功能化磁性復合納米材料富集磷酸化肽綜合實驗設計

余凌竹 ，魯 建 ，譚言飛

（1.四川大學 生物醫學工程學院，成都 610064；2.四川大學 國家生物醫學材料工程技術研究中心，成都 610064）

目前，我國正處于建設創新型國家的關鍵歷史時期[1]。研究生是科技創新的重要后備力量和生力軍，研究生科研能力的訓練是國家培養具有創新思維和創新能力的科研創新人才的重要途徑，提高研究生教學質量已成為高校深化教育教學改革的核心目標[2]。綜合型實驗教學作為學生實踐能力和科研能力培養過程中的重要環節，在考查學生綜合運用知識的能力以及訓練學生的實驗操作技能等方面發揮著至關重要的作用。然而，傳統實驗教學以按部就班的實驗內容和教師講解為主，實驗教學體系僵化，內容單一，缺乏對實驗過程的探索性、趣味性和實用性，不能充分調動學生的積極性，實驗教學淪為“依葫蘆畫瓢”的機械學習，并不能培養學生獨立思考、探索以及解決實際問題的能力[3]。近年，四川大學以國家“雙創”示范基地建設為契機，啟動了創新創業教育改革行動計劃，通過大學實驗課程教學改革項目的實施，擬建設一批創新性、研究型綜合實驗，旨在縮短學生在所學的專業基礎知識同科研、生產實踐中解決實際問題能力之間的差距，提高學生科研、實踐和創新創業能力，為從事國家需求為導向的科學研究奠定堅實的基礎[4-6]。

研究型綜合實驗是一種以理論講解、實踐指導、實驗探索和綜合能力提升相結合的實驗教學方法，以教師為主導，學生為主體，以培養研究型創新人才為目的的新型的實驗教學模式[7-8]。研究型實驗教學將科研需求導向，科研的思維方法和技能融入實驗教學中，增加實驗項目的探索性和研究性，增加實驗項目實施的意義，激發學生的科研熱情和創新意識，培養學生自行解決問題的能力，滿足學生個性化發展的需求。本學院的生物醫學工程專業作為國家一級重點學科，是一門由化學、材料、高分子、生物醫學和電子傳感技術等學科高度交叉的新工科，具有很強的特殊的專業性要求，而學生通常具有不同的學科背景，在進入研究生階段從事科學研究之前，尚缺乏針對性的研究型綜合實驗，突破學生專業限制，實現多學科知識、實驗技能和科技創新的融合。為此，本文科學設計“功能化磁性復合納米材料富集磷酸化肽”的研究型綜合實驗，通過實驗教學和科學研究探索相結合，提高了學生主動探索的積極性，滿足學生科研自主化，開拓性和創新性的發展要求。

1 功能化磁性復合納米材料富集磷酸化肽綜合實驗的設計依據

蛋白質是組成生命體細胞、組織的重要成分，人體的很多具體功能是通過蛋白質來實現的。大多數的蛋白質在翻譯合成過程中通過各種官能團（如甲基、乙?；?、糖基以及磷酸基等）的共價結合來添加修飾，形成超過300 種的蛋白翻譯后修飾（post-translational modification,PTMs）形式[9]。其中，蛋白磷酸化是一種最常見的蛋白翻譯后修飾的方式，指在蛋白激酶的催化作用下，特定的氨基酸（主要是絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸）上修飾磷酸基團的過程[10]。據估計，在真核細胞中近30%的蛋白質存在磷酸化?？赡娴牡鞍琢姿峄鳛檎{節細胞過程的信號開關，調控著諸如細胞信號轉導、代謝，細胞增長、黏附和遷移等多種生物學行為[11-12]。此外，蛋白磷酸化也是生命系統內功能障礙的指示劑。異常的蛋白磷酸化與心腦血管疾病、帕金森癥、阿茲海默癥、糖尿病以及癌癥等多種疾病的發生和發展密切相關[13-14]。因此，對磷酸化蛋白的鑒定和分析在揭示磷酸化蛋白組學相關的生物學和病理學過程，以及相關疾病的預防和早期診斷等方面具有重要的研究意義，成為現代生物醫學研究的前沿。質譜法由于具有高靈敏度、高檢測通量以及快速的數據處理能力，已成為磷酸化蛋白研究中最常用的檢測方式。利用質譜檢測磷酸化蛋白主要是基于自下而上（bottom-up）的生物質譜分析策略，即對蛋白質混合物酶解后的肽段進行分析，再追溯其相關蛋白質信息。然而，由于磷酸化肽在生物體中含量低（通常為10-9mol/L），在質譜中的離子化效率差以及受到非磷酸化分子對磷酸化肽信號的抑制作用，采用質譜法直接檢測磷酸化肽面臨諸多困難。因此，在質譜檢測之前，對磷酸化肽進行高效和特異性的富集是目前磷酸化蛋白組學研究的前提。

