體外傳代對大口黑鱸蛙虹彩病毒毒株毒力的影響

王叢旭，潘曉藝，周可欣，穆雪嬌，姚嘉赟，藺凌云，趙建華，沈錦玉*

(1.湖州師范學院 生命科學學院，浙江 湖州 313001；2.浙江省淡水水產研究所 農業農村部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江省魚類健康與營養重點實驗室，浙江 湖州 313001)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)自20世紀80年代引入中國以后，養殖規模逐漸擴大，現已成為中國第十大淡水養殖魚類[1]。然而，在養殖過程中一些疾病也陸續出現，其中，大口黑鱸蛙虹彩病毒(Largemouth bass ranavirus，LMBV)是影響較大的病毒性病害之一。該病毒于1996年被Plumb等[2]分離和鑒定，并被歸為虹彩病毒科，后來經過遺傳分析證實該毒株為LMBV[3]。2009年鄧國成等[4]首次報道了由虹彩病毒引起的大口黑鱸潰瘍病，經電鏡觀察和序列分析確定為LMBV。雖然LMBV已出現多年，但至今尚無有效的預防和治療藥物。

疫苗免疫是進行病毒性疾病預防最具性價比的手段之一。LMBV相關疫苗，如滅活疫苗[5]、核酸疫苗[6]和亞單位疫苗[7]等已開展研究，并表現出了一定的免疫保護率。Yi等[6]構建的基于MCP基因的大口黑鱸DNA疫苗免疫保護率為63%，Jia等[7]研制的甘露糖修飾MCP亞單位疫苗免疫保護率達到78.94%。然而，針對LMBV的弱毒疫苗目前尚未見報道。LMBV的致弱通常以傳代致弱或者毒力基因的敲除為主要手段。通過在培養細胞中連續傳代致弱，是進行病毒減毒最常見的方法，病毒在培養細胞的多次傳代過程中，常導致病毒基因中一個或多個突變的積累，從而導致減毒[8]。

病毒傳代致弱已在水產和畜禽弱毒疫苗研究中被廣泛應用。通過查閱文獻發現4個LMBV潛在的毒力基因，即E3、TNFR[9]、ICP18[10]和ICP46[11]，根據NCBI已公布的蛙虹彩病毒全基因組中毒力基因序列，LMBV ORF046與預測的E3泛素連接酶(predicted E3 ubiquitin ligase domai，E3)結構域的同源性較高，LMBV ORF057與腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)結構域的同源性較高，LMBV ORF018與蛙虹彩病毒的感染細胞多肽ICP18(infected cell polypeptides 18)的同源性較高，LMBV ORF087與預測的感染細胞多肽ICP46的同源性較高。本研究中，通過對LMBV分離株LMBV-ZJDSS進行連續傳代培養，對不同代次的毒株進行致病性比較、體外生長特性及組織分布研究，以期為LMBV弱毒疫苗研究提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康大口黑鱸體質量為(14±2)g，取自浙江省淡水水產研究所八里店基地。暫養兩周，水溫為28 ℃，pH為7.65，每日投喂兩次商品鱸飼料，且攝食良好。試驗前隨機抽取10尾魚檢測其LMBV、傳染性脾腎壞死病毒和彈狀病毒，確保均為陰性。EPC細胞、大口黑鱸LMBV-ZJDSS毒株由浙江省淡水水產研究所魚病室保存。

新生牛血清購自內蒙古金源康生物工程有限公司，M199 培養基購自美國 Gibco 公司，青霉素、鏈霉素和 PBS 均購自北京索萊寶科技有限公司，2×Flash Hot Start MasterMix(Dye)購自康為世紀生物科技股份有限公司，2×SuperReal PreMix(Probe)購自天根生化科技(北京)有限公司，磁珠法核酸提取試劑盒(AS214)購自洛陽愛森生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據NCBI登錄的LMBV Alleghany 12-343株(GenBank：MK681855.1)的全基因組，設計擴增E3、TNFR、ICP18和ICP46基因的引物(表1)，并由浙江尚亞生物技術公司合成。

