杜仲雄花粉總黃酮抗衰老作用

高夢珂,代俊俊,許世偉,李欽

河南大學 藥學院,河南 開封 475000

隨著人體年齡的增長,機體會逐漸發生功能及代謝方面的變化,抗氧化物酶和抗氧化物質合成速度和活力減弱,代謝產物丙二醛增多,體內產生和清除自由基的平衡被打破,造成自由基堆積,衰老加速。如果同時伴有病理性的改變,則稱為衰老。衰老相關疾病如阿爾茲海默癥、帕金森等,嚴重影響到老年人的生存及生活質量。隨著科學技術的進步及生活條件的改善,人們在追求長壽的同時也越來越把目光聚焦在對自身健康的保障上[1-2]。黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物中,是植物的次生代謝產物,具有抗氧化、預防癌癥、調節免疫、預防心血管疾病、抗炎等作用。黃酮類化合物發揮抗氧化作用主要通過減少自由基的產生和清除自由基兩種途徑[3]。

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)為杜仲科杜仲屬植物,是我國特有的名貴滋補藥材,具有補肝腎、強筋骨,安胎的功能?，F代研究表明杜仲主要含有黃酮類、環烯醚萜類、苯丙素類、多糖類、多酚類、木質素類活性成分,具有抗氧化、抗衰老、降血糖、調節血壓、抗菌抗病毒等作用。黃酮類化合物為杜仲的主要活性成分之一,具有抗氧化、消除自由基、抑菌、抗過敏等作用[4-7]。目前對杜仲的研究主要聚焦于杜仲皮、葉、雄花,但對杜仲花粉的研究較少。查閱文獻可知,杜仲雄花粉含有總黃酮、蛋白質、維生素等有效成分,在藥用方面及保健品方面具有較高的利用價值[8]。為了更好地開發利用這一資源,本實驗利用D-半乳糖建立衰老模型,探討杜仲雄花粉總黃酮的抗衰老作用,旨在為杜仲雄花粉的開發利用及作用機制的研究提供一定的參考。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑

杜仲雄花粉,河南芳捷農業發展有限公司。

D-半乳糖,北京索萊寶科技有限公司;維生素C,東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司(5230205);冰醋酸,天津市富宇精細化工有限公司;丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA 法,A003-1-2),SOD試劑盒(A001-1-2),總抗氧化能力(T-AOC)檢測試盒(ABTS法,A015-2-1),總蛋白定量測定試盒(BCA法,A045-4-2),南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物

雄性昆明小鼠,體質量14～16 g,由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供,動物使用許可證編號為SCXK(京)2019-0010.

1.3 儀器與設備

電子天平,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;全波長酶標儀(Powerwave XS),美國ThermoScientific公司;ZS-001Morris 水迷宮,北京眾實迪創科技有限公司;低溫高速離心機,美國Thermo公司。

2 實驗方法

2.1 杜仲雄花粉總黃酮提取物的制備

稱取取杜仲雄花粉200 g加20倍70%乙醇,浸泡1 h;超聲處理40 min后,60 ℃水浴加熱30 min,過濾保留濾液。重復以上操作3次,合并濾液[9]。減壓濃縮至濃度為0.2 g/mL(生藥)作為上樣溶液。采用NKA-9大孔樹脂進行純化,上樣量1 BV,吸附6 h后,用5 BV蒸餾水以2 mL/min沖洗至洗脫液呈無色,然后用6 BV 70%乙醇以2 mL/min速度洗脫,保留洗脫液。減壓濃縮后,采用聚酰胺(100～200目)進行二次純化。采用蒸餾水、25%乙醇、50%乙醇進行梯度洗脫,保留50%乙醇洗脫液?；厥杖軇?所得浸膏即為杜仲雄花粉總黃酮(FEF)提取物。采用紫外分光光度法測得黃酮含量為70.61%。

