吉列替尼皮膚毒性的機制及冰片的潛在保護作用

周有容，尹一鳴，黃祥良，胡譽懷，何俏軍

1.浙江大學藥學院，浙江 杭州 310058

2.浙江大學智能創新藥物研究院，浙江 杭州 310018

吉列替尼（Gilteritinib）屬于第二代FLT3新型分子靶向抑制劑，目前已在多個國家和地區被批準應用于FLT3突變的復發性或難治性（藥物難治）急性髓性白血病成人患者的標準化治療［1］。與接受化療的患者比較，接受吉列替尼治療的患者無進展生存期顯著延長，白細胞數全部或部分恢復正常水平的患者顯著增多，展現出極好的治療效果［2］。然而，臨床研究結果顯示，約36%的患者在吉列替尼治療期間出現了皮疹［3］，雖多數患者表現較輕，但仍有部分患者會發展為較為嚴重的急性發熱性嗜中性皮膚?。⊿weet 綜合征）［4-6］，影響患者的生活質量，甚至不得不中止治療，最終導致腫瘤進展。目前對吉列替尼皮膚毒性的治療策略和管理手段十分有限，只能通過局部或全身應用類固醇等手段加以緩解，無法從根本上解決問題。

皮膚主要由表皮、真皮、皮下組織構成，皮疹是由于表皮或淺層真皮異常引起的皮膚疾病。由于真皮淺層中富含大量毛細血管，因此藥物可以通過毛細血管轉運最終直接作用于表皮深層細胞，而表皮深層細胞主要為角質形成細胞。角質形成細胞通過分化、向外遷移至表皮取代表皮脫落的細胞，同時也會分泌各種構成細胞緊密連接的基礎角蛋白，對于維持表皮的正常生理功能至關重要［7］。諸多小分子激酶抑制劑可以通過影響角質形成細胞的命運來誘導皮膚毒性的發生，例如直接誘導細胞凋亡以及調節細胞的過度分化、遷移和角化不完全等［8-11］?，F代醫學發現，多種天然化合物可以通過調控氧化應激、炎癥反應、免疫失調和DNA損傷等方式改善受損的皮膚［12-13］。如黃芪、瓜蔞、當歸中提取到的活性成分芒柄花素對炎癥性皮膚病具有保護作用［14］；丹參酮ⅡA 抑制中波紫外線照射引起的人表皮形成細胞生長阻滯與DNA 損傷基因的轉錄以及信號通路分子磷酸化，減少紫外線輻照造成的人皮膚角質形成細胞的損傷［15］；黃芪甲苷可以加速創面組織的恢復和血管生成，緩解糖尿病導致的皮膚缺損［16］；甘草素增強抗氧化能力保護長波紫外線誘導的人角質形成細胞氧化損傷［17］；對已經受損的皮膚，天然冰片可以通過誘導表皮細胞的增殖和分化，促進受傷部位皮膚的再生，從而達到修復皮膚屏障的作用［18］?；诖?，文本聚焦于探索吉列替尼誘發皮膚毒性的機制以及天然化合物能否改善吉列替尼皮膚毒性展開研究，以期為臨床解決吉列替尼皮膚毒性尋找一種安全有效的干預策略。

1 材料與方法

1.1 細胞、實驗動物、主要試劑與儀器

人角質形成細胞HaCaT購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。6周齡C57BL/6J雄性小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有小鼠在標準環境條件中飼養，自動光照，每12 h明暗交替，動物自由飲水，自由攝食。動物實驗及相關處理均已通過浙江大學智能創新藥物研究院動物管理委員會審查（DW22072902 和DW202211211521）。

吉列替尼（分子式C29H44N8O3，貨號146621）為大連美侖生物技術有限公司產品；天然化合物庫來源于浙江大學藥學院藥物毒理轉化平臺，詳細化合物見參考文獻［19］；冰片（分子式C10H18O，貨號T00517，主要成分為右旋龍腦）為上海陶素生化科技有限公司產品；（2-羥丙基）-β-環糊精（分子式C63H112O42）為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產品；Ki-67 為美國Proteintech 公司產品；一步法TUNEL 檢測試劑盒（綠色熒光）、青霉素和鏈霉素粉末為上海碧云天生物技術有限公司產品；HE 染色試劑盒為北京索萊寶科技有限公司產品；DMEM 培養液為杭州科易生物技術有限公司產品；胎牛血清為美國Hyclone 公司產品；NAC（分子式C5H9NO3S）為上海麥克林生化科技股份有限公司產品；c-PARP為杭州華安生物技術有限公司產品；β-肌動蛋白為杭州戴格生物技術有限公司產品；Western Lightning ECL 化學發光底物試劑盒為珀金埃爾默股份有限公司產品；PI/Annexin V 雙染凋亡試劑盒為杭州聯科生物技術有限公司產品；生物胞素Alexa FluorTM488為賽默飛世爾科技公司產品。蛋白免疫印跡裝置為美國Bio-Rad 公司產品；倒置顯微鏡為日本Olympus公司產品；低速離心機為德國Eppendorf 公司產品；酶標儀購自帝肯（上海）實驗器材有限公司；流式細胞儀為美國Beckman Coulter 公司產品；掃片機為寧波舜宇儀器有限公司產品。

