米香型白酒中不同制曲工藝的微生物群落結構差異分析

皇甫潔，何猛超，劉 雅，溫銀萍，4，韓興林，何松貴，王德良，吳振強

（1.華南理工大學生物工程學院,廣東廣州 510006；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東佛山 528203；3.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；4.石河子大學化學化工學院，新疆石河子 832099）

中國白酒釀造歷史久遠，采用的是多種微生物共同發酵的傳統釀制技術，其生產制作工藝更是中華民族至關重要的非物質文化遺產之一[1-2]。按照使用原料可分為糧食白酒和代用原料白酒；按照生產方式可分為固態法白酒、半固態法白酒和液態法白酒、機械化白酒、半機械化白酒和手工生產白酒；按糖化發酵劑分類可分為大曲白酒、小曲白酒和麩曲白酒；按香型可分為濃香型白酒、醬香型白酒、清香型白酒、豉香型白酒、米香型白酒、鳳香型白酒等十二大香型白酒[3-4]。相比與世界上其他的蒸餾酒，中國白酒酒體和諧豐滿，風格獨特，酒體成分最為豐富[5]。

米香型白酒是以廣東、廣西地區米制蒸餾酒制作工藝為基礎的一類白酒總稱，包括豉香型白酒和米香型白酒，是一種獨特的白酒，因獨特的生產過程造就了其“玉、冰、清、米香、獨特、甘潤、回味爽凈”的獨特風格[6]。米香型白酒是酒曲中霉菌、酵母、細菌等微生物與原料的共同協調發酵作用得到的產物[7-9]。徐成勇等[10]利用平板稀釋法在米香型白酒酒曲中分離出了部分微生物；蕭暖章等[11]從麥芽汁培養基中分離出了表面酵母、產酯酵母、假絲酵母、釀酒酵母等功能性酵母菌；吳雪梅等[12]通過傳統培養法分析了米香型白酒酒曲和發酵過程中的微生物，結果表明酒曲中主要的微生物是米根霉和酒精酵母。

隨著科學技術的迅猛發展，白酒行業也逐漸往數字化、智能化、機械化方向發展，能夠大大提高白酒的產量和品質的均一性，同時也能夠解決生產勞動力不足、勞動強度大等問題。本論文通過高通量測序技術對九江酒廠傳統制曲和圓盤制曲的微生物群落結構多樣性進行對比分析，以期為企業機械化制曲的質量提升提供改進措施及建議。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

曲樣：本實驗所用的兩種曲樣為傳統制曲和圓盤制曲，由廣州九江酒廠有限公司提供，每次取200 g，實驗室保藏（4 ℃和-20 ℃）至檢測。大曲微生物DNA試劑盒為Fast DNA?Spin Kit for Soil。

試劑及耗材：無水乙醇、濃硫酸、氫氧化鈉、酚酞等（均為分析純），天津市福晨化學試劑廠；乙酸乙酯、己酸乙酯等標準品（均為色譜純），美國Sigma-Aldrich 公司；TAE 緩沖液：北京索萊寶科技有限公司；引物，上海生物工程股份有限公司；DNA Marker，Takara；瓊脂糖，南京生興生物技術有限公司；核酸染料Gengreen，上海賽百盛有限公司；土壤DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit），Omega Bio-Tek 公司。

儀器設備：CP1502 電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；HH-S6A 電熱恒溫水浴鍋，北京利偉永興儀器有限公司；PX2 型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀，上海賽默生物科技有限公司；DYY5 穩壓電泳儀，北京六一儀器廠；GeI Image System Tanon 1600 凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；Illumina MiSeq 高通量測序平臺，美國Illumina公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大曲理化指標檢測

不同類型高溫大曲的理化指標（糖化力、液化力、酯化力、發酵力、酸度等）依據QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》測定[13]。

