降濁合劑通過調節TLR4/IκBα/NF-κB信號通路影響肥胖大鼠糖脂代謝

蘇 瓊，江丹娜，鐘 釗，周 開，龔文波

1.浙江中醫藥大學附屬寧波中醫院內分泌科，浙江 寧波 315010

2.浙江中醫藥大學附屬寧波中醫院心內科，浙江 寧波 315010

3.浙江中醫藥大學附屬寧波中醫院風濕科，浙江 寧波 315010

肥胖是指體內脂肪堆積過剩造成體重過度增長，可能導致胰島素抵抗、糖尿病、心血管疾病和某些癌癥的發生，是影響健康的第五大危險因素［1-3］。目前，肥胖癥的治療及相關并發癥的預防缺乏有效的方法，迫切需要開發新的、更安全、更有效的治療肥胖的藥物。

隨著中醫藥研究的不斷深入，中藥制劑在改善肥胖、調節肝臟脂肪代謝方面的優勢日益突出。如在自發型肥胖型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病中，中藥材辣木葉醇的提取物可通過調節生化指標改善大鼠肥胖和肝臟質量［4］；中藥湯劑溫膽湯可改善胰島素抵抗肥胖大鼠的糖脂代謝并抑制炎癥因子水平，還可通過調節關鍵轉錄因子改善肥胖大鼠的臨床癥狀［5-6］。降濁合劑是由浙江中醫藥大學附屬寧波市中醫院主任中醫師王暉根據多年臨床用藥經驗創立的中藥復方，具有補氣升清降濁的作用，可有效改善患者的糖脂代謝及腸道菌群紊亂狀態，在治療氣虛痰濁型糖耐量異常疾病和氣虛痰濁型2型糖尿病中具有較好的療效［7-9］。此外，降濁合劑還可影響谷氨酸鈉肥胖大鼠糖脂代謝，降低谷氨酸鈉肥胖大鼠的膽固醇、游離脂肪酸、血胰島素水平［10］。肥胖可以導致胰島素抵抗，而胰島素抵抗與糖脂代謝關系密切。研究發現，電針通過抑制TLR4/IκBα/NF-κB通路可以改善肥胖胰島素抵抗大鼠的胰島素敏感性［11］。為此，在前期研究基礎上，本研究進一步探究降濁合劑對肥胖大鼠糖脂代謝的影響，以及這種影響與TLR4/IκBα/NF-κB 通路的相關性，以期探索降濁合劑治療肥胖癥的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、試劑及儀器

30 只清潔級雄性SD 大鼠，體重（120±10）g，由浙江省實驗動物中心提供［生產許可證號:SYXK（浙）2016-0022］，飼養于浙江省中醫藥研究院實驗動物中心，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，12 h晝夜節律飼養，實驗動物使用許可證號:SYXK（浙）2019-0010。普通飼料為實驗動物標準飼料，由浙江省中醫藥研究院實驗動物中心提供。動物實驗研究方案通過浙江百越生物技術有限公司倫理委員會審查（ZJBYLA-IACUC-20200302）。

降濁合劑組方含生黃芪30 g、丹參30 g、生蒼術15 g、生薏苡仁30 g、生麥芽30 g、生扁豆30 g、絞股藍30 g、生雞內金15 g、生葛根30 g、生山楂30 g、荷葉15 g，濃縮至生藥濃度5 g/mL，由浙江中醫藥大學附屬寧波市中醫院提供。

TRIzol（批號119704）為美國Ambion 公司產品；異丙醇（批號2015122801）為成都市科龍化工試劑廠產品；三氯甲烷（批號20180109）為杭州高晶精細化工有限公司產品；無水乙醇（批號2018051801）為成都市科隆化學品有限公司產品；逆轉錄試劑盒（批號AK22355A）、熒光定量PCR 試劑盒（批號AK31128A）為日本TaKaRa 公司產品；PRDM16、UCP1 引物為生工生物工程（上海）股份有限公司產品；PRDM16 兔多克隆抗體（批號16k7094）為美國Affinity 公司產品；GAPDH兔多克隆抗體（批號P1020）為杭州戴格生物技術有限公司產品；UCP1 抗體兔多克隆抗體（批號00084987）為美國Proteintech 公司產品；全蛋白提取試劑盒（批號KGP2100）為江蘇凱基生物技術股份有限公司產品；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號080719191118）、SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（批號P0012A）和TBST（批號ST673）為上海碧云天生物技術有限公司產品；全自動蛋白定量分析試劑盒（12-230ku）（批號34360）為美國Protein Simple 公司產品。

