PRR11和MMP9在膠質瘤中的表達及與臨床預后的關系

江曉珍,鄧 葵,花美玲,郭芬棻,楊玄勇,萬紅萍

(南昌大學第一附屬醫院a.病理中心; b.骨科; c.神經外科,南昌 330006)

膠質瘤是中樞神經系統(CNS)最常見的腫瘤,約占所有CNS腫瘤的27%[1]。近年來,膠質瘤分子標志物檢測作為補充診斷依據、預測疾病預后的手段,極大推進了原有的單純組織學分類[2]。富含脯氨酸蛋白11(PRR11)在細胞中周期性表達,與多種腫瘤的發生、發展密切相關,但其與膠質瘤組織病理學分級、IDH1突變狀態之間的關系少見報道?；|金屬蛋白酶9(MMP9)是基質金屬蛋白酶中相對分子質量最大的酶,以酶原的形式分泌,通過水解細胞基底膜、纖維黏連蛋白等促進腫瘤細胞的侵襲及遷移[3]。本研究通過分析PRR11和MMP9在膠質瘤石蠟組織中的表達,探討它們及與膠質瘤分子分型、臨床病理參數和患者生存預后的關系。

1 臨床資料

1.1 病例選擇標準

入選標準:1)經影像學、病理明確診斷為膠質瘤;2)初次發病、首次手術切除;3)術前未接受放、化療及其他治療;4)入組病例具有完整的臨床及病理學信息。

排除標準:1)合并其他病患,如自身免疫病、血液系統病、血友病等;2)應用抗凝治療或抗血小板治療;3)發生膠質瘤前有血栓病史;4)有其他惡性腫瘤病史。

1.2 研究對象

收集2017—2019年于南昌大學第一附屬醫院行手術切除且經病理確診的100例膠質瘤患者臨床資料,并獲取其膠質瘤組織(膠質瘤組,n=100)及瘤旁腦組織(正常組,n=100)。100例患者中男52例,女44例,年齡13～78歲(中位年齡53歲)。根據第五版神經系統腫瘤WHO分級[4],其中IDH1突變型彌漫性星形細胞瘤45例,IDH1野生型彌漫性星形細胞瘤NOS 14例,膠質母細胞瘤、IDH1野生型41例。按組織病理學分類,低級別膠質瘤(WHO 1、2級)36例,其中1例發生1p19q雜合性缺失;高級別膠質瘤(WHO 3、4級)64例,1p19q存在雜合性缺失1例?；颊咝g前均未接受任何藥物及放射治療,術后給予規范治療。該研究獲得南昌大學第一附屬醫院倫理委員會的批準。

2 方法

2.1 材料與試劑

兔抗人PRR11多克隆抗體(稀釋比例1：200)購自Abcam公司,兔抗人MMP9單克隆抗體購自福州市邁新生物技術開發公司,鼠抗人IDH1單克隆抗體購自ORIGENE公司,辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG購自上海滬峰化工有限公司,鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)試劑盒購自美國Abcam公司,二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2.2 免疫組織化學染色

石蠟組織經脫蠟、脫水、枸櫞酸緩沖液(pH6.0)高壓熱修復3 min,3%H2O2封閉內源性過氧化物酶30 min,PBS沖洗后滴加兔抗PRR11、MMP9單/多克隆抗體(1：200),鼠抗人單克隆抗體IDH1工作液,4 ℃孵育過夜,室溫孵育1 h后PBS沖洗滴加Envision廣譜二抗,37 ℃孵育30 min,DAB顯色,蘇木精復染。用PBS代替一抗作為陰性對照。

2.3 結果判讀

由兩位病理科醫師采用雙盲法判定,若意見不一致則由本科室另一位主任醫師最終判定。IDH1表達于細胞質,以細胞質內出現棕黃色或棕褐色顆粒判為陽性細胞,陽性細胞超過5%為IDH1突變陽性。p53表達于細胞核,以細胞核出現彌漫棕黃色或棕褐色,或不著色判為突變型;細胞核出現強弱不等著色,且散在分布判為野生型。PRR11蛋白主要定位于細胞質,陽性細胞描述分為無著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色。MMP9蛋白定位于細胞質,采用染色面積和強度雙重評分法:1)陽性細胞數所占的比例計分依據,無陽性細胞為0分,<25%為1分,25%～50%為2分,>50%～75%為3分,>75%為4分。2)陽性強度所占的比例計分依據,無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。將1)和2)評分相乘,<6分為低表達,≥6分為高表達。

2.4 統計學方法

采用SPSS22.0和GraphPad Prism 5.0進行數據分析。計數資料以n(%)表示,組間比較采用χ2檢驗;PRR11與MMP9表達的相關性分析采用Spearman檢驗;采用Kaplan-Meier法計算生存率,組間生存率比較采用Log-rank檢驗;采用Cox比例風險回歸模型分析影響生存預后的因素,計算風險比(HR)和95%的可信區間(95%CI)。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 2組PRR11和MMP9的表達

PRR11和MMP9的表達見圖1—2。膠質瘤組PRR11和MMP9陽性表達率均高于正常組(χ2=47.77、χ2=82.42;P<0.01),見表1。Spearman相關分析顯示,膠質瘤組PRR11和MMP9蛋白表達呈正相關(r=0.71,P<0.01),見表2。