1.2 實驗思路

首先采用快速毒性模型造模方式在體內造模，通過組織病理學檢測手段分析吉列替尼所致皮膚毒性的機制。再通過人角質形成細胞采用蛋白質印跡法、流式細胞術結合PI/Annexin Ⅴ雙染法、流式細胞術結合DCFH-DA 染色法、免疫熒光技術等技術觀察吉列替尼所致皮膚毒性的機制。最后通過人角質形成細胞存活實驗篩選出干預吉列替尼皮膚毒性的天然化合物，并進一步在人角質形成細胞和小鼠模型中驗證。

1.3 體內研究

1.3.1 實驗分組及干預 （1）吉列替尼致皮膚損害實驗:取16 只C57BL/6J 雄性小鼠，隨機分為溶媒對照組和吉列替尼模型組，每組8只。參照吉列替尼的臨床推薦劑量（口服120 mg/d），根據Meeh-Rubner方程計算小鼠等效劑量約20 mg·kg-1·d-1，為了縮短吉列替尼皮膚毒性發生所需時間，給予小鼠三倍臨床等效劑量（60 mg·kg-1·d-1）。吉列替尼模型組:將吉列替尼分散于環糊精中，每天灌胃給藥1 次，連續給藥28 d；溶媒對照組:給予不含吉列替尼的等量環糊精溶液。各組給藥容量均為5 mL/kg。

（2）天然化合物干預實驗:取36 只C57BL/6J雄性小鼠，隨機分為空白對照組、吉列替尼對照組、冰片對照組和冰片+吉列替尼組，每組9 只。吉列替尼對照組每天1 次灌胃給予60 mg/kg 吉列替尼，連續給藥28 d；冰片對照組每天1次灌胃給予150 mg/kg冰片，連續給藥28 d；冰片+吉列替尼組將吉列替尼和冰片同時分散于環糊精中，灌胃給藥，給藥劑量與吉列替尼對照組或冰片對照組一致，連續給藥28 d；空白對照組每天給予不含吉列替尼和/或冰片的等量環糊精溶液處理。各組給藥容量為5 mL/kg。

給藥周期結束后處死小鼠，對小鼠腹部及腋下皮膚進行觀察拍照后，取小鼠腋下至腹部皮膚組織，放入10%磷酸緩沖福爾馬林溶液（pH=7.4）中，充分固定皮膚組織后，進行組織脫水，石蠟包埋，并用切片機進行組織切片（厚度5 μm）。

1.3.2 HE染色法觀察皮膚組織病理學變化 將石蠟組織切片放置在二甲苯及不同濃度梯度乙醇中去蠟。去蠟的切片置于蘇木素染液中染色2 min 后浸沒于鹽酸乙醇溶液中分化2 s。用自來水沖洗后將石蠟切片浸沒于伊紅溶液中染色1 min，隨后用自來水沖洗。將切片在不同濃度梯度乙醇中脫水后移至二甲苯中，中性樹膠封片。采用掃片機掃描并采集染色結果。最外層不含細胞核的部分為角質層，其內透明部分為透明層，中間富含細胞核且較厚部分為顆粒層和棘層，進一步往內細胞核排列較為緊密的部分是基底層，基底層以內則為真皮層，其中真皮層中還分布有毛囊和皮脂腺等附屬器官。

