慢性子宮內膜炎宮腔菌群與不同妊娠結局的相關性研究

謝毅,陳晴,胡啟彩,魏蔚霞

慢性子宮內膜炎(chronic endometritis,CE) 是子宮內膜持續存在的隱匿性感染性炎癥,多數無特異臨床癥狀,主要與不孕癥、復發性流產及反復種植失敗相關[1]?？股刂委熆商岣哌@類患者的臨床妊娠率及活產率[2-4],但由于宮腔是一個低微生物含量的器官,常規細菌培養很難鑒定CE的病原體。因此,既往觀念認為子宮是無菌的器官,現階段CE的臨床診斷為有創性子宮內膜病理檢查。但隨著二代測序(next-generation sequencing,NGS)的廣泛應用,人們在子宮中檢測出了含量極低的細菌遺傳物質。研究者也發現正常女性宮腔存在一定種類的細菌定植,且在不同生殖系統疾病中細菌的分布特點不同[5-7]。本研究旨在通過16S rRNA測序,篩選CE患者不同妊娠結局宮腔中差異性定植菌,以期為改善CE患者生殖預后提供診斷和治療的新思路。

1 資料來源與研究方法

1.1 資料來源

標本來源于 2019年1月至2020年12月因“IVF-ET失敗、不孕癥及復發性流產”于北京大學深圳醫院生殖外科行宮腔鏡手術,術后病理診斷為CE的29例患者。納入標準:① 不孕癥IVF-ET失敗(≥1次);② 自然流產(≥2次)。排除標準:① 急性感染性疾病、糖尿病、心血管疾病、自身免疫性疾病、甲狀腺疾病及精神類疾病;② 半年內接受過避孕藥或者類固醇激素類藥物治療;③ 近3個月內全身及陰道抗生素用藥史;④ 男方因素導致的不孕。本研究經北京大學深圳醫院醫學倫理委員會審批通過(NO:2019-064),所有入組患者充分知情并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 宮腔灌洗液取樣 手術室靜脈全麻生效后,常規外陰陰道消毒,用一次性無菌窺陰器擴開陰道,為避免陰道及宮頸分泌物對宮腔樣本的污染,采用自主研發的經宮頸套管宮腔取樣器(專利號:ZL 2018 2 1945014.0,見圖1),于宮頸管置入一次性無菌外套管,宮腔取樣導管一端連接10 mL注射器(預注入3 mL無菌生理鹽水),取樣導管自外套管伸入宮腔,注入鹽水,停留1 min,順時針負壓吸引宮腔1周后,取樣導管退回套管內一起取出,向無菌EP管內注入宮腔灌洗液標本。標本置于-80 ℃儲存待測序。

注:1.外套管;2.取樣導管;21.取樣凹槽;22.卡子;3.注射器接口;4.注射器

1.2.2 宮腔沖洗液送至深圳市樂土基因公司進行16S rRNA V4-V5區 PCR擴增及Ion torrent PGM平臺測序。

1.2.3 子宮內膜組織病理檢查 病理組織切片行蘇木精伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色標記具有漿細胞形態學外觀的染色細胞后行免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)染色,檢測漿細胞表面抗原Syndecan-1(CD138),并計數CD138染色的漿細胞數。

1.2.4 CE診斷標準 ≥5個CD138陽性/高倍鏡視野(high-power fields,HPF)[8-9]

1.2.5 CE治療 CE患者于術后月經第1天開始連續口服左氧氟沙星0.5 g qd+甲硝唑0.4 g qd共14 d。

1.2.6 治療后隨訪 隨訪CE患者抗炎治療后1年內的妊娠結局,根據隨訪結果分為妊娠組(gestation,G)和未妊娠組(non gestation,NG)。再回顧性分析G組和NG組16S rRNA數據庫測序結果,比較兩組未經治療前的宮腔菌群定植差異。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

直至2021年8月14日所有患者抗炎治療后隨訪完畢,無隨訪丟失及資料不全患者。29例CE患者抗炎治療后,25例接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET),其中16例成功妊娠,9例未妊娠;4例自然備孕,均為妊娠病例;妊娠組中18例均足月活產,2例發生胚胎停育(分別是孕8+2周、孕9+1周,予以清宮術),臨床妊娠率為68.97%(20/29),活產率為62.07%(18/29)。其中兩組年齡、BMI比較,差異無統計學意義 (P>0.05),詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 CE患者宮腔細菌分布