離心機（Centrifuge 5810R）為德國Eppendorf公司產品；全自動生化分析儀（AU5831）為美國Beckman 公司產品；StepOnePlus 實時熒光定量PCR 儀為美國Applied Biosystems 公司產品；正置熒光顯微鏡（ECLIPSE 80i）為日本Nikon 公司產品；WES 全自動蛋白定量分析儀為美國Protein Simple公司產品；組織脫水機（TP1020-1）、石蠟包埋機（EG1150）、石蠟切片機（RM2235）為德國Leica 公司產品；增強化學發光試劑（4AW011-200）為北京四正柏生物科技有限公司產品；偏氟乙烯膜（IPSN07852）為美國Millipore公司產品。

1.2 肥胖大鼠模型的建立及分組處理

30 只大鼠被隨機分為正常對照組、模型對照組和降濁合劑組，每組各10只。其中正常對照組大鼠給予足量普通飼料10 mL/kg 灌胃，自由飲食飲水，共8周；模型對照組大鼠給予足量高脂飼料（食用化豬油15.0%、蔗糖20.0%、膽固醇1.2%、膽鹽0.2%、普通飼料63.6%）10 mL/kg 灌胃，自由飲食飲水，共8周；降濁合劑組大鼠給予足量高脂飼料（同模型對照組）10 mL/kg 加降濁合劑濃縮液50 g/kg灌胃［10］，自由飲食飲水，共8周。然后禁食24 h進行后續實驗。

1.3 生化分析儀檢測血糖、血脂指標水平

采用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）對空腹大鼠進行腹腔注射麻醉，隨后主動脈取血5 mL，3220×g離心后采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血糖、總膽固醇、三酰甘油、LDL-C和HDL-C水平。

1.4 計算脂肪質量系數、Lee’s指數

采用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）對空腹大鼠進行腹腔注射麻醉后，后頸椎脫位處死大鼠，使用小剪刀縱切皮膚暴露腹股溝脂肪，剝離淋巴結，剪下白色脂肪，然后剪開肩胛骨下皮膚看到呈對稱的棕色脂肪，去除表面的白色脂肪后剪下棕色脂肪。分別稱取腹部白色脂肪、肩胛部棕色脂肪組織，計算脂肪質量系數:脂肪質量系數=脂肪質量/體重×100%。根據大鼠體長，計算Lee’s 指數:。完成后，切取不同部位脂肪約1/4置于10% 中性福爾馬林溶液中保存備用。另取不同部位脂肪，液氮速凍后保存于-80 ℃中，用于基因和蛋白表達檢測。

1.5 定量逆轉錄PCR 法檢測脂肪中PRDM16、UCP1的mRNA表達

取上述凍存的白色、棕色脂肪組織80～100 mg，液氮研磨后采用TRIzol 法提取總RNA，按照試劑盒說明進行定量逆轉錄PCR 檢測。逆轉錄反應條件:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。定量PCR 反應條件:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃30 s，40 個循環；熔解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。PRDM16上游引物5'-CAAGGACTGC GAGCGGATGTTC-3'，下游引物5'-TCTGGTGGCG GATGAGGTTGG-3'；UCP1上游引物5'-CAGAGG TGGTGAAGGTCAGAATGC-3'，下游引物5'-GAG TCGTCCCTTTCCACAGTGTTG-3'；內參基因EF-1α上游引物5'-CGAGCCACCATACAGTCAGA-3'，下游引物5'-CCATTCCAACCAGAAATTGG-3'。采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.6 蛋白質印跡法檢測脂肪中PRDM16、TLR4、磷酸化IκBα和NF-κB的蛋白表達