表1 LMBV引物探針序列信息

1.2.2 LMBV-ZJDSS傳代 EPC細胞采用含10%血清和1%雙抗(均為體積分數，下同)的M199培養基于24 ℃培養箱中培養。鋪滿單層后，棄培養液，接入病毒液1 mL，24 ℃培養箱孵育1 h后，吸出病毒液，加入細胞維持液(含2%血清和1%雙抗的M199培養基)，于24 ℃培養，每日觀察細胞病變效應 (cytopathic effect，CPE)情況，待CPE達到80%時，收集病毒液，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

進行病毒傳代時，將上一代次的病毒液凍融兩次后，4 ℃下以8 000 r/min離心10 min，取上清液用0.45 μm濾器過濾，接種EPC細胞進行病毒培養和傳代，每隔5代保存在液氮中備用，對F5、F35和F65代毒株進行特性與毒力測定。

1.2.3 不同代次毒株的生長動力學曲線 取濃度為108.5TCID50/mL LMBV-ZJDSS的F5、F35和F65代毒株，分別接種于12孔板鋪滿單層的EPC細胞中，150 μL/孔，24 ℃培養箱孵育1 h，吸出病毒液，接入細胞維持液(2 mL/孔)。定時用顯微鏡觀察細胞病變形態并拍照記錄，分別在1、6、12、24、36、48、72、96、120、144、168 h取病毒培養上清液，每個時間點取3個平行樣，按照Reed-Muench法計算TCID50，并繪制生長動力學曲線。

1.2.4 不同代次毒株致病力的測定 取140尾健康大口黑鱸分為7組，包括6個試驗組和1個對照組，每組20尾。6個試驗組分別用3個代次毒株的兩種濃度進行攻毒，兩種攻毒濃度分別為108.5、109.5TCID50/mL，攻毒劑量為0.1 mL/尾，對照組注射等量EPC細胞液，攻毒方式為腹腔注射。攻毒后每日早、晚觀察，共觀察15 d，并記錄大口黑鱸死亡率。

1.2.5 不同代次毒株在大口黑鱸器官組織中的分布 取50尾健康大口黑鱸分為兩組，分別用F5和F65代毒株進行攻毒，濃度均為108.5TCID50/mL，攻毒劑量為0.1 mL/尾，且在攻毒后的4、8、12、24、48、72、96、120 h分別取兩個攻毒組魚的肝、脾、腎、鰓、腸、腦和心組織，每個組織大約取50 mg，每次隨機選取3尾魚，將各個組織加入無菌PBS中進行研磨，采用磁珠法核酸提取試劑盒(AS214)提取DNA，測量DNA濃度，并將提取的DNA作為模板，用qPCR方法檢測病毒載量。

1.2.6 LMBV-ZJDSS不同代次全基因組測序 將LMBV-ZJDSS第5代和第65代毒株進行擴大培養，收集病毒液，凍融3次，以12 000 r/min離心45 min，取上清液，再將病毒液加入50 mL離心管中，離心管中提前加入配制好的質量分數為30%的蔗糖溶液5 mL，配平后放入超速冷凍離心機中，4 ℃下以50 000 r/min離心3 h。離心完成后立即取出離心管，棄上清液，用150 μL無菌PBS沖洗管壁，懸浮病毒液，提取病毒DNA，送浙江尚亞生物技術公司進行二代測序，并分析不同代次毒株基因組的差異性。