1.3.3 TUNEL 檢測觀察細胞凋亡 組織切片先脫蠟水化，使用10 mmol/L Tris-鹽酸緩沖液（pH=7.4）將不含DNA 酶的蛋白酶K 的濃度稀釋至20 μg/mL，每片滴加50 μL 至完全覆蓋組織，在37 ℃恒溫下孵育20 min。用PBS 洗三次。每張切 片 按TdT 酶5 μL、熒 光 標 記 液45 μL 配 制TUNEL 檢測工作液。在恒溫37 ℃條件下孵育1 h。棄去TUNEL 檢測液，用PBS 洗三次，棄去PBS，每片滴加15 μL 抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片封片，隨后將玻片平放于通風櫥中風干12 h。熒光顯微鏡拍照采集圖像并保存。與細胞核共定位且呈綠色的部分代表TUNEL 檢測染色陽性區域，表征發生凋亡的細胞。

1.3.4 抗Ki-67 抗體免疫組織化學染色觀察細胞增殖激活情況 組織切片先脫蠟水化后在乙二胺四乙酸中熱修復抗原表位20 min，在室溫下用過氧化物酶阻斷液去除內源性過氧化物酶活性10 min，用10%山羊血清封閉20 min。用Ki-67抗體（按1∶5000 稀釋）4 ℃下孵育過夜，并進行皮膚組織切片。次日，用PBS 洗滌兩次，每次5 min，用HRP 標記的二抗室溫孵育1 h。再次洗滌，用DAB 孵育4 min，洗凈DAB，蘇木精復染8 min，1%鹽酸乙醇分化2 s，流水沖洗至無色。封片后用掃片機掃描染色結果。與細胞核共定位且呈現明顯棕褐色的部分代表Ki-67 陽性區域，表征細胞增殖的激活。

1.4 體外研究

1.4.1 實驗分組及干預 （1）吉列替尼體外造模實驗:將貼壁生長的HaCaT 細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM 培養液中，并將培養器皿放置在37 ℃、5%二氧化碳的細胞培養箱內培養。培養過程中可額外添加1%雙抗（100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素）。吉列替尼模型組分別給予不同濃度吉列替尼（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μmol/L 或0.5、1.0、2.0 μmol/L）；正常對照組則不給予吉列替尼。

（2）NAC 拮抗實驗:將HaCaT 細胞分為空白對照組、吉列替尼對照組、NAC 對照組和NAC 拮抗組。吉列替尼對照組僅給予1 μmol/L 吉列替尼；NAC 對照組僅給予2 mmol/L NAC；NAC 拮抗組同時給予1 μmol/L 吉列替尼和2 mmol/L NAC；空白對照組不給藥處理。

（3）天然化合物篩選實驗:將HaCaT 細胞分為空白對照組、吉列替尼對照組和56 種不同的天然化合物干預組。吉列替尼對照組僅給予1.0 μmol/L 吉列替尼；56 種不同的天然化合物干預組則同時給予1 μmol/L 吉列替尼和這56 種不同天然化合物的相應臨床濃度；空白對照組不給藥處理。

（4）天然化合物干預實驗:將HaCaT 細胞分為空白對照組、吉列替尼對照組、冰片對照組和冰片+吉列替尼組。吉列替尼對照組僅給予1.0 μmol/L吉列替尼；冰片對照組僅給予75 μmol/L冰片；冰片+吉列替尼組同時給予1.0 μmol/L 吉列替尼和75 μmol/L冰片；空白對照組不給藥處理。

1.4.2 SRB 染色法檢測細胞存活情況 SRB 染色法具體操作步驟參考文獻［20］。將HaCaT 細胞以4000 個/孔的密度接種于96 孔板中，并確保試驗期間的細胞處于對數生長期。37 ℃恒溫培養箱放置24 h 后，細胞按照吉列替尼體外造模實驗和天然化合物篩選實驗分別處理，藥物作用一定時間后，棄去培養液，每孔加入10%三氯乙酸，在4 ℃固定1 h。棄去三氯乙酸，并用蒸餾水洗滌5 次，放于60 ℃烘箱中干燥。烘干后，96 孔板中每孔加入4 mg/mL的SRB溶液70 μL，室溫靜置染色20 min，棄去SRB 溶液，并用濃度為1%冰醋酸溶液反復沖洗，再置于60 ℃烘箱中烘干。烘干后每孔加入70 μL 10 mmol/L Tris-base 溶液溶解，將96 孔板置于搖床上振蕩20 min 使結合細胞的染料充分溶解，進行脫色。用酶標儀在515 nm 波長下測定每孔的吸光度值。吉列替尼體外造模實驗按下式計算:給藥處理后細胞存活率（%）=給藥處理組平均吸光度值/正常對照組平均吸光度值×100%；天然化合物篩選實驗按下式計算:干預效率=不同天然化合物干預組平均吸光度值/吉列替尼對照組平均吸光度值。