取上述各組大鼠白色、棕色脂肪組織，液氮研磨，用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，按照全自動蛋白定量分析試劑盒的操作說明檢測PRDM16 蛋白表達，在反應板內依次加入蛋白樣品3 μL/孔，抗體稀釋液10 μL/孔，兔抗鼠PRDM16抗體（一抗，1∶20稀釋）10 μL/孔，兔抗鼠GAPDH 抗體（內參，1∶100 稀釋），兔抗鼠β-肌動蛋白抗體（內參，1∶100 稀釋）10 μL/孔，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G 抗體（二抗）10 μL/孔，發光液15 μL/孔，清洗緩沖液500 μL/孔，采用全自動蛋白定量分析儀檢測并采用Compass 軟件分析峰面積，蛋白相對表達水平用目標蛋白峰面積/內參蛋白峰面積比值表示。TLR4、磷酸化IκBα 和NF-κB 的蛋白表達檢測具體步驟如下:使用SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質（20 μg），并轉移到聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉進行封閉。分別加入TLR4 抗體（一抗，1∶1000 稀釋）、磷酸化IκBα 抗體（一抗，1∶1000稀釋）、NF-κB-p65抗體（一抗，1∶1000 稀釋）和β-肌動蛋白抗體（內參，1∶1000 稀釋）在4 ℃下孵育過夜反應，用0.1 mol/L TBST 沖洗三次。再用辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G抗體（二抗）在室溫下孵育2 h。最后，使用增強化學發光試劑檢測特異性蛋白信號。使用Image J 軟件對特定蛋白信號的灰度值進行檢測和歸一化。

1.7 免疫組織化學法檢測脂肪組織中UCP1 的蛋白表達

將脂肪組織在10%中性福爾馬林溶液中浸泡3～4 h，固定后分別采用75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯溶液進行脫水，常規浸蠟包埋，按照所需切面用單面刀片將蠟塊切成梯狀，并用蠟鏟將蠟塊底部固定于載蠟器，采用旋轉切片機進行4 μm 連續切片，二甲苯脫蠟，滴加3%的過氧化氫后室溫封閉靜置10 min，滴加酸堿度為6.0 的0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液沖洗，將石蠟切片置于烤箱中微波修復20 min，5% 牛 血 清 白 蛋 白 封 閉1 h，UCP1 一抗（1∶50 稀釋）于4 ℃冰箱孵育，二抗室溫孵育30 min，常規二氨基聯苯胺顯色、蘇木素復染、脫水、封片，采用NIS-Elements D 3.2 圖像分析系統，放大200倍鏡下隨機選取5個視野，通過分析染色強度（棕褐色）來確定陽性區域，計算陽性染色部位的面積占總視野面積的百分比，判定UCP1的表達情況。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。正態分布的計量數據用均數±標準差（±s）描述，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差數法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 降濁合劑對肥胖鼠血糖和血脂指標的影響

與正常對照組比較，模型對照組三酰甘油水平升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，降濁合劑組三酰甘油水平降低（P＜0.05），見表1。結果提示，降濁合劑可以改善肥胖鼠高脂飲食導致的血脂異常。

表1 三組血糖和血脂指標比較Table 1 Blood glucose and blood lipid indexes in the three groups of rats（± s，mmol/L）

表1 三組血糖和血脂指標比較Table 1 Blood glucose and blood lipid indexes in the three groups of rats（± s，mmol/L）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05.LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇.

HDL-C 0.90±0.16 0.80±0.19 0.81±0.18組 別正常對照組模型對照組降濁合劑組n 10 10 10血 糖6.18±0.79 6.78±0.49 6.17±1.07總膽固醇1.41±0.26 1.61±0.33 1.37±0.36三酰甘油0.75±0.22 1.11±0.31*0.73±0.27#LDL-C 0.55±0.06 0.59±0.09 0.57±0.07

2.2 降濁合劑對肥胖鼠脂肪質量的影響

8 周后，與正常對照組比較，模型對照組的白色脂肪質量和白色脂肪系數均增加（均P＜0.05），Lee’s 指數上升（P＜0.01）；與模型對照組比較，降濁合劑組的白色脂肪質量和白色脂肪系數均明顯減少（均P＜0.01），Lee’s 指數下降（P＜0.01），見表2。結果提示，降濁合劑能夠減少肥胖鼠高脂飲食導致的體脂增加。

建立多元供應體系，大力推進煤炭清潔高效利用，著力發展非煤能源，形成煤、氣、油、可再生能源多輪驅動的能源供應體系。

表2 三組體脂系數比較Table 2 Body fat coefficient in the three groups of rats（±s）

表2 三組體脂系數比較Table 2 Body fat coefficient in the three groups of rats（±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，##P＜0.01.