2.2 小鼠分組

雄性昆明小鼠60只,實驗前適應性飼養1周,隨機分成6組,每組10只,分別為正常組、模型組、杜仲雄花粉總黃酮低劑量組、杜仲雄花粉總黃酮中劑量組、杜仲雄花粉總黃酮高劑量組和陽性藥組。

2.3 小鼠處理

每個供試實驗組除正常組外,其余各組每日1次以D-半乳糖生理鹽水溶液頸背部皮下注射,給藥量400 (mg/kg)/d[10-13],正常組注射等體積的生理鹽水,連續9周。自第5周開始杜仲雄花粉總黃酮低、中、高劑量組分別灌胃給予80、160、320(mg/kg)/d杜仲雄花粉總黃酮提取物(FEF)溶液[14-17],陽性藥組灌胃維生素C 溶液100 (mg/kg)/d,正常組與模型組灌胃等體積的蒸餾水。各組實驗小鼠自由飲食,室溫(20±2)℃?？倢嶒炛芷诠?周。

2.4 Morris 水迷宮實驗

于實驗結束前6 d進行行為學試驗。行為學共分為兩部分:定位航行試驗,空間探索試驗。該實驗期間繼續給藥。

1) 定位航行試驗。將小鼠從測試象限中央面向池壁放入水中,并開始計時,小鼠找到平臺并在平臺上停留5 s記為試驗結束,從小鼠入水到尋找到平臺記為潛伏期。若小鼠60 s內不能尋找到平臺,則將小鼠引導至平臺上并停留15 s,潛伏期記為60 s。平臺位于第一象限,每天依次將小鼠從二、三、四象限放入水中,連續訓練5 d。

在施工中的樁體材料中加入一定量的高黏度剛性樁體，這種方法進行加固施工效果非常好，可以適用的范圍也比較大，且不會受到氣候條件的影響，加固之后就能夠具備較強的承載性能[4]。

2) 空間探索試驗。于行為學試驗的第6天將平臺從第一象限撤去,將小鼠從第四象限放入水中,記錄60 s內小鼠的運動軌跡并進行分析[18]。

2.4 樣品采集及器官處理

末次給藥后禁食12 h,摘眼球取血,在4 ℃環境下靜置,待血清析出后采用離心機3 500 r/min離心15 min,取血清待測。

采血后小鼠頸椎脫臼處死,取出脾臟、腎臟、肝臟、腦和心臟,用生理鹽水清洗干凈。肝臟、心臟、腎、脾稱重,肝臟與腦組織-80 ℃冷凍保存。

2.5 小鼠臟器指數的測定

根據公式分別計算腎臟指數、肝臟指數和脾臟指數。

臟器指數(g/g)=組織質量(g)/小鼠體質量(g)。

2.6 生化指標測定

按照試劑盒說明書上的方法測定MDA 含量、SOD活力、總抗氧化能力。

2.7 數據處理與顯著性分析

采用IBM SPSS Statisticsa 26數據分析軟件進行統計分析,實驗結果用表示,用LSD法進行顯著性分析。

3 結果與分析

3.1 杜仲雄花粉總黃酮提取物對小鼠學習記憶能力的影響

Morris 水迷宮定位航行試驗結果如圖1～圖4所示。

圖1 定位航行試驗中小鼠潛伏期

圖2 第5天潛伏期

圖3 空間探索實驗中小鼠小鼠游泳軌跡圖

圖4 小鼠穿越原平臺次數(次)

分析各組小鼠水迷宮實驗數據可以發現,在定位航行試驗中隨著訓練天數的增加,各組小鼠找到平臺的時間均逐漸縮短,其中FEF低劑量組下降幅度最大,為69.14%,模型組最小,下降幅度為40.98%;分析第5天潛伏期數據可以發現,模型組小鼠潛伏期顯著大于正常組(P＜0.001),表明模型組小鼠的空間學習記憶能力嚴重衰退。與模型組相比,陽性藥組及杜仲雄花粉總黃酮低劑量組小鼠潛伏期顯著縮短(P＜0.01),說明維生素C和杜仲雄花粉總黃酮可以改善D-半乳糖導致的學習記憶能力的衰退。