在門水平上,29例CE患者宮腔內檢測到的菌群由厚壁菌門、變形菌門以及豐度較低的放線菌門、藍藻菌門、擬桿菌門及其他細菌組成。屬水平上,CE患者宮腔內檢測到乳桿菌、丙酸桿菌、葡萄球菌、不動桿菌等細菌定植,見圖2,彩插4。

2.3 兩組宮腔內細菌分布

在門水平上,兩組細菌定植模式不同,G組宮腔內細菌以變形菌門定植為主,而NG組以厚壁菌門為主要定植菌。見圖3,彩插4。

屬水平上,乳桿菌為兩組主要定植菌,但G組乳桿菌定植比例高于NG組(40.13% vs 39.91%),其余各細菌定植比例不同。見圖4,彩插4。

2.4 兩組宮腔內菌群差異比較

屬水平上,NG組不動桿菌中位定植豐度高于G組(142.00 vs 16.50),差異有統計學意義(P<0.05),其余細菌分布比較,差異無統計學意義(P>0.05),詳見表2。

表2 G組與NG宮腔菌群屬水平中位定植豐度比較[M(Q1-Q3)]

3 討論

CE是一種癥狀不典型的宮腔感染性疾病,在NGS開展以前,微生物培養鑒定技術存在培養周期長、病原體檢出率低、污染等局限[4,10]。且子宮是一個低微生物含量的內生殖器官,微生物培養在分析子宮微生物圖譜中面臨巨大挑戰?；诜肿拥奈⑸镨b定技術打破了微生物培養的局限性,為女性生殖道微生物鑒定提供了可能[5,10]。

目前越來越多研究開始關注CE患者宮腔菌群的分布,但是尚無研究重點關注宮腔菌群的分布特點是否會影響其妊娠結局。本研究通過16S rRNA測序分析了29例CE患者的宮腔液標本,回顧性分析CE患者抗炎治療前宮腔菌群的分布特點。結果發現乳桿菌、甲基桿菌-原單胞菌、丙酸桿菌、葡萄球菌、假單胞菌、不動桿菌、普雷沃菌、鏈球菌等細菌定植于這類患者宮腔。結果與本研究團隊既往研究[5]及Wang等[11]研究結果相符,這表明CE患者宮腔內存在多樣性的細菌群落,并非無菌器官或存在單一的細菌定植。

本研究根據不同的妊娠結局,初步探討宮腔細菌群落分布差異對CE患者妊娠結局的影響。結果表明乳桿菌是CE患者宮腔主要定植菌,G組乳桿菌定植比高于NG組患者。Kyono等[12]在一項采用單鞘管取樣器分析不孕癥患者宮腔定植菌對妊娠結局影響的研究中發現乳桿菌優勢定植的患者妊娠結局優于定植比例低的女性,與本研究結果一致。這可能與乳桿菌代謝產生乳酸及過氧化氫抑制、調節宮腔內環境、調控其他非乳桿菌的定植、代謝維持宮腔微生物平衡有關[13-14]。但乳桿菌種水平的分布差異對女性生殖健康的影響有待進一步研究。

此外本研究還發現,NG組宮腔不動桿菌中位定植豐度高于G組患者,表明不動桿菌高豐度定植可能是妊娠的不利因素。盡管其它細菌的定植差異無統計學意義,但G組宮腔細菌定植模式與NG組不同,宮腔細菌的定植紊亂可能改變子宮內膜容受性而影響胚胎著床。但鑒于取樣的有創性,本研究未對患者治療后的宮腔再次取樣分析其菌群分布特點,比較治療前后宮腔菌群的變化。研究更為微創甚至無創的取樣器,比較CE患者治療前后宮腔細菌分布差異及前瞻性隨訪其妊娠結局仍需進一步的臨床研究。

總之,CE患者宮腔存在復雜的微生物細菌群落定植,乳桿菌是其宮腔主要菌群,不動桿菌豐度的升高可能與這類患者的不良妊娠結局相關。針對不動桿菌的規范抗感染治療可能在一定程度上改善CE患者生殖預后。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。