1.4.3 流式細胞術（PI/Annexin Ⅴ雙染法）檢測細胞死亡方式 將HaCaT細胞以2×105個/孔的密度接種于六孔板中。37 ℃、5%二氧化碳下孵育24 h 后，分別按照吉列替尼體外造模實驗和天然化合物干預實驗處理。藥物作用24 h 后，通過胰蛋白酶消化收集細胞至EP 管。細胞用PBS 潤洗細胞兩次，400×g離心4 min 后，加入300 μL 1×結合緩沖液重懸。在各EP管中加入5 μL Annexin V和10 μL PI，室溫下避光孵育。孵育15 min后，將細胞用濾膜過濾至潔凈流式管中。最后，用流式細胞儀對濾過后的細胞進行分析。

1.4.4 蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白c-PARP的表達 將HaCaT 細胞以2×105個/孔的密度接種于六孔板中。5%二氧化碳培養箱37 ℃孵育24 h 后，分別按照吉列替尼體外造模實驗、NAC拮抗實驗以及天然化合物干預實驗進行處理。藥物作用24 h 后用裂解緩沖液（0.3% NP-40、0.3% TritonX-100、0.25% Leupeptin、0.1% PMSF和0.1% NaVO3）從細胞中制備蛋白裂解物，并加入適量1×上樣緩沖液制備為蛋白樣本，加熱95 ℃。蛋白樣本分別用8%、10%、12% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，每個樣品總蛋白為20 μg，并將凝膠整體轉移到聚偏二氟乙烯膜。然后將剪切的膜封閉1 h 后，與相應的一抗、二抗孵育。電泳檢測c-PARP 和β-肌動蛋白。使用ECL 化學發光底物試劑進行可視化處理，使用Image J軟件進行灰度分析。以β-肌動蛋白為內參蛋白，檢測c-PARP蛋白的相對表達量并進行歸一化處理。

1.4.5 流式細胞術（DCFH-DA染色法）檢測活性氧水平 將HaCaT細胞以2×105個/孔的密度接種于六孔板中。5%二氧化碳培養箱37 ℃孵育24 h后，分別按照吉列替尼體外造模實驗、NAC 拮抗實驗以及天然化合物干預實驗處理。藥物作用24 h后，通過胰蛋白酶消化收集細胞至EP管。細胞用無血清DMEM 培養液潤洗細胞兩次，100×g離心4 min 后，加入1 mL 無血清DMEM 培養液。按照1∶1000 加入DCFH-DA 探針，37 ℃下避光孵育20 min。100×g離心4 min 后，無血清DMEM 培養液潤洗細胞兩次，加入150 μL無血清DMEM培養液重懸，將細胞用濾膜過濾至潔凈流式管中。采用流式細胞儀對濾過后的細胞進行分析，通過歸一化處理得到DCFH-DA相對熒光強度。

1.4.6 抗γ-H2AX 抗體免疫熒光觀察細胞DNA損傷情況 將HaCaT 細胞以4000 個/孔的密度接種于96孔板中，確保試驗期間的細胞處于對數生長期。37 ℃恒溫培養箱放置24 h后，分別按照吉列替尼體外造模實驗和天然化合物干預實驗處理，藥物作用時間為24 h。棄去培養基并用新制備的4%多聚甲醛溶液在室溫下固定20 min。用含0.1%Triton X-100的PBS溶液在4 ℃下透化細胞10 min。用PBS洗滌兩次，每次5 min。用含4%牛血清白蛋白的PBS 溶液封閉30 min，PBS 洗滌兩次，每次5 min。配置一抗γ-H2AX（按1∶200稀釋）在4 ℃下孵育過夜。PBS 洗滌后，將細胞與Alexa Fluor 488標記的二抗孵育1 h，PBS洗滌兩次，每次5 min，DAPI 染色5 min，置于熒光顯微鏡下觀察。與細胞核共定位且呈現綠色的部分代表免疫熒光陽性區域，表征發生DNA損傷的細胞。

1.5 統計學方法

采用Prism 軟件進行統計分析。每個實驗數據用三個樣本進行重復分析，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示。若組別數為兩組，組間顯著性差異采用Student’st檢驗進行分析；若組別數超過兩組，其組間的顯著性差異采用方差單向分析以及后續的Dunnett T3檢驗方法進行分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 吉列替尼可誘導小鼠皮膚病理性改變