磁性納米粒子具有優異的磁響應性、良好的生物相容性、低毒性以及特殊的靶向性等性質，在核磁共振成像、腫瘤治療、靶向藥物載體、基因治療載體以及生物分離等研究領域具有非常廣闊的應用前景[15]?；诖欧蛛x的磁性納米材料，可以簡化分離過程，減少材料和樣品的損失，極大地增加富集效率和樣品的回收利用，通過對其進一步修飾特異性鍵合磷酸化肽的親和分子而制備的功能化磁性復合納米材料，有望實現對磷酸化肽的快速、高效和特異性的分離和富集，為深入地研究磷酸化蛋白組學提供可能。本文圍繞磷酸化蛋白質組學研究這一前沿性的研究課題，再結合在生物醫學領域具有廣闊應用前景的功能化磁性復合納米材料的制備而設計的研究型綜合性實驗-功能化磁性復合納米材料富集磷酸化肽，囊括了材料、化學、生物醫學等交叉學科領域，旨在開拓學生的科研視野，實現多學科的交叉融合，培養具有創新思維和獨立實踐能力的科研創新人才。

2 功能化磁性復合納米材料富集磷酸化肽綜合實驗的設計

2.1 實驗目的

1）學習羧基修飾的磁性Fe3O4納米材料的制備以及氨基功能化的方法，掌握掃描電鏡、激光粒度儀及熱重分析的原理及操作技能。

2）了解基質輔助激光解析飛行時間質譜分析原理及其在磷酸化肽檢測方面的應用。

3）激發學生聚焦生物醫學研究前沿，融合多門學科和所學知識開展面向需求引導的科學研究。

2.2 實驗原理

2.2.1 功能化磁性復合納米材料制備原理

現有Fe3O4納米材料的制備方法包括共沉淀法、溶膠-凝膠法、高溫分解法、微乳液法、超聲波化學法以及水熱/溶劑熱法等[16]。其中，溶劑熱法是以有機試劑為溶劑，利用高壓反應釜在高溫高壓條件下合成磁性納米材料的方法。以氯化鐵、檸檬酸鈉和醋酸銨為原料，在乙二醇為溶劑的高溫高壓反應下可獲得羧基修飾的磁性Fe3O4納米材料。

乙二胺核的樹狀大分子（polyamidoamine dendrimer,PAMAM）具有良好的空間排布結構、好的化學穩定性以及由分支單元形成的大量空腔，在成像、藥物傳遞、基因治療、催化和納米醫學等領域受到廣泛關注[17]。PAMAM 樹狀大分子表面帶有大量的一級胺和二級胺。通過酰胺反應可以將帶有大量氨基的PAMAM 樹狀大分子固定到羧基修飾的磁性Fe3O4納米材料上，獲得PAMAM 樹狀大分子功能化的磁性復合納米材料。

2.2.2 功能化磁性復合納米材料富集磷酸化肽的原理

基于親和材料富集磷酸化肽的機理可以分為螯合作用、靜電相互作用以及氫鍵?；诓煌淖饔脵C理衍生出固定金屬離子親和色譜法，金屬氧化物親和色譜法和基于氨基的親和色譜法[18]。PAMAM 功能化的磁性復合納米材料表面帶有大量正電荷的氨基（pKa≥9），可以利用氨基與磷酸基團（pKa=1～2）間可逆的氫鍵和靜電相互作用特異性富集磷酸化肽，實現在弱酸性條件下對磷酸化肽的富集，在強酸性條件下釋放，再結合Fe3O4納米材料的磁分離性，實現對磷酸化肽的快速、高效和特異性的分離和富集。

2.2.3 基質輔助激光解析飛行時間質譜鑒定磷酸化肽的原理

基質輔助激光解析（matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI）的基本原理是將分析物分散在基質分子中并形成晶體，用激光照射晶體時，基質分子吸收激光的能量并將其轉移到被酸化的分析物中，由于激光引起的快速加熱，導致基質的解析和分析物的電離及氣化，基質/樣品之間發生電荷轉移使樣品分子電離，結合時間分析質量分析器（time-of-flight mass spectrometry,TOF），獲得肽段的精確質量。將肽段進一步進行二級質譜解析或與文獻比對，確定磷酸化肽段。