1.2.2 大曲微生物群落組成檢測

（1）總DNA 的提取[14-15]。稱取不同類型高溫大曲5.0 g 用液氮速凍后迅速研磨。大曲總DNA 提取方法按照土壤DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）操作說明書。為了保證所提取基因組的濃度及純度對其進行PCR擴增及產物純化，對細菌16S rRNA 基因的V3—V4 高變區進行擴增，所用引物為338F/806R（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3/5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）；對真菌的內部轉錄間隔區（ITS1）進行擴增，所用引物為ITS5F/ITS1R（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3/5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）。擴增后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

（2）高通量測序。將檢測合格樣品送往蘇州帕諾米克生物醫藥科技有限公司，通過高通量測序（Illumina Miseq PE250）平臺進行高通量測序。

1.3 數據分析

每個樣品至少3 次重復，實驗數據以平均數±標準差（mean±SD）表示，顯著性差異以p＜0.05 為標準。

利用Excel 2019、IBM SPSS Statistics 25等統計軟件進行數據處理和分析，利用Origin pro 2021、Excel 2019 和網站https://www.omicstudio.cn/tool 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 傳統制曲與圓盤制曲理化指標分析結果

衡量酒曲性能主要通過對糖化力、液化力、發酵力與酯化力四大發酵性能進行分析。糖化力指酒曲中糖化微生物及糖化酶將可溶性淀粉水解為葡萄糖的能力，是衡量酒曲糖化作用強弱的一個重要指標[16]。液化力指酒曲中多種酶系對淀粉水解的綜合能力，當酒曲的液化力較高時，發酵體系中微生物可利用更多的可溶性糖，從而提高產酒率。此外，液化力與糖化力成正相關，當糖化力較高時，液化力也高。發酵力指酒曲生成乙醇的能力，是反映酒曲產酒能力的重要標志。酯化力指酒曲催化酸醇酯化的能力，直接影響酒曲酒的質量和品格。酒曲發酵性能、風味形成與發酵微生物分類組成息息相關。對比兩種不同工藝酒曲糖化力發現，圓盤工藝制曲的糖化力較高，傳統酒曲的酯化力較高，圓盤制曲的發酵力略高于傳統制曲，兩種不同工藝的酒曲液化力相差不大。由表1 可知，傳統制曲與圓盤制曲相比其酯化力和水分含量更高，表明傳統制曲更有利于曲中酯類等風味化合物的保存；圓盤制曲的發酵力和糖化力顯著高于傳統制曲，表明圓盤制曲中微生物的生長繁殖代謝和將可溶性淀粉水解能力均要高于傳統制曲。

表1 酒曲理化指標分析

2.2 傳統制曲與圓盤制曲微生物指標分析結果

2.2.1 傳統制曲與圓盤制曲細菌微生物群落結構分析

從表2 可看出，傳統制曲和圓盤制曲兩種樣品的覆蓋率（Goods coverage）均高于0.99，說明測序結果具有較高可信度，能夠反映樣品的真實情況[17]。Chao 指數是用于估算樣本中所含物種數目的指數，數值越高表示樣本中所含的物種數目越多，可以看出傳統制曲的物種數目高于圓盤制曲的物種數目。Shannon 指數、Simpson 指數能夠反映樣品的物種多樣性，數值越大表示樣本中群落多樣性越高，可以看出圓盤制曲的群落多樣性高于傳統制曲。

表2 兩種不同大曲微生物群落α-多樣性指數差異

表3 兩種曲在屬水平主要細菌(＞1%，%)