相比溶媒對照組，吉列替尼模型組大體觀察出現不同程度的皮疹，表現為腹部、腋下等皮膚干燥、脫屑、毛發稀疏，表明造模成功，見圖1。吉列替尼模型組皮膚的表皮部分顯著增厚，角化不全導致角質層不連續且疏松分層，棘層和顆粒層角質形成細胞凋亡，基底層角質形成細胞過度增殖，毛囊增大，皮脂腺增生，見圖2。TUNEL檢測結果顯示，吉列替尼模型組可以明顯觀察到棘層和顆粒層角質形成細胞的細胞核綠色熒光強度顯著增強，見圖3。吉列替尼模型組平均陽性細胞數（33.33±7.41）多于溶媒對照組（4.33±0.47），表明細胞DNA發生了斷裂，即發生細胞凋亡。免疫組織化學檢測結果顯示，增殖標志物Ki-67在吉列替尼模型組中表達明顯增多，見圖4，陽性區域主要分布在基底層角質形成細胞，表明吉列替尼可促進基底層角質形成細胞的過度增殖。上述結果提示，皮膚角質形成細胞的過度增殖可能與吉列替尼早期引起部分角質形成細胞的凋亡相關。

圖1 吉列替尼模型組與溶媒對照組小鼠皮膚大體觀Figure 1 Skin appearance of the mice in gilteritinib group and the control group

圖2 吉列替尼模型組與溶媒對照組皮膚組織病理學表現（HE染色）Figure 2 The histopathological changes in skin from mice in gilteritinib group and the control group （HE staining）

圖3 吉列替尼模型組與溶媒對照組皮膚組織細胞凋亡情況（TUNEL檢測）Figure 3 Apoptosis of the skin tissue cells from mice in gilteritinib group and the control group（TUNEL assay）

圖4 吉列替尼模型組與溶媒對照組皮膚組織Ki-67表達（免疫組織化學染色）Figure 4 Ki-67 expression in the skin from mice in gilteritinib group and the control group（immunohistochemical staining）

2.2 吉列替尼體外可誘導角質形成細胞死亡和形態變化

SRB 染色法結果顯示，不同濃度的吉列替尼分別作用于角質形成細胞24 和48 h 后，隨著濃度不斷升高，作用時間延長，細胞存活率逐漸下降，見圖5?？紤]到吉列替尼的最大血藥濃度為0.56 μmol/L，選取三個濃度梯度（0.5、1.0、2.0 μmol/L）進行后續研究。

圖5 不同濃度吉列替尼作用后HaCaT細胞存活率Figure 5 The survival rates of HaCaT cells after treated with different concentrations of gilteritinib

光學顯微鏡下觀察發現，在不同濃度吉列替尼作用24 h 后，相比正常對照組，吉列替尼模型組貼壁細胞數明顯下降，且隨著吉列替尼濃度升高，角質形成細胞數逐漸減少。同時，細胞出現變圓和皺縮等細胞凋亡形態特征，見圖6。提示吉列替尼會誘導角質形成細胞死亡和形態變化。

圖6 不同濃度吉列替尼作用后HaCaT細胞在顯微鏡下所見Figure 6 Observation of HaCaT cells treated with different concentration of gilteritinib under microscope

2.3 吉列替尼體外可誘導角質形成細胞凋亡

不同濃度吉列替尼作用下凋亡角質形成細胞數逐漸增多，見圖7和表1。

表1 吉列替尼模型組與正常對照組細胞凋亡相關指標比較Table 1 Comparison of apoptosis related indicators between gilteritinib groups and the control group（±s，n=3）

表1 吉列替尼模型組與正常對照組細胞凋亡相關指標比較Table 1 Comparison of apoptosis related indicators between gilteritinib groups and the control group（±s，n=3）

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.c-PARP:切割型多腺苷二磷酸核糖聚合酶；γ-H2AX:磷酸化組蛋白H2AX.