2.3 實驗試劑和儀器

2.3.1 實驗試劑

六水合氯化鐵（FeCl3·6H2O）（99%），醋酸銨（NH4Ac）（99%），PAMAM（乙二胺核，3 代）（20 wt%于甲醇中），α-酪蛋白（99%），2,5-二羥基苯甲酸（DHB）（98%），三氟乙酸（TFA）（99%），N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）（98%）購買于Sigma Aldrich 公司。1-羥基苯并三唑（HOBt）（98%）購買于Aladdin 試劑公司。檸檬酸鈉（Na3CT），乙二醇（EG），醋酸（HAc），N,N-二甲基甲酰胺（DMF），乙腈，乙醇，分析純，購買于成都科龍試劑公司。脫脂牛奶購買于本地超市，實驗過程中使用去離子水（RO）。

2.3.2 實驗儀器

激光粒度分析儀（Nano-ZS90，Malvern），掃描電鏡（S-4800，Hitachi），熱重分析儀（STA449C Jupiter，Netzsch），基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（Auto Flex Ⅲ，Bruker），震動樣品磁強計（PPMS，Quantum Design），磁力攪拌/加熱器（RCT basic，IKA），超聲波清洗器（SB-52 DTD，寧波新藝超聲設備公司），數顯搖床（MS 3 digital，IKA），渦旋振蕩器（Genius 3，IKA），烘箱（202-00A，北京中興偉業儀器有限公司）和電子天平（ME104，梅特勒-托利多儀器有限公司）。

2.3.3 其他實驗用品

高溫反應釜，聚四氟乙烯內膽，燒杯，移液槍，磁鐵和EP 管購買于探索平臺。

2.4 實驗內容

2.4.1 功能化磁性復合納米材料的制備

1）采用溶劑熱法制備Fe3O4納米材料

將0.69 g 的FeCl3·6H2O、0.24 g 的Na3CT 和1.98 g 的NH4Ac 加入到包含36 mL 乙二醇的聚四氟乙烯內膽中。將上述分散液于室溫下劇烈攪拌1 h。隨后，將該聚四氟乙烯內膽轉移到高溫反應釜中，放入烘箱在200 ℃下加熱16 h。反應結束后，反復用乙醇和水洗滌產物多次并利用外部磁場進行分離。最后，將制備的Fe3O4納米球重新分散到15 mL 去離子水中備用。

2）采用酰胺反應制備PAMAM 功能化的磁性復合納米材料

將0.25 mL 的Fe3O4懸浮液、135 mg 的EDCI、95 mg 的HOBt 和295 μL 的DIPEA 加入包含0.5 mL的水和6.5 mL 的DMF 的混合溶液中。將上述懸浮液在2 000 r/min 下振蕩1 h 以激活羧基。然后，將150 μL 的PAMAM 加入上述溶液中，繼續振蕩24 h。反應結束后，將得到的功能化磁性復合納米球用DMF 和去離子水洗滌多次并通過外部磁性進行分離。最后，將制備的磁性復合納米球分散在0.5 mL 水中備用，如圖1（a）所示。

圖1 材料合成及富集過程示意圖

2.4.2 功能化磁性復合納米材料的表征

1）激光粒度儀表征（dynamic light scattering,DLS/Zeta 電位）

將少量樣品分散在去離子水中，超聲分散。取1.5 mL 上述分散液于比色皿中，觀測樣品的水合直徑及粒徑分布情況，重復3 次測試；將少量樣品分散在去離子水中，超聲分散。取1 mL 上述分散液于電位池中，考察樣品的表面電位，重復3 次測試。

2）掃描電鏡表征（scanning electron microscopy,SEM）

將單晶硅片置于乙醇溶液中超聲10 min 進行清潔。隨后，取10 mL 的500 μg/mL 的樣品分散液于硅片上，自然干燥后，放入掃描電鏡中，對樣品表面微觀形貌進行觀察。

3）磁性能表征（vibrating sample magnetometer,VSM）

取5～10 mg 粉末樣品裝入一端封口的1 cm 塑料管中。再利用棉花堵住另一端管口，形成密閉的腔室。室溫下，將該塑料管放入磁強計中檢測，獲得樣品的磁化曲線和飽和磁化強度。磁場強度測定范圍為0～16×105A/m。

