LncRNA SNHG15靶向miR-370-3p調控ox-LDL誘導的血管內皮細胞損傷

梁曉菊,楊春香,王朝亞

(安徽衛生健康職業學院,安徽 池州 247000)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)是一種發生于動脈壁的慢性炎癥疾病,其特征是在主動脈壁形成粥樣硬化斑塊,是心血管疾病的病理學基礎[1-2]。盡管現代醫學與技術不斷發展,心血管疾病仍在世界范圍內造成了大量的死亡[3]。內皮細胞的完整性是維持正常生理血管內穩態和功能所必需的,包括屏障功能、抑制血栓形成和抗炎反應,而且內皮細胞損傷與修復之間的不平衡促進動脈粥樣硬化進展[4]。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)產生于動脈粥樣硬化形成過程中,是心血管疾病的一種生物標志物。在ox-LDL刺激下,內皮功能障礙被認為是動脈粥樣硬化發展的重要始動因素[5]。本研究以ox-LDL處理的人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)在體外模擬動脈粥樣硬化,探討其病理機制。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNAs)是一類長度超過200個核苷酸的轉錄物,在基因表達調控中通過影響染色質修飾、轉錄或轉錄后過程發揮重要作用[6]。越來越多的證據表明lncRNAs的異常表達與脂質代謝紊亂和動脈粥樣硬化有關[7-9]。小核仁RNA宿主基因15(Small nucleolar RNA host gene 15,SNHG15)是一個高度保守的lncRNA,位于7p13,長度為860 bp。研究表明,下調lncRNA SNHG15表達通過miR-188-5p/PTEN 軸緩解缺氧誘導的心肌細胞損傷[10]。然而,目前尚不清楚lncRNA SNHG15是否參與動脈粥樣硬化的發展。StarBase預測顯示lncRNA SNHG15可能靶向結合miR-370-3p。先前的報道展示過表達miR-370通過下調硫氧還蛋白互作蛋白(Thioredoxin Interacting Protein,TXNIP)減輕ox-LDL誘導的HUVECs損傷[11]。盡管已有研究確定miR-370在動脈粥樣硬化中的作用,但目前尚未知lncRNA SNHG15在動脈粥樣硬化中的作用及其機制是否與miR-370-3p有關。因此,本實驗目的在于探索lncRNA SNHG15對動脈粥樣硬化的炎癥反應的影響是否通過靶向調控miR-370-3p起作用。

1 材料與方法

1.1 材料于中國科學院細胞庫購置HUVECs;ox-LDL購自北京索萊寶科技有限公司;于日本Takara公司購買Trizol試劑、反轉錄和熒光定量試劑盒;于上海生工生物工程公司合成引物;于上海貝博生物公司提供Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒;酶聯免疫吸附試驗 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自天根生物技術公司;于北京百奧萊博科技有限公司購置RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒;于美國Invitrogen公司訂購Lipofectamine 2000;si-NC、si-SNHG15、miR-NC、miR-370-3p、anti-miR-NC、anti-miR-370-3p購自上海吉瑪制藥公司;pcDNA、pcDNA-SNHG15購自上海索寶生物科技有限公司;

1.2 ox-LDL處理與分組用100 mg/L ox-LDL處理HUVECs細胞24 h,建立As細胞損傷模型,記為ox-LDL組,未經ox-LDL處理的HUVECs細胞記為Con組。采用Lipofectamine 2000試劑,分別將si-NC(5’-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3’)、si-SNHG15(5’-UAAAUAUCCCUUGUUUUUCAU-3’)、miR-NC、miR-370-3p分別轉染至ox-LDL組,記為ox-LDL+si-NC、ox-LDL+si-SNHG15、ox-LDL+miR-NC和ox-LDL+miR-370-3p組;將si-SNHG15分別與anti-miR-NC、anti-miR-370-3p共轉染至ox-LDL組,記為ox-LDL+si-SNHG15+anti-miR-NC和ox-LDL+si-SNHG15+anti-miR-370-3p組。48 h后,用于后續實驗。