組 別正常對照組吉列替尼模型組0.5 μmol/L 1.0 μmol/L 2.0 μmol/L凋亡率（%）3.82±2.23 c-PARP蛋白相對水平1.00 γ-H2AX陽性細胞數2.67±1.25 8.67±2.05 16.33±1.70**26.33±3.68**9.57±5.15 17.09±4.56*24.74±3.92**2.47±0.62 4.90±2.88*5.05±1.19**

圖7 吉列替尼模型組與正常對照組流式細胞檢測結果Figure 7 Flow cytometry results of the gilteritinib groups and the control group

蛋白質印跡法結果顯示，角質形成細胞在不同濃度吉列替尼作用24 h 后，凋亡標志蛋白c-PARP蛋白表達水平隨藥物濃度的升高而上調，見圖8和表1。免疫熒光結果顯示，代表DNA雙鏈斷裂發生的標志物γ-H2AX 的水平在吉列替尼作用后顯著上調，見圖9和表1。上述結果提示，吉列替尼可誘導角質形成細胞發生凋亡。

圖8 吉列替尼模型組與正常對照組角質形成細胞中c-PARP蛋白電泳圖Figure 8 Western blotting results of c-PARP expression in HaCaT cells in gilteritinib groups and control group

圖9 吉列替尼模型組與正常對照組γ-H2AX表達（免疫熒光染色）Figure 9 Expression of γ-H2AX in gilteritinib groups and the control group（immunofluorescence staining）

2.4 吉列替尼通過誘導活性氧累積導致角質形成細胞凋亡

流式細胞術檢測結果顯示，不同濃度吉列替尼作用后，細胞內DCFH-DA相對熒光強度上升，并呈劑量依賴性，見圖10A，提示細胞內活性氧發生累積。而NAC拮抗組可以減少吉列替尼作用后引起的細胞內DCFH-DA 相對熒光強度上升，見圖10B，提示NAC可以逆轉細胞內吉列替尼引起的活性氧累積。

圖10 各組DCFH-DA熒光強度比較Figure 10 The relative fluorescence intensity of DCFH-DA in each group

蛋白質印跡法結果顯示，與吉列替尼對照組（3.18±0.44）比較，NAC 拮抗組的c-PARP 表達水平（1.39±0.78）下降（t=0.24，P＜0.05），見圖11。以上結果表明，抗氧化劑NAC 能減輕吉列替尼誘導的角質形成細胞活性氧的過度累積和凋亡。

圖11 NAC 拮抗組與各對照組細胞中c-PARP 蛋白電泳圖Figure 11 Western blotting results of the c-PARP protein expression in NAC antagonist group and the control groups

2.5 天然化合物冰片能拮抗吉列替尼導致的角質形成細胞死亡

SRB 染色法結果顯示，在天然化合物庫的56種藥物中，除了一種化合物使吉列替尼對照組的細胞存活率進一步下降，其余55 種藥物皆能導致吉列替尼對照組的細胞存活率不同程度上調，其中冰片上調細胞存活率的效率最高（2.05），見圖12。

圖12 56 種天然化合物對吉列替尼模型組細胞存活率的干預效率Figure 12 Interventional efficiency of 56 natural compounds on cell survival rate of the gilteritinib group

2.6 冰片可逆轉吉列替尼引起的角質形成細胞死亡和形態變化

光學顯微鏡下，與吉列替尼對照組比較，冰片+吉列替尼組細胞數明顯增多，變圓和皺縮的細胞數明顯減少（圖13），提示冰片可以逆轉吉列替尼引起的角質形成細胞死亡和形態變化。

圖13 冰片+吉列替尼組與各對照組顯微鏡下圖像Figure 13 Microscopic images of the borneol+gilteritinib group and the control groups

2.7 冰片可逆轉吉列替尼引起的角質形成細胞角質形成凋亡

流式細胞術檢測結果顯示，與吉列替尼對照組比較，冰片+吉列替尼組角質形成細胞凋亡率由（20.36±1.21）%降低至（14.29±3.12）%（t=0.16，P＜0.05），見圖14 和表2。蛋白質印跡法檢測結果顯示，與吉列替尼對照組比較，冰片+吉列替尼組角質形成細胞c-PARP 表達水平下降，見圖15和表2。免疫熒光檢測結果顯示，與吉列替尼對照組比較，冰片+吉列替尼組角質形成細胞中γ-H2AX 的表達顯著下調，見圖16和表2。結果表明，冰片可減少吉列替尼誘導的角質形成細胞凋亡。

表2 冰片+吉列替尼組與各對照組細胞凋亡相關指標比較Table 2 Comparison of apoptosis related indicators between borneol+gilteritinib group and the control groups（± s，n=3）

表2 冰片+吉列替尼組與各對照組細胞凋亡相關指標比較Table 2 Comparison of apoptosis related indicators between borneol+gilteritinib group and the control groups（± s，n=3）