組 別正常對照組模型對照組降濁合劑組Lee’s指數295.69±7.76 305.69±9.07**295.33±5.23##n 10 10 10白色脂肪質量（g）12.55±3.22 16.91±2.84**11.02±2.31##白色脂肪質量系數2.43±0.56 2.97±0.55*2.14±0.45##棕色脂肪質量（g）0.54±0.14 0.53±0.13 0.55±0.05棕色脂肪質量系數0.11±0.03 0.09±0.02 0.11±0.01

2.3 降濁合劑對肥胖鼠脂肪中PRDM16、UCP1的mRNA和蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型對照組白色脂肪和棕色脂肪中PRDM16、UCP1的mRNA 表達均減少（均P＜0.05）；與模型對照組比較，降濁合劑組棕色脂肪中PRDM16的mRNA 表達均增加（P＜0.05），白色脂肪中PRDM16，棕色脂肪和白色脂肪中UCP1 的mRNA 表達也有增加趨勢，但差異無統計學意義（均P＞0.05）。見表3。提示降濁合劑可以提高棕色脂肪和白色脂肪中PRDM16、UCP1的mRNA表達水平。

表3 三組白色和棕色脂肪中PRDM16、UCP1 mRNA表達比較Table 3 Effect of Jiangzhuo mixture on mRNA expression of PRDM16 and UCP1 in white and brown fat of obese rats（± s）

表3 三組白色和棕色脂肪中PRDM16、UCP1 mRNA表達比較Table 3 Effect of Jiangzhuo mixture on mRNA expression of PRDM16 and UCP1 in white and brown fat of obese rats（± s）

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05.PRDM:PR結構域蛋白；UCP:解偶聯蛋白.

組 別正常對照組模型對照組降濁合劑組n PRDM16棕色脂肪1.00±0.11 0.54±0.12**0.82±0.03#UCP1棕色脂肪1.00±0.12 0.67±0.17*0.83±0.08白色脂肪1.00±0.12 0.63±0.15*0.67±0.12 10 10 10白色脂肪1.00±0.11 0.63±0.15*0.79±0.20

白色和棕色脂肪中PRDM16 蛋白表達量模型對照組［（0.15±0.02）和（0.26±0.02）］比正常對照組［（0.25±0.17）和（0.61±0.05）］均減少（均P＜0.01），降濁合劑組［（0.20±0.02）和（0.51±0.03）］比模型對照組均增加（均P＜0.05），見圖1。白色和棕色脂肪中UCP1 蛋白陽性染色部位的面積占總視野面積的百分比模型對照組［（10.84±1.51）%和（51.74±4.03）%］比正常對照組［（15.06±1.97）%和（83.20±6.38）%］均減少（均P＜0.01）；降濁合劑組［（14.72±1.38）%和（76.12±6.23）%］比模型對照組均增加（均P＜0.05），見圖2。提示降濁合劑能夠明顯增加白色脂肪和棕色脂肪中RDM16 蛋白表達量；增加UCP1蛋白陽性面積，減小脂肪細胞。

圖1 三組白色和棕色脂肪組織中PRDM16 蛋白表達電泳圖Figure 1 Electrophoresis of PRDM16 protein expression in white and brown adipose tissue of rats in each group

圖2 三組白色和棕色脂肪組織中UCP1 蛋白免疫組織化學染色結果Figure 2 Results of immunohistochemical staining of UCP1 protein in white and brown adipose tissue of rats in each group

2.4 降濁合劑對模型鼠白色脂肪組織TLR4/IκBα/NF-κB信號通路的影響

TLR4、磷酸化IκBα 和NF-κB-p65 蛋白表達模型對照組比正常對照組增加（均P＜0.01），而降濁合劑組比模型對照組減少（均P＜0.05），見圖3、表4。結果提示，降濁合劑可以降低TLR4、磷酸化IκBα 和NF-κB-p65蛋白表達水平，抑制TLR4/IκBα/NF-κB 信號通路。

圖3 三組TLR4、磷酸化IκBα、NF-κB 蛋白表達電泳圖Figure 3 Electrophoresis of TLR4， phosphorylated IκBα and NF-κB proteins in each group

表4 三組TLR4、磷酸化IκBα、NF-κB蛋白表達水平比較Table 4 TLR4， phosphorylated IκBα， NF-κB protein expression in each group（± s）

表4 三組TLR4、磷酸化IκBα、NF-κB蛋白表達水平比較Table 4 TLR4， phosphorylated IκBα， NF-κB protein expression in each group（± s）

與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05.TLR:Toll樣受體；NF-κB:核因子κB；IκBα:NF-κB抑制蛋白α.