1.2.7 不同地區毒力基因序列分析 篩選4個蛙虹彩病毒毒力相關基因(E3、TNFR、ICP18和ICP46)，其中，ly20912-14、ly20918-23、ly20918-25和ly20918-15為本實驗室分離并保存，Pine 14-204(登錄號：MK681856)、Alleghany 12-343(登錄號：MK681856)和NH-1609(登錄號：MG941005)序列參考NCBI數據庫(表2)，通過設計引物(表1)，對來自不同地區的臨床LMBV陽性樣品進行4個基因的擴增。反應程序：95 ℃下預變性5 min；94 ℃下變性30 s，52 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸100 s，共進行35個循環；最后在72 ℃下再延伸5 min。 PCR產物送浙江尚亞生物技術有限公司進行測序，并對4個毒力基因編碼蛋白采用MAGA 11軟件進行比對分析。

表2 不同代次基因組差異Tab.2 Genomic differences among different generations

表2 蛙虹彩病毒毒株樣品編號及來源Tab.2 Sample numbering and origin of LMBV

2 結果與分析

2.1 不同代次毒株致細胞病變能力比較

將LMBV-ZJDSS毒株在EPC細胞中進行傳代，圖1為F5、F35和F65代毒株接種EPC細胞后在48 h產生的CPE特征，隨著傳代次數的增加，出現CPE的時間變短。這表明，LMBV-ZJDSS毒株在相同病毒滴度下，F65和F35代毒株比F5代毒株表現出更強的致細胞病變能力。

圖1 不同代次毒株感染48 h后細胞的病變差異Fig.1 Difference in cytopathic effect caused by different generations of virus strains for 48 h infection in vitro

2.2 不同代次毒株的生長動力學曲線

通過病毒的復制動力學曲線來比較不同代次LMBV的增值特性。從圖2可見：3個代次毒株的復制趨勢基本一致；3個代次毒株均在48～72 h時達到病毒最高滴度，其中，F5代毒株在72 h時達到最高滴度，為109.5TCID50/mL，F35代和F65代均在36～72 h時達到最高滴度(分別為109.6、109.8TCID50/mL)；在病毒培養過程中，F5代在24 h時病毒滴度超過了F35和F65代，但在48 h時病毒滴度卻低于F35和F65代。

圖2 不同代次毒株的體外生長特性Fig.2 Growth curves of different generations of virus strains in vitro

2.3 不同代次毒株對大口黑鱸的致病力比較

從圖3可見：在相同攻毒濃度下，高代次毒株表現出更低的毒力；當F5、F35和F65代毒株攻毒濃度為108.5TCID50/mL時，攻毒后15 d內，大口黑鱸死亡率分別為60%、25%和5%，而當F5、F35和F65攻毒濃度為109.5TCID50/mL時，大口黑鱸死亡率分別為90%、70%和10%。這表明，LMBV病毒傳代可引起病毒對宿主致病力的減弱。

圖3 不同代次毒株的致病性比較Fig.3 Comparison of pathogenicity among different generations of virus strains

2.4 不同代次毒株在大口黑鱸器官組織中的分布

F5和F65代毒株均以108.5TCID50/mL濃度感染大口黑鱸后，對不同感染時間不同組織中的病毒含量進行測定(圖4(a)～(g))，結果顯示，F5代毒株在感染大口黑鱸后4 h時就可在各臟器中被檢出，而F65代毒株在感染后8 h時才被檢出，表明F5代毒株在體內復制更為迅速。

大口黑鱸被感染后不同組織中，F5代毒株在24～48 h時達到最高病毒載量，而F65代毒株在72～96 h時出現病毒載量峰值，F5代和F65代病毒載量最高的組織均為腸道組織，病毒載量分別達到105.6copies/ng和106.3copies/ng；兩個代次毒株載量在達到最高值后均開始下降(圖4(h))。

2.5 LMBV-ZJDSS不同代次基因組差異分析

采用二代測序技術進行病毒文庫序列測定，通過ORF預測與篩選，共獲得85個編碼框。F65相對于F5代毒株，變異點有8處，其中有3處可以引起氨基酸的改變，2處在ORF 069R區域，氨基酸由亮氨酸變為甲硫氨酸，其編碼的蛋白為神經絲三聯體h1樣蛋白(neurofilament triplet h1-like protein)；1處在ORF 102L區域，第37位氨基酸由天冬氨酸變為酪氨酸，其編碼的蛋白為感染細胞多肽ICP46(表2)。