組 別空白對照組吉列替尼對照組冰片對照組冰片+吉列替尼組凋亡率（%）3.84±1.68 20.36±1.21*3.00±1.15 14.29±3.12#c-PARP蛋白相對水平1.00 2.83±0.84**0.71±0.07 1.64±0.15#γ-H2AX陽性細胞數1.33±1.25 18.67±2.87**1.00±0.82 2.33±1.70##

圖15 冰片+吉列替尼組與各對照組c-PARP 蛋白表達電泳圖Figure 15 Western blotting results of c-PARP protein expression in the borneol+gilteritinib group and the control groups

圖16 冰片+吉列替尼組與各對照組γ-H2AX表達（免疫熒光染色）Figure 16 Expression of γ-H2AX in the borneol+gilteritinib group and the control groups （immunofluorescence staining）

2.8 冰片可減少吉列替尼誘導的角質形成細胞活性氧過度累積

流式細胞術檢測結果顯示，與吉列替尼對照組比較，冰片+吉列替尼組角質形成細胞DCFH-DA 相對熒光強度由（1.91±0.19）下降至（1.36±0.37），差異有統計學意義（t=0.17，P＜0.01），提示細胞內活性氧水平下降。

2.9 冰片可緩解吉列替尼誘導的小鼠皮膚病理性改變

HE 染色結果顯示，相比吉列替尼對照組，冰片+吉列替尼組皮膚表皮層厚度恢復正常，毛囊增大、皮脂腺增生等變化也得到顯著改善，見圖17。結果提示，冰片可緩解吉列替尼誘導的小鼠皮膚病理性改變。

圖17 冰片+吉列替尼組與各對照組皮膚組織病理學表現（HE染色）Figure 17 The histopathological changes in skin from mice in the borneol+gilteritinib group and the control groups（HE staining）

2.10 冰片可緩解吉列替尼誘導的小鼠皮膚細胞凋亡

TUNEL 檢測結果顯示，與吉列替尼對照組比較，冰片+吉列替尼組皮膚角質形成細胞的綠色熒光顯著降低，兩組平均陽性細胞數分別為（27.00±2.45）和（12.33±3.40），差異有統計學意義（t=0.28，P＜0.01）。DAPI染色結果顯示，在吉列替尼作用后小鼠皮膚角質形成細胞DNA 片段和核固縮增加，而冰片+吉列替尼組皮膚角質形成細胞的細胞核形態恢復正常，見圖18。以上結果表明，冰片能夠在體內水平顯著抑制吉列替尼誘導的皮膚角質形成細胞凋亡。

圖18 冰片+吉列替尼組與各對照組皮膚組織細胞凋亡情況（TUNEL檢測）Figure 18 Apoptosis of the skin tissue cells from mice in the borneol+gilteritinib group and the control groups （TUNEL assay）

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與吉列替尼對照組比較，#P＜0.05.c-PARP:切割型多腺苷二磷酸核糖聚合酶；γ-H2AX:磷酸化組蛋白H2AX.

3 討 論

在接受TKI 治療的患者中，皮疹、毛發和指甲變化、黏膜炎、光敏性等皮膚毒性發生率很高［21-22］。目前，相較于其他臟器的毒性，臨床上對皮膚毒性關注度不高。然而，皮膚作為人體最大的器官，是人體防御外界刺激的第一道屏障，具有調節體溫、代謝、呼吸等多種生理功能［23］。藥物性皮膚毒性的發生會極大地改變外表，給患者帶來身心困擾，降低生活質量。嚴重的藥物性皮膚毒性不僅會影響治療效果，甚至會導致死亡［24］。吉列替尼是一種多靶點激酶抑制劑，應用于FLT3突變的復發性或難治性（藥物難治）急性髓性白血病成人患者的一線治療，但在其治療期間約36%的患者出現了皮膚毒性［3］，吉列替尼皮膚毒性機制不明以及干預策略的缺乏極大限制了其臨床應用。因此，研究吉列替尼引起皮膚毒性的機制并制訂相應的干預策略至關重要。但在目前藥物的皮膚毒性研究中，會存在實驗造模表型與臨床毒性表型不一致的問題，導致結果的可靠性與可復制性較低［25-26］。