NF-κB-p65 1.00±0.12 3.63±0.37**2.88±0.29#組 別正常對照組模型對照組降濁合劑組n 10 10 10 TLR4 1.00±0.09 2.60±0.23**2.15±0.18#磷酸化IκBα 1.00±0.12 3.87±0.35**3.15±0.29#

3 討 論

近年研究發現，黃芪、絞股藍、丹參、生蒼術、山楂、荷葉等中藥材可以增加哺乳動物能量消耗、減少脂肪積累［12-17］。本研究采用以上中藥材制成降濁合劑，探究該組方對肥胖大鼠關鍵轉錄因子的影響。

研究先分析了降濁合劑對肥胖SD 大鼠Lee’s指數和脂肪質量的影響。Lee’s 指數是評價成年大鼠肥胖程度的有效指數［18］。本文資料顯示，降濁合劑可以有效緩解高脂飲食誘導的SD 大鼠Lee’s指數和白色脂肪質量系數升高，說明降濁合劑可以改善SD 大鼠的肥胖。此外，當動物機體受到刺激時，生化指標作為血液成分可隨著疾病的程度發生相應的變化［19］。本文資料顯示，降濁合劑可以緩解高脂飲食導致的大鼠血糖、總膽固醇、三酰甘油、LDL-C 含量升高，可能是因為降濁合劑能增加機體對脂肪的分解和代謝，從而減輕肥胖、降低血脂。因此，本文進一步研究了降濁合劑對肥胖大鼠棕色和白色脂肪含量的影響。

肥胖的特征是棕色和白色脂肪代謝含量失調，通常表現為白色脂肪增多而棕色脂肪細胞減少。目前，對抗肥胖的策略已經從防止脂肪積累轉向通過激活棕色脂肪組織和白色脂肪組織的褐變來促進能量消耗［20］。棕色和白色脂肪細胞都屬于產熱脂肪，且均富含線粒體并表達UCP1［21］。UCP1 可將電子傳遞鏈從能量生產中解耦，導致熱能的釋放。此外，有研究發現了新的棕色脂肪特異性標志物，如PRDM16，已被用于識別棕色脂肪刺激劑［22］。因此，控制UCP1 和PRDM16 的表達對治療肥胖具有重要的臨床意義。研究表明，丹參、蒼術等制成的津力達中藥顆粒在治療高脂飲食的小鼠時可明顯提高其棕色脂肪組織中UCP1 蛋白的表達［23］；黃芪散可通過促進UCP1 和PRDM16 表達緩解2 型糖尿病模型大鼠伴隨的肥胖癥狀［24］。此外，促進UCP1 的表達可以使白色脂肪棕色化，進而增加能量消耗，減輕體重［25］。本文資料顯示，降濁合劑能夠明顯促進白色、棕色脂肪中PRDM16、UCP1 的表達，證實降濁合劑的組方成分在調節肥胖機體轉錄相關因子中具有良好的效力，但其具體作用機制還須進一步研究。

綜上所述，本研究結果證實降濁合劑可以調節與肥胖相關的關鍵信號通路TLR4/IκBα/NF-κB，調節肥胖相關指標的表達以及降低脂肪組織的產生，從而降低肥胖大鼠的體重、體脂，改善肥胖的臨床特征。

志謝 研究得到寧波市科技計劃項目（2019A610359）、寧波市醫療衛生品牌學科建設項目（PPXK2018-07）支持

Acknowledgements The work was supported by the Science and Technology Project of Ningbo City (2019A610359) and Medical and Health Brand Discipline Construction Project of Ningbo City (PPXK2018-07)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of Interests The authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)