2.6 不同地區毒力基因的序列分析

通過對不同地區的7個LMBV陽性組織樣品進行4個毒力基因的擴增與測序，結果表明，E3基因編碼區在所有臨床毒株中序列完全相同(圖5(a))，與LMBV中國鱖分離株NH-1609(MG941005)完全一致，與LMBV美國分離株Pine 14-204(MK681856)和Alleghany 12-343(MK681856)僅相差一個堿基。

圖5 E3、TNFR和ICP18氨基酸序列的比對Fig.5 Amino acid sequence alignment of E3，TNFR and ICP18

ICP18基因編碼區序列比較發現，國內的毒株序列完全一致(圖5(b))，與美國株Pine 14-204株和Alleghany 12-343株相比，有7個位點的差異，其中2個位點是非同義變異，出現在第84位和103位，國內流行株分別為丙氨酸和亮氨酸，美國株為蘇氨酸和苯丙氨酸。而ICP46基因編碼區國內外的毒株序列完全相同(氨基酸序列圖略)。

TNFR基因編碼區表現出了較多的變異位點(圖5(c))，共有13個變異位點，13處變異位點均出現在不同的中國分離株中，其中，5處為同義變異，8處變異可引起氨基酸的改變，NH-1609株第168、180、184、188、199、220、222和232位氨基酸分別為絲氨酸、蘇氨酸、蘇氨酸、組氨酸、組氨酸、絲氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，ly20912-14株第178、180、184、188、199、220、222和232位氨基酸分別為苯丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、脯氨酸、亮氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸，ly20918-23株第168、180、184、222和232位氨基酸分別為苯丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸，ly20918-15株和ly20918-25株第222和232位氨基酸分別為脯氨酸和苯丙氨酸。

3 討論

3.1 病毒在體外的連續傳代

蛙病毒是屬于虹彩病毒科的一種DNA病毒，虹彩病毒科包括7個屬，分別為蛙病毒屬(Ranavirus)、細胞腫大病毒屬(Megalocytivirus)、淋巴囊腫病毒屬 (Lymphocystivirus)、水蚤虹彩病毒屬(Daphniairidovirus)、虹彩病毒屬(Iridovirus)和綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus)，以及近年發現的十足目虹彩病毒屬(Decapodiridovirus)[12]。蛙虹彩病毒的感染范圍非常廣泛，可以感染魚類，如鱸和褐籃子魚[13]，還可以感染兩棲類，如蠑螈和牛蛙。其中，LMBV自2009年在國內首次出現之后，在國內各地均有發現，對養殖戶造成了較大的經濟損失。本實驗室分離了一株LMBV，將該毒株在EPC細胞上進行連續傳代致弱，目前已經傳到第65代，并將其與第5代和第35代毒株進行體外生長特性比較，結果表明，在連續傳代的過程中，增加了病毒的細胞適應性，導致細胞病變的速度變快，當病毒培養液達到最高病毒滴度時，被感染細胞釋放到上清液中的病毒粒子與上清液中失活的病毒粒子數量達到平衡，上清液中具有感染性病毒的數量達到最高值，此刻為最佳收獲病毒時間，而不同代次病毒的最高滴度并不會出現較大差異。本試驗中，通過腹腔注射的方式用3個代次的毒株感染大口黑鱸，每個代次分為兩個攻毒濃度，對其感染的大口黑鱸進行為期15 d的觀察，發現F65代毒株感染的大口黑鱸死亡率要低于F5和F35代，這說明在連續傳代過程中，病毒的毒力有所減弱，也為病毒的減毒活疫苗開發提供了有益參考。