如何構建能夠較好模擬藥物臨床毒性的模型對于后續毒性機制和干預策略的研究起著決定性的作用。本研究中，C57BL/6J 雄性小鼠連續28 d 灌胃給予吉列替尼（60 mg·kg-1·d-1，臨床血藥濃度的三倍）后，身上出現了皮疹，其表型主要為脫屑、結痂、局部區域毛發稀疏、皮膚干燥等，對病變部位皮膚病理學分析的結果也證明表皮部分明顯增厚、毛囊增大、皮脂腺增生，皮疹現象與臨床研究結果一致，表明該模型用作后續吉列替尼毒性研究有較強的可靠性。值得注意的是，個別小鼠在給藥后不會出現皮疹或皮疹程度較輕，這可能是不同個體對藥物的毒性耐受程度不同所致，且臨床數據也說明皮膚毒性的發生存在一定的概率，提示本研究采用的造模方式較為可靠。

進一步組織病理學分析發現，表皮部分顯著增厚，角化不全，推測角化不全是由于棘層和顆粒層角質形成細胞凋亡引起，而這部分角質形成細胞的凋亡又會代償性地激活基底層角質形成細胞的過度增殖，從而引起皮疹部位表皮的顯著增厚。已有文獻報道Ki-67 指數與凋亡體指數呈正相關［27］，這也驗證了基底層角質形成細胞的增殖可能是皮膚角化不全的一種代償機制?？紤]到角質形成細胞的凋亡可能是吉列替尼皮膚毒性的起始因素，而在體內直接開展毒性機制的研究具有一定的困難，因而本研究以HaCaT 細胞作為體外研究模型，深入考察驗證吉列替尼皮膚毒性發生的機制。結果顯示，吉列替尼可以顯著誘導活性氧過度累積，而活性氧可以改變細胞內各種信號傳導分子和蛋白質的活性，從而影響細胞凋亡相關的信號傳導網絡［28］，通過聯用抗氧化劑NAC 可以顯著逆轉細胞凋亡，從而證明了吉列替尼通過上調活性氧誘導細胞凋亡。

近年來，有研究發現天然化合物具有防治TKI所致皮膚毒性的作用［10］。本研究在體外模型中對天然化合物庫進行篩選發現，冰片可以顯著逆轉吉列替尼引起的角質形成細胞死亡，表明其干預吉列替尼皮膚毒性的潛力。冰片是一種提取自樟科植物龍腦樟枝葉的天然產物，在中醫藥治療中常作為佐使藥，以加強主藥的藥效或減弱主藥毒性，進而起到相輔相成、相得益彰的功效［29］。本文資料顯示，冰片能改善吉列替尼誘導的角質形成細胞活性氧過度累積和凋亡，且其本身對角質形成細胞沒有殺傷作用。為了驗證冰片在臨床上應用的可能性，本研究采用小鼠體內模型驗證了冰片對吉列替尼皮膚毒性的干預作用，結果表明冰片與吉列替尼的合用可以有效地抑制吉列替尼引起的皮疹，改善表皮增厚、角質形成細胞凋亡等毒性表型。此外，僅給予冰片的小鼠未產生明顯的毒性癥狀，證明了冰片臨床應用的安全性。

綜上所述，吉列替尼可通過引起細胞內活性氧累積誘導角質形成細胞凋亡，致使皮膚毒性發生，而冰片可以通過減少活性氧累積和皮膚角質形成細胞凋亡，改善吉列替尼皮膚毒性。雖然上述研究結果已在動物體內進行了驗證，但受限于目前臨床研究對吉列替尼所致皮疹的具體特征未展開詳細描述，因此不能確定動物模型上發生的皮疹表型與臨床完全一致，仍須后續進一步考察吉列替尼皮膚毒性的臨床表型。同時，考慮到其他TKI 如EGFR 抑制劑等在應用期間會出現丘疹、瘙癢、干燥等癥狀，而這與吉列替尼誘發的皮膚毒性又具有一定的相似性，因而冰片是否也能對EGFR 抑制劑的皮膚毒性發揮干預作用需要后續進一步探究。此外，雖然目前對吉列替尼的案例報道和臨床研究均未發現性別與其皮疹發生率之間的明顯相關性。但一些研究表明藥物性皮疹存在性別差異，如在一項針對藥物性皮疹的研究中，發現女性患者在使用某些藥物后更容易出現嚴重的藥疹［30］。此外，性別差異可能還受到其他因素的干擾，如特定藥物的性別偏好和基因差異表達等［31］。因此雌性小鼠該機制能否適用，冰片能否起效也值得更深入研究。

志謝 研究得到國家自然科學基金（82204516）支持

Acknowledgements This paper was supported by the National Natural Science Foundation of China (82204516)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of Interests The authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)