過增加光合色素的含量來增強捕光能力獲得更多能量來抵御高p(CO2)下的氫離子脅迫。PERU41與PERU46相比具有更高的電子傳遞效率,表明PERU41對光能的利用更為高效,這與PERU41相對較低的生長率不相符。這種情況表明,PERU41更強的鈣化作用消耗了大量的能量,而PERU46的鈣化相對較弱將光能更多的用于增殖。

大量研究表明,海洋酸化對顆石藻生長及鈣化作用既有積極作用也有消極作用[29]。積極作用體現為可以增加海水中的二氧化碳及碳酸氫根離子等光合作用底物,增強海洋浮游植物的光合作用,從而對其生長具有正面影響。消極的酸化效應則會增加海水中氫離子的濃度,影響細胞膜的氧化還原及通透性,并影響胞內pH和蛋白質氨基酸的平衡[30-31]、降低E.huxleyi的光合作用效率[32]。JIN等的研究發現特定海洋酸化條件(1000 μatm的CO2濃度)對顆石藻的生長具有促進作用[33],這與本實驗的結論一致。本實驗中,高p(CO2)條件下細胞的生長速率雖略有下降,但POC生產速率相比于低p(CO2)條件升高,說明酸化對顆石藻E.huxleyi的正面效應相對于的負面效應更加顯著。PERU46生長速率在兩種二氧化碳濃度下均高于PERU41,說明PERU46通過增強增殖能力來適應海洋酸化條件。PIC/POC的比值及電鏡下形態觀察均表明PERU41的鈣化能力更強。在高p(CO2)條件下,PERU46細胞的PIC含量及產率降低說明酸化條件下PERU46鈣化作用受到了抑制,與前人的研究海洋酸化會導致顆石藻鈣化作用下降相符[34]。

生物所同化的能量只用于生長和繁殖,不同生物的能量分配不同就形成不同的對策:選擇r對策的生物分配更多能量用于繁殖,而選擇K對策的生物則分配更多能量用于個體生長[35]。結合這兩種不同基因型藻株以上生理參數以及生長速率的監測,推測PERU46和PERU41在應對酸化脅迫時分別采用了r對策與K對策,前者分配更多能量用于快速繁殖,而后者則保守地分配更多能量用于保護性的外殼加固。

3.2 不同p(CO2)及高光條件下細胞光合生理響應

本實驗探究E.huxleyi兩種不同基因型的藻株PERU41和PERU46在適應不同p(CO2)后進行短期高光脅迫,研究顆石藻對海洋酸化及高光耦合條件下的光合生理響應。細胞在受到光脅迫時會通過提高NPQ耗散光合色素捕獲的過剩能量以達到保護目的[32]。在低p(CO2)短期的高光脅迫處理下,鈣化較弱的PERU46比鈣化作用較強的PERU41具有更高的非光化學淬滅能力,說明PERU46受到更強的高光脅迫。有研究表明E.huxleyi的顆石粒對不同光質的光都具有遮擋作用,可以阻擋10%～22%的可見光及20%～25%的紫外光[10]。因此PERU46受到更強的高光脅迫可能是由于其鈣質外殼較薄相較于PERU41不能阻擋更多的可見光所導致的。

低p(CO2)條件下,經過短期高光處理的PERU41和PERU46細胞的最終YPSⅡ和修復比率/損傷比率相似。這結果說明PERU46通過其他的光耗散途徑抵消PERU41更厚鈣質外殼對高光的遮蔽作用,達到保護細胞的目的。高p(CO2)條件下,PERU46的最終YPSⅡ及短期高光處理下的修復速率均顯著降低,這說明海水酸化會加劇高光對顆石藻的脅迫作用。

植物細胞的光合作用能否正常運行由光系統Ⅱ D1蛋白的損傷與修復間的平衡決定[36]。在高p(CO2)條件下,PERU46細胞高光脅迫下PSⅡ的修復速率下降,可能是由于高p(CO2)條件導致細胞消耗更多的能量抵御海水酸化。D1蛋白修復所能利用的能量減少,及酸化條件下細胞內氫離子濃度升高會直接影響D1蛋白修復分子的功能都會導致光系統Ⅱ中的D1蛋白修復速率下降。NISHIYAMA等的研究表明光合色素所吸收的過剩光能也會降低D1蛋白的修復速率[37]。本實驗中,高p(CO2)條件下PERU46細胞內葉綠素c及類胡蘿卜素含量顯著增加,光系統就會吸收更多的光能,導致D1蛋白修復速率降低。高p(CO2)條件下,PERU41和PERU46細胞的損傷速率均提高且速率相近,表明酸化條件下E.huxleyi細胞更容易受到高光的脅迫。但PERU41細胞的PSⅡ修復速率提高,導致PERU41細胞的PSⅡ修復/損傷速率高于PERU46細胞。

高光脅迫下酸化條件中的PERU41細胞的最終YPSⅡ高于PERU46,表明酸化對鈣質外殼的影響會導致顆石藻細胞更容易受到高光的脅迫。與低p(CO2)適應相比,高p(CO2)適應下PERU46細胞在短期高光脅迫下的最終YPSⅡ顯著降低,表明海洋酸化會通過影響顆石藻鈣化作用增強高光的脅迫作用。這可能是由于缺乏顆石粒提供的穩定微環境,鈣化水平會影響海洋生物對海洋酸化的生理反應[38]。

4 結 論

綜上所述,屬于β進化枝的PERU46的比生長速率較高,而α進化枝的PERU41鈣化水平較高。在海洋酸化條件中PERU46會消耗更多的能量用于增殖,而PERU41會增強鈣化作用來適應環境變化,反映出兩者不同的生存策略。與低p(CO2)適應相比,高p(CO2)適應下最終YPSⅡ、修復速率降低及損傷速率升高均表明酸化條件會增強高光對顆石藻的脅迫作用,而兩者的應對策略也有所不同:PERU46通過增加NPQ來應對,而高鈣化作用的PERU41則依靠更厚鈣質外殼對高光的遮蔽作用。