表2 PRR11和MMP9在膠質瘤組織中表達的相關性 例

A:低級別膠質瘤蘇木精-伊紅染色;B:PRR11;C:MMP9;D:IDH1。圖1 低級別膠質瘤組織HE形態及部分免疫組織化學表達

A:高級別膠質瘤蘇木精-伊紅染色;B:PRR11;C:MMP9;D:IDH1。圖2 高級別膠質瘤組織HE形態及部分免疫組織化學表達

3.2 PRR11和MMP9的表達與膠質瘤患者臨床病理特征的關系

PRR11和MMP9的表達與腫瘤直徑、腫瘤細胞增殖指數、腫瘤組織學分級和p53突變有關(P<0.01),與患者年齡、性別、IDH1突變狀態均未顯示相關性(P>0.05)。見表3。

表3 PRR11和MMP9蛋白與臨床病理特征的關系 例

3.3 PRR11和MMP9蛋白表達與膠質瘤患者3年總生存率的關系

100例膠質瘤患者中PRR11陽性和陰性表達患者3年總生存率分別為32.1%和61.7%,差異有統計學意義(P<0.01);MMP9陽性和陰性表達患者3年總生存率分別為35.3%和59.4%,差異有統計學意義(P<0.01);PRR11和MMP9均陽性、單一陽性及均陰性表達的患者3年總生存率為28.0%、32.0%和65.5%,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

A:PRR11陰性和陽性表達者3年總生存率;B:MMP9陰性和陽性表達者3年總生存率;C:PRR11和MMP9均陽性和陰性與單一陽性表達3年總生存率。

3.4 Cox比例風險回歸模型分析影響膠質瘤臨床預后因素

將膠質瘤臨床病理參數、PRR11和MMP9表達狀態納入Cox比例風險回歸模型,分析影響膠質瘤臨床預后的因素。結果顯示,腫瘤組織學分級、細胞增殖指數、p53突變、MMP9表達和PRR11表達與膠質瘤患者預后有關(P<0.05);其中腫瘤組織學分級是影響膠質瘤患者預后的獨立危險因素(HR=30.03,P<0.01)。見圖4、表4。

表4 膠質瘤患者總生存率相關因素的單因素和多因素分析

A:腫瘤組織學分級;B:腫瘤細胞增殖指數;C:p53的狀態;D:MMP9的表達;E:PRR11的表達。

4 討論

PRR11位于染色體17q22,在多種實體腫瘤中異常表達[5-7],與腫瘤的臨床病理分期、淋巴結轉移及腫瘤分化程度相關。QIAO等[8]研究發現,肝細胞癌組織中PRR11 mRNA的表達水平明顯高于腫瘤旁組織,與腫瘤大小、TNM分期及較差的患者總生存時間相關。CHEN等[9]發現降低膽管細胞癌細胞內PRR11表達水平,細胞周期進程受阻,細胞的侵襲、遷移能力減弱。本文檢測100例膠質瘤及瘤旁組織中PRR11的表達水平,結果顯示膠質瘤組織中PRR11陽性表達率明顯高于瘤旁組織。與膠質瘤臨床病理特征相關性分析顯示PRR11陽性表達與腫瘤直徑、細胞增殖指數、腫瘤組織學分級及p53的突變有關,與文獻[9]報道一致。提示PRR11可能參與膠質瘤發生發展。

ZHU等[10]研究發現,PRR11在卵巢癌組織及細胞中表達量均升高,下調PRR11的表達,細胞的增殖、侵襲和遷移能力受抑制,且其可能通過調控細胞增殖相關蛋白及基質金屬蛋白酶的表達發揮上述生物學功能?；|金屬蛋白酶家族通過降解細胞基底膜、纖維粘連蛋白等成分,促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。許多學者發現MMP9在多種實體腫瘤中表達升高,能增強腫瘤患者術后轉移的風險[11-13],既往報道[14]亦顯示,MMP9陽性表達與膠質瘤侵襲能力密切相關。故本文同樣檢測膠質瘤及瘤旁組織中MMP9的表達,結果顯示,膠質瘤組織中MMP9的表達水平顯著高于瘤旁組織,并與腫瘤直徑、細胞增殖指數、腫瘤組織學分級及p53的突變有關。本文Spearman相關性分析顯示,PRR11與MMP9的表達呈正相關。PRR11、MMP9陽性表達患者的3年總生存率均低于陰性表達者,且PRR11與MMP9均呈陽性表達患者的3年總生存率最低。推測,PRR11與MMP9之間存在一定的聯系,共同促進膠質瘤的臨床進展。

PRR11在多種腫瘤中異常表達,甚至可以作為某些腫瘤患者預后的重要指標。TAN等[15]檢測268例胰腺癌石蠟組織中PRR11的表達,結果顯示其不但與腫瘤的分化程度、遠處轉移密切相關,而且與患者預后相關,PRR11陽性表達患者預后較差。本文生存分析結果亦顯示:PRR11和MMP9與膠質瘤患者總生存時間相關,是影響膠質瘤患者預后的關鍵因素。但COX多因素回歸模型結果顯示PRR11及MMP9并非膠質瘤預后的獨立危險因素,這可能與納入的病例數少及隨訪時間短有關。本文為單中心研究,研究結果可能存在偏倚,兩者能否作為膠質瘤預后的獨立危險因素需后續大規模病例研究證實。

綜上所述,膠質瘤屬多基因突變病,致病因素很多,包括癌基因的激活、抑癌基因突變等。PRR11和MMP9在膠質瘤組織中表達水平升高,且兩者的表達狀態密切相關,對膠質瘤的臨床進展發揮協同促進作用,降低膠質瘤患者的生存期。聯合檢測PRR11和MMP9的表達對膠質瘤的臨床進展有一定的預測價值。