血小板輸注無效患者HLA-Ⅰ類抗體產生率及其eplets 的分析*

黃晶晶，何紅紅，王儀含，陸 榮，左元玲，成 婧，蔣 敏，湯龍海*

(1 江蘇省蘇州市中心血站，蘇州 215006；2 蘇州大學附屬第一醫院輸血科)

近年來在尋找提高血小板輸注效果、降低血小板輸注反應發生率的方法方面取得了重要進展，包括輸注ABO 同型血小板、去除血小板輸注成分中的白細胞等[1]，但血小板輸注無效(platelet transfusion refractoriness,PTR)依舊是一個重要的臨床問題，影響著多達14%的血液病患者[2]。發生PTR 的患者一般預后都較差，包括致死性出血增加、生存率降低等[3]。PTR 包括免疫性PTR 和非免疫性PTR，其中約90%的免疫性PTR 與人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-Ⅰ類抗體有關[4]。

HLA 抗體對HLA 等位基因間因氨基酸差異而導致結構差異的抗原表位具有特異性。2006 年R.J.DUQUESNOY[5]提出了“eplet”的概念，eplets 的定義類似于功能表位的概念，它是HLA 分子表面能夠誘導抗體應答所需的最小的氨基酸構型，所涉及到的氨基酸殘基都在3.0～3.5 A°內。Eplets 決定著抗原多態性決定簇的特異性，每個HLA 抗原都被視為一串eplets 的集合。與抗原水平匹配相比，基于eplets 的匹配被認為是改善免疫結局、減少抗體形成的更精確的策略。

為探究PTR 患者體內HLA-Ⅰ類抗體產生的原因，本研究對133 例PTR 的血液病患者體內的HLA-Ⅰ類抗體進行統計，并對檢出抗體對應等位基因的eplets 進行比較分析，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例來源 選取2021 年8 月—2022 年12 月蘇州大學附屬第一醫院收治的133 例出現PTR 的血液病患者，其中急性白血病63 例，骨髓增生異常綜合征32 例，再生障礙性貧血49 例。

1.2 試劑與儀器 LUMINEX 200(LUMINEX)及配套試劑LABScreenTMSingle Antigen HLA Class I 試劑盒(One Lambda)。

1.3 HLA-Ⅰ類抗體檢測 對133 例PTR 患者進行HLA-Ⅰ類抗體檢測，參照試劑說明書操作，在LUMINEX 200 上讀取數據，使用配套軟件分析解讀數據結果。按照微球的平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)判定抗體結果，MFI≥10 000 為強陽性，5 000～＜10 000 為陽性，500～＜5 000 為弱陽性，＜500 為陰性。對所有病例的檢測結果進行匯總分析。

1.4 檢出HLA-Ⅰ類抗體對應等位基因的eplets 分析 對檢出的HLA-Ⅰ類抗體所對應等位基因進行高分辨率eplets 分型，統計抗體出現頻率，并與該抗體對應基因型在人群中出現頻率(數據見http://www.epitopes.net/index.html)進行比較分析?？贵w出現頻率=該基因型抗體出現次數/抗體出現總例數。

HLA 錯配的eplets 數目與患者產生抗體的概率之間存在明確關系[6]，但每個eplet 的免疫原性并不相同，并不是每個eplet 表位都具有相同的免疫原性潛能。本研究參考G.H?NGER 等[7]的研究方法，對eplets 賦予免疫原性評分，每個eplet 評分=eplet 特異性抗體的發生率除以eplet 錯配發生率，其中評分＞0.2 的eplets 是高免疫原性eplets。

2 結果

2.1 PTR 患者HLA-Ⅰ類抗體強度分析 133 例PTR 患者中，共有86 例(64.66%)血清中檢測出HLA-Ⅰ類抗體。其中49 例體內同時存在強陽性、陽性和弱陽性抗體，62 例體內同時存在陽性和弱陽性抗體。

2.2 HLA-Ⅰ類抗體出現頻率與抗體對應等位基因在人群中出現頻率的比較 由表1 可見，86 例HLA-Ⅰ類抗體陽性患者中，共檢測出30 種HLA-A基因型抗體和48 種HLA-B 基因型抗體，其中A*68:02、A*23:01、A*25:01、A*24:03、A*32:01、A*34:02、A*68:01 等和B*57:01、B*15:12、B*49:01、B*08:01、B*15:16、B*56:01 等基因型在人群中出現頻率＜1%，但抗體出現率＞20%；相對的，A*11:01 在人群中出現頻率為20.03%，但只有16.90%的患者體內檢測到了此種基因型抗體，這表明不同基因型的HLA 分子免疫原性不同，誘導抗體產生的能力也有所差別。