4）熱重分析（thermogravimetric analysis,TGA）

稱取10 mg 粉末樣品于氧化鋁坩堝中，將其放入熱重分析儀中。在氮氣保護下，以10 K/min的升溫速度將樣品從35 ℃升至900 ℃，最終得到樣品在升溫過程中的重量變化，評估材料表面修飾PAMAM 樹狀大分子的含量。

2.4.3 功能化磁性復合納米材料對磷酸化肽的富集和質譜檢測

1）模型蛋白和生物樣品消解液制備

將1 mg 的α-酪蛋白溶解在1 mL 的NH4HCO3（25 mmol/L，pH=8.3）溶液中，然后與胰蛋白酶以1∶40（w/w）的比例混合后在37 ℃下孵育16 h，獲得α-酪蛋白消解液。將55 μL 的脫脂牛奶溶解到1 mL 的NH4HCO3溶液中，隨后在140 00 r/min下離心20 min，取上清液在100 ℃下煮沸15 min使蛋白質變性，待完全冷卻后，加入60 μg 的胰蛋白酶在37 ℃下消解16 h，獲得脫脂牛奶消解液。最后，將上述制備的消解液放入-20 ℃的冰箱中儲存備用。

2）將α-酪蛋白消解液用富集緩沖液（70%ACN-H2O,0.1 mol/L HAc）稀釋成10-6mol/L 濃度。取100 μg 功能化的磁性復合納米材料加入上述溶液中，在室溫下孵育45 min 達到吸附平衡。利用外部磁場將富集后的材料與溶液分離，移除上清液，并用富集液洗滌（200 μL/次）3 次去除非特異性吸附的肽段。最后，在上述材料中加入20 μL的洗脫液（50% ACN-H2O,2% TFA），劇烈振蕩20 min 將捕獲的磷酸化肽洗脫下來用于質譜測試，如圖1（b）所示。

3）質譜檢測

取1.5 μL 洗脫液與1.5 μL DHB 基質（25 mg/mL,ACN∶H2O∶H3PO4=70∶29∶1，v/v/v）混合后滴加到靶板上，自然干燥后放入質譜儀中進行測試。測試時使用正離子模式，測試范圍從1 000～3 500 Da。將材料富集α-酪蛋白消解液后的洗脫液同富集前的α-酪蛋白消解液質譜圖進行對比，并將鑒定的肽段與α-酪蛋白消解液中標準的磷酸化肽段進行對比，如表1 所示。確定富集磷酸化肽的數量，對材料在模型蛋白中富集磷酸化肽的性能進行評估。

表1 α-酪蛋白和β-酪蛋白消解液中磷酸化肽分子量對照表[19-22]

4）實際生物樣本中磷酸化肽的富集

將100 μg 功能化的磁性復合納米材料加入200 μL 由富集液稀釋的脫脂牛奶消解液中，經上述相同的富集、洗滌和洗脫過程后，將洗脫液用于質譜檢測。脫脂牛奶消解液中的磷酸化肽主要來源于α-酪蛋白和β-酪蛋白，將檢測的肽段分子量與表1 進行對照，確定富集磷酸化肽的數量，將脫脂牛奶消解液富集前和富集后的洗脫液的質譜圖進行對比，評估材料在實際生物樣本中富集磷酸化肽的性能。必要時將該材料應用于真實病人血清和唾液樣本中磷酸化肽的富集，通過質譜分析和數據庫檢索，尋找疾病相關潛在生物標志物，為磷酸化蛋白組學相關生物學過程和病理學過程研究提供可能。

3 結束語

本研究型綜合實驗聚焦生物醫學前沿，融合了材料、化學和生物醫學等多學科理論知識和實驗技能，使學生掌握磁性復合納米材料制備方法及相關表征原理和目的，并根據這種新型磁性復合納米材料建立針對磷酸化肽的快速、高效和特異性的分離和富集方法，結合質譜檢測對目標磷酸化肽段進行鑒定和分析。該實驗以解決現有生物醫學領域難點和熱點問題為出發點，以豐富傳統實驗教學內容，提高學生綜合實驗技能和科研創新能力為目的，鼓勵學生參與科學實驗的設計、實施和改進，滿足了學生科研自主化、開拓性和創新性的發展要求。通過對磁性復合納米材料的進一步改性，該項目可拓展至藥物的靶向遞送、核磁共振成像、腫瘤熱療以及基因治療載體等生物醫學應用。此外，通過探索PAMAM 修飾比例以及緩沖液條件對材料富集性能的影響等開放性研究內容，大大增強了學生對綜合型實驗以及科學研究的興趣，為培養具有創新思維和獨立實踐能力的科研創新人才奠定了堅實的基礎和方向。