從圖1（a）可以看出，傳統制曲和圓盤制曲兩種曲的優勢細菌門是不同的，傳統制曲的優勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes），占總豐度的52.01 %，其次是變形菌門（Proteobacteria），占總豐度的40.79 %；圓盤制曲的優勢細菌門為變形菌門（Proteobacteria），占總豐度的89.57 %，厚壁菌門（Firmicutes）占比較少。從圖1（b）可以看出，傳統制曲和圓盤制曲在細菌屬水平上的微生物群落結構優勢菌種完全不同。傳統制曲的優勢細菌屬為：醋酸菌屬（Acetobacter）占總豐度的37.72 %，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）占總豐度的37.06%，魏斯氏菌屬（Weissella）占總豐度的8.84 %等，都為豉香型白酒中常見的功能微生物。圓盤制曲的優勢細菌屬為：克雷伯氏菌（Klebsiella）16.70 %，腸桿菌屬（Enterobacter）16.04 %等，為非釀酒功能微生物，醋酸桿菌、乳酸桿菌占比幾乎沒有。

圖1 細菌門/屬水平相對豐度圖

2.2.2 傳統制曲與圓盤制曲真菌微生物群落結構分析

從表4 可以看出，傳統制曲和圓盤制曲兩種樣品的覆蓋率（Goods coverage）均高于0.99，說明測序結果具有較高可信度，能夠反映樣品的真實情況。Chao 指數可以看出圓盤制曲的物種數目高于傳統制曲的物種數目。Shannon 指數、Simpson 指數能夠反映樣品的物種多樣性，數值越大表示樣本中群落多樣性越高，可以看出傳統制曲的群落多樣性高于圓盤制曲。

表4 兩種不同大曲微生物群落α-多樣性指數差異

表5 兩種曲在屬水平主要真菌(＞1%，%)

從圖2（a）可以看出，傳統制曲和圓盤制曲兩種曲的優勢真菌門也是不同的，傳統制曲的優勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota），占總豐度的85.89%，而毛霉菌門（Mucoromycota）占比較少，僅為14.01 %，圓盤制曲的優勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota），占總豐度的54.21 %，其次是毛霉菌門（Mucoromycota），占總豐度的45.16 %。從圖2（b）可以看出，傳統制曲和圓盤制曲在真菌屬水平上的微生物群落結構優勢菌種完全不同。傳統制曲的優勢真菌屬為：復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）占56.42 %，伊薩酵母屬（Issatchenkia）占19.93 %，毛霉屬（Rhizomucor）占7.72 %，根霉屬（Rhizopus）占6.30%等。圓盤制曲的優勢真菌屬為：嗜熱真菌屬（Thermomyces）占44.75 %，根霉屬（Rhizopus）占33.29%，毛霉屬（Rhizomucor）占11.11%，而復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）僅占7.05 %、伊薩酵母屬（Issatchenkia）占0.32%。

圖2 真菌門/屬水平相對豐度圖

3 結論

本研究采用高通量測序技術，對比了九江酒廠米香型白酒中傳統制曲和圓盤制曲兩種制曲方式的理化指標、微生物指標的差異性。理化指標結果表明，傳統制曲的酯化力、糖化力、發酵力、液化力等均高于圓盤制曲；微生物結果表明，在細菌門水平，傳統制曲的優勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes），占總豐度的52.01 %，圓盤細制曲的優勢菌門為變形菌門（Proteobacteria），占總豐度的89.57%，在細菌屬水平上，傳統制曲的優勢細菌屬為醋酸菌屬（Acetobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）等，都為米香型白酒中常見的功能微生物，圓盤制曲的優勢細菌屬為克雷伯氏菌（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）等為非釀酒功能微生物，而醋酸桿菌、乳酸桿菌占比幾乎沒有；在真菌門水平上，傳統制曲的優勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota），占總豐度的85.89%，圓盤制曲的優勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota），占總豐度的54.21%，在真菌屬水平上，傳統制曲的優勢真菌屬為復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、毛霉屬（Rhizomucor）、根霉屬（Rhizopus）等，圓盤制曲的優勢真菌屬為嗜熱真菌屬（Thermomyces）、根霉屬（Rhizopus）、毛霉屬（Rhizomucor），兩種曲在真菌屬水平上也是各不相同的。通過以上結果顯示，傳統制曲的質量優于圓盤制曲的質量，可以為企業的圓盤制曲提供改進意見和策略。