定位航行試驗結束后,于次日進行空間探索試驗,分析各組小鼠的游泳軌跡、原平臺位置穿越次數,考察各組小鼠對原平臺位置的記憶能力。

從運動路徑可以看出,除模型組外其余各組入水后,經過一段時間的搜尋均能到達原平臺所在位置,且多在平臺所在象限區域活動,而模型組入水后,多沿池壁運動,不能準確到達原平臺位置。通過對穿越原平臺次數的分析,可以看出正常組與模型組有極顯著性差異(P＜0.001),說明模型組小鼠的記憶能力嚴重下降,D-半乳糖可以對小鼠的記憶能力產生負面影響。

與模型組相比,陽性藥組小鼠入水后,多在平臺所在象限及鄰近區域運動,且穿越平臺的次數顯著多于模型組(P＜0.01),說明陽性藥組小鼠對原平臺位置記憶較模型組準確,維生素C對小鼠記憶能力的下降有保護作用。杜仲雄花粉總黃酮高、中、低劑量組均穿越平臺次數均與模型組有顯著性差異,且中、低劑量組小鼠入水后能主動在原平臺位置附近探索,很少在目標象限對側象限搜索,表明杜仲雄花粉總黃酮提取物對D-半乳糖造成的小鼠記憶能力下降有一定的改善作用。

3.2 杜仲雄花粉總黃酮提取物對小鼠器官的影響

如圖5所示,與正常組相比,模型組小鼠的肝臟指數極顯著降低(P＜0.001),說明模型小鼠肝臟受到嚴重損傷。與模型組相比,陽性藥組小鼠的肝臟指數極顯著增加(P＜0.01),說明維生素C對D-半乳糖導致的小鼠肝損傷有很好的保護作用;與模型組相比,杜仲雄花粉總黃酮提取物中、低劑量組小鼠的肝臟指數顯著增加,說明杜仲雄花粉總黃酮提取物對D-半乳糖導致的小鼠肝損傷有一定的保護作用。杜仲雄花粉總黃酮提取物高劑量組小鼠的肝臟指數雖有上升趨勢,但無顯著性差異。陽性藥組及杜仲雄花粉總黃酮提取物組的腎臟和肝臟指數與模型組相比雖然有所上升但無顯著性差異。

圖5 各組小鼠臟器指數

3.3 杜仲雄花粉總黃酮提取物對小鼠生化指標的影響

3.3.1 小鼠組織和血清總抗氧化能力(T-AOC)測試結果

由表1可知,模型組小鼠腦、肝臟和血清中總抗氧化能力最弱,并且與正常組有顯著性差異(P＜0.05),說明造模方法正確且衰老小鼠模型構建正確。杜仲雄花粉總黃酮高、中、低劑量組器官與血清中總抗氧化能力均與模型組形成顯著性差異,其中總黃酮中劑量組的腦組織,肝臟,血清的總抗氧化能力均與模型組有極顯著性差異。陽性藥組腦組織和血清中總抗氧化能力與模型組形成顯著性差異,但肝臟中總抗氧化能力與模型組相比沒有統計學意義。以上實驗結果表明杜仲雄花粉總黃酮提取物有助于D-半乳糖誘導衰老小鼠提高總抗氧化能力,對肝臟的作用最強且優于陽性對照藥維生素C。

表1 小鼠組織和血清中T-AOC水平

3.3.2 小鼠組織和血清中SOD活力測試結果

由表2可知,模型組小鼠器官和血清中SOD活力均與正常組形成顯著性差異(P＜0.05)。除杜仲雄花粉總黃酮高劑量組外,中、低劑量組小鼠器官及血清中SOD活力均與模型組形成顯著性差異,杜仲雄花粉總黃酮低劑量組的腦、肝臟、血清中S0D 活力比模型組分別提高了79.18%、61.31%、12.96%,在腦組織中SOD活力提高最大。表明杜仲雄花粉總黃酮提取物有助于提高D-半乳糖致衰老小鼠的SOD 活力,對D-半乳糖造成的小鼠腦組織中SOD活力下降有較好的延緩效果。