3.2 LMBV在大口黑鱸各器官組織中的分布

為比較LMBV不同代次毒株的感染性，筆者在對大口黑鱸攻毒試驗過程中，通過熒光定量檢測出LMBV在大口黑鱸各個器官組織中均存在，其中，腸的病毒載量最高，肝臟和脾臟的病毒載量也較高。F5代毒株攻毒后，在48 h內各組織中病毒載量達到高峰期，之后病毒載量逐漸降低，而F65代毒株攻毒后，在96 h內各組織中病毒載量達到高峰期。楊展展等[14]對LMBV在大口黑鱸體內的動態分布研究表明，心臟在攻毒后4 h檢測出病毒，而腸、腦和鰓在攻毒24 h后才檢測出病毒，心臟的病毒載量最高。此結果與本試驗結果存在一定的差異，可能與攻毒時魚體大小、病毒的濃度及攻毒劑量有關。劉丹等[15]對大鯢蛙病毒(CGSRV)在體內組織分布的研究表明，在各個組織中均能檢測到病毒，其中，肝臟中的病毒載量最高。彭超等[16]運用原位雜交和熒光定量方法，對人工感染蛙病毒(FV3)后鞍帶石斑魚體內不同組織中的分布進行分析，原位雜交結果表明，脾臟和肝臟都有信號，而腦組織中無信號；熒光定量結果表明，脾臟、腎臟和心臟的病毒載量最多。Cunningham等[17]研究表明，林蛙感染FV3后，肝臟和腎臟中的病毒載量較高。綜上所述，蛙病毒的感染性較強，可以侵染到宿主的各個器官組織且感染范圍廣，對很多物種都具有感染性。同時，通過病毒的連續傳代，病毒侵染大口黑鱸的速度逐漸變慢。

3.3 不同代次毒力基因差異比較

為比較不同地區LMBV毒力基因的差異及其遺傳穩定性，本研究中，對不同地區毒力基因序列進行比對，結果表明，E3與NCBI上的中國株序列一致，與美國株僅有一個堿基差異；ICP18與美國株相比，僅有2處變異；TNFR與美國株相比，有1處變異點，但在國內株之間出現了8個變異點；ICP46與國內外毒株則無任何變異點。TNFR變異點較多的原因，可能是病毒宿主所處的地域不同所致，E3與ICP18出現的變異點可能是國內外毒株的差異[18]。至于變異點突變前后的氨基酸，表達出的蛋白質功能是否相同，還有待進一步研究。TNFR樣病毒因子在淋巴囊腫病毒中被認為是一種病毒感受器，其可以與魚類細胞因子TNF結合，并中和其作用[19]。ICP18與ICP46是虹彩病毒科蛙病毒屬的核心基因之一，都屬于立即早期基因(immediate early gene，IE)，IE基因轉錄后產生的病毒蛋白對病毒復制和細胞周期進程具有重要影響[20]。本研究中，對不同代次毒株全基因組序列分析結果表明，F65代毒株與F35代毒株相比，編碼ICP46的一個氨基酸發生突變，此突變可能導致ICP46的功能發生改變，使毒株毒力減弱。夏立群等[21]對SGIV ICP46中一段富含亮氨酸的潛在核輸出信號進行研究，發現NES對ICP46輸出細胞核具有決定性作用。隨著對LMBV的不斷研究，也發現了一些新的問題，毒力減弱后的毒株是否還保留免疫原性，是否可以作為減毒活疫苗候選毒株，本研究中選擇的4個毒力基因是否為LMBV的必需毒力基因，這些問題將在后續試驗中進行驗證。

4 結論

1)通過對LMBV的連續傳代，并將不同代次毒株進行體外生長特性、致病性、感染大口黑鱸后病毒在組織內的載量變化及全基因組測序分析，表明隨著病毒代次的增高，病毒的毒力下降，致病性降低，病毒載量在組織內達到峰值的時間變慢。

2)通過對LMBV傳代致弱進行研究，表明高代次基因組氨基酸的改變可能是毒株毒力下降的原因，而不同地區毒株毒力基因的差異主要集中在TNFR基因上。