表1 不同基因型抗體出現頻率與該基因型在人群中出現的頻率%

2.3 HLA 分子eplets 免疫原性分析 選取在人群中出現頻率＜1%，抗體產生率＞20%的HLA-A 分子和人群中出現頻率＜1%但抗體產生率＞30%的HLAB 分子(共32 個)和低免疫原性HLA 分子(即A*11:01)上的eplets(https://www.epregistry.com.br/)進行比較，由表2 可見，這些高免疫原性HLA 分子大多包含一個或多個高免疫原性評分的eplets，即41T、45KE、62LQ、62GE、80I、82LR、107W、127K、131S、144TKH、145KHA(紅色標出)；而A*11:01 上的eplets免疫原性評分都較低，免疫原性最高的表位為90D，評分為0.125。然而也有部分高免疫原性的HLA 分子(A*34:02、A*66:01、A*66:02、B*07:03、B*08:01、B*81:01)中并沒有高免疫原性評分的eplets 表位。

表2 高免疫原性與低免疫原性HLA 分子間的eplets 比較分析

3 討論

Eplets 的負荷(即供者-受者中不匹配的eplets總和)與抗體形成的程度相關，然而基于eplets 負荷的免疫風險評估作用有限，因為不同的eplets 間的免疫原性差別較大，并非每一個eplet 錯配都能誘導抗體的產生。Eplets 錯配數量的增加與抗體之間的關聯可能僅反映錯配的eplets 越多，患者越有可能暴露于高免疫原性的eplets 的事實[8]。本研究也證實了這一點，多數高頻率抗體所對應的基因型分子上有一個或多個高免疫原性eplets。一是因為G.H?NGER等[7]提出一些表位出現的頻率較低，在受者人群的自身HLA 庫中通常較少出現，雖然免疫原性評分較低，但有相當大的潛在的免疫原性；二是因為本研究的樣本量較少，不具備全面性，可能會造成部分HLA 分子的免疫原性評價虛高的情況，還需擴大樣本量進行研究。

G.H?NGER 等[7]的研究發現無免疫原性的eplets(62RR、76ESN、80TLR、156D、163RW)都定位于在α1或α2 結構域的α-螺旋內，與遞呈的肽位置相當接近，這可能會降低B 細胞受體互補決定區的可及性；而那些免疫原性較高的eplets 多位于α2 結構域的側前方，正好在β2-m 的對面，這也強調了在體液免疫應答開始期間，B 細胞受體能不受阻礙地接近大型抗原區域的重要性。

除了錯配eplets 的空間位置，它的理化性質也影響著自身的免疫原性?？贵w與靶抗原結合的特異性和穩定性受到兩個分子之間靜電和疏水相互作用的強烈影響，不匹配eplets 之間的理化差異(疏水性和靜電電荷)強烈影響HLA-Ⅰ類抗原的免疫原性。V.KOSMOLIAPTSIS 等[9]通過疏水性錯配評分對錯配eplets 的疏水性進行評分。高疏水性或靜電電荷錯配評分的HLA-A 和HLA-B 錯配特異性更具有免疫原性，可能引發同種抗體應答，因此最好避免。

C.S.M.KRAMER 等[10]指出某一HLA 等位基因錯配誘發抗體的概率取決于其最具免疫原性的eplet 在人群中的出現頻率。如果這一頻率較高，則供者和受者更有可能共享該表位，從而導致具有該抗體特異性的患者數量較少。如果人群中該高免疫原性eplet 的出現頻率較低，則在HLA 等位基因不匹配的情況下，針對該HLA 等位基因產生抗體的發生率則較高。然而目前還沒有針對中國人群各個表位出現頻率的大樣本量數據，無法以此為依據篩選可接受錯配。

總之，這提示未來在配型時不僅要關注錯配的eplets 數量，更要關注錯配eplet 的免疫原性，不同的eplets 具有不同的免疫原性，需預防高免疫原性的錯配以避免HLA-Ⅰ類抗體的產生，配型時應根據每個eplet 的危險性質對其進行加權，從而改善基于表位的HLA 匹配。