表2 小鼠組織和血清中SOD水平

3.3.3 小鼠組織和血清中MDA含量測定結果

由表3可知模型組小鼠腦、肝臟、血清中MDA的含量均與正常組形成顯著性差異,說明采用皮下注射D-半乳糖的方法可以加速小鼠的衰老。杜仲雄花粉總黃酮高、中、低劑量組小鼠腦及肝臟中MDA含量均低于模型組,且具有統計學意義(P＜0.05),表明杜仲雄花粉總黃酮有助于D-半乳糖致衰老小鼠清除脂質過氧化物,具有一定的抗氧化能力。

表3 小鼠組織和血清中MDA含量

以上結果表明,杜仲雄花粉總黃酮具有提高D-半乳糖誘導衰老小鼠血清、肝臟、腦組織中SOD活力、總抗氧化能力和清除肝臟、腦組織中脂質過氧化物的能力,有效防止或緩解氧化應激損傷,從而起到抗氧化衰老的作用。

4 結論

D-半乳糖在正常情況下可以代謝葡萄糖,但在體內大量存在時,則會導致機體產生氧化應激、線粒體功能障礙、免疫炎癥、端?？s短、代謝功能障礙等功能性變化,促進機體衰老[19]。近年來科研工作者對于黃酮類化合物抗衰老作用的研究逐漸深入,對于其抗衰老作用機制有了進一步的認識。黃酮類化合物是一種較好的抗氧化劑,其發揮抗衰老作用與機體自由基的清除和抑制脂質過氧化密切相關。研究證明黃芩[20]、草豆蔻[21]、紅景天[22]植物中的黃酮類化合物能夠通過其自身的酚羥基阻斷自由基鏈式反應,進而減少自由基的產生,還可以通過增強機體內抗氧化物酶的活性,清除體內過多的自由基,并且抑制脂質過氧化作用,減少脂質過氧化產物如MDA等對機體的傷害,進一步發揮抗衰老作用。與黃酮類化合物發揮抗衰老作用相關的信號通路主要有MAPK 信號通路、NF-kB 信號通路、PI3K/AKT信號通路、SIRT1信號通路、mTOR信號通路等。黃酮類化合物通過調控衰老相關信號通路,參與機體的免疫反應、炎癥反應的過程,保護細胞,發揮抗衰老作用[23]。

本實驗評價了杜仲雄花粉總黃酮提取物對D-半乳糖致衰老小鼠的影響。結果顯示杜仲雄花粉總黃酮提取物可以縮短小鼠潛伏期、提高小鼠對原平臺位置的記憶能力,改善衰老導致的學習記憶能力衰退,延緩模型小鼠大腦衰老;給予衰老小鼠杜仲雄花粉總黃酮提取物可以顯著提高小鼠肝臟的臟器指數,緩解衰老所致的肝組織損傷。以上結果證明了杜仲雄花粉總黃酮提取物具有一定的抗衰老作用。進一步測定各組小鼠血清及腦、肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)的活性、總抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)的含量,結果顯示杜仲雄花粉總黃酮提取物可以提高供試實驗小鼠主要器官和血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活性及總抗氧化能力,減少脂質過氧化物的產生。T-AOC、SOD活性及MDA 含量在小鼠肝臟、腦主要器官和血清中表現出不同水平,表明杜仲雄花粉總黃酮提取物對小鼠各主要器官和血清的作用能力不同。杜仲雄花粉總黃酮提取物通過提高衰老小鼠抗氧化能力,減少脂質過氧化物的產生,緩解氧化應激對機體產生的損傷,具有一定的抗衰老作用。本研究為杜仲雄花粉產品的進一步研發提供了理論依據。杜仲雄花粉總黃酮提取物的延緩衰老作用究竟是什么形式,還有待進一步研究。