轉染方法:使用Opti-MEM I低血清培養基稀釋Lipofectamine 2000試劑,記為A液。使用Opti-MEMI低血清培養基分別稀釋上述合成質?；蚬押塑账?記為B液。 將HUVECs接種于不含抗生素的培養基中,待細胞生長至80%左右匯合時,96孔板每孔加入100 μL A液與B液混合液,37 ℃下培養4～6 h后可更換培養基,培養48 h后用于后續實驗。

1.3 實時熒光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)取對數期且生長狀態良好的細胞,通過離心,收集細胞沉淀,采用Trizol試劑提取各組細胞總RNA,隨后通過反轉錄成cDNA進行PCR 擴增。采用2-△△Ct法計算lncRNA SNHG15相對GAPDH、miR-370-3p 相對于U6的表達水平。驗證轉染的效果以lncRNA SNHG15和miR-370-3p表達水平來衡量。引物序列見表1。

表1 lncRNA SNHG15、GAPDH、miR-370-3p、U6的上下游引物序列

1.4 細胞凋亡檢測依據Annexin V-FITC/PI試劑盒的步驟來檢測HUVECs細胞的凋亡情況。將收集的細胞使用PBS洗滌后,添加195 μL結合緩沖液進行細胞重懸,隨后加入5 μL ANXA5-FITC原液。上機測量前添加10 μL碘化丙啶,混勻,室溫靜置15 min后,流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況。

1.5 蛋白質印跡(Western blot)法驗證蛋白表達取生長狀態良好的各處理組細胞,胰蛋白酶消化后4 ℃,2 500 rpm離心10 min,棄去上清液,使用預冷的PBS洗滌細胞沉淀,向細胞沉淀中加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,冰上靜置20 min,震蕩混合,再靜置10 min,4 ℃,12 000 rpm,離心15 min,收集上清液,隨后依據BCA試劑盒定量樣本濃度。隨后將各組蛋白上樣量60 μg,經SDS-PAGE電泳轉移至PVDF上,后浸泡在5%脫脂牛奶室溫進行封閉,加入一抗并置于4 ℃過夜。將膜浸泡在二抗中2 h,暗室中曝光顯影后采用Image J V1.8.0軟件分析條帶的灰度值。

1.6 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)驗證炎性細胞因子依據ELISA試劑盒的步驟驗證HUVECs細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的表達量。隨后于450 nm處吸光度下利用酶標儀計算它們的濃度情況。

1.7 雙熒光素酶報告實驗建預測的含有miR-370-3p序列的SNHG15擴增并克隆至pmirGLO vector質粒構建野生型質粒WT-SNHG15,用基因突變技術將結合位點突變得到突變型質粒MUT-SNHG15,將HUVECs細胞接種于24孔板中,采用Lipofectamine 2000試劑將構建的質粒分別miR-NC和miR-370-3p共轉染入ox-LDL處理的HUVECs細胞,應用說明書分析熒光素酶活性情況。

1.8 統計學處理依據SPSS 21.0分析數據,正態分布的計量資料以“均數±標準差”表示,采用獨立樣本t檢驗作兩組間比較,單因素方差分析作多組間比較,P<0.05被視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ox-LDL誘導的HUVECs細胞損傷中lncRNA SNHG15和miR-370-3p的表達與Con組比較,經ox-LDL誘導的HUVECs細胞中SNHG15表達水平顯著升高,miR-370-3p表達水平顯著降低(P<0.05),見圖1。

圖1 lncRNA SNHG15和miR-370-3p在ox-LDL誘導的HUVECs細胞損傷中的表達

2.2 抑制lncRNA SNHG15對ox-LDL誘導的HUVECs細胞損傷的影響與Con組比較,經ox-LDL誘導的HUVECs細胞中SNHG15表達水平顯著升高,細胞凋亡率、Bax表達水平、炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達量提高,Bcl-2減少(P<0.05);同ox-LDL+si-NC組比較,ox-LDL+si-SNHG15組SNHG15的表達水平顯著降低,細胞凋亡率、Bax表達水平、炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達量降低,Bcl-2增加(P<0.05),見圖2。

圖2 干擾lncRNA SNHG15對ox-LDL誘導的HUVECs細胞損傷的影響

2.3 lncRNA SNHG15靶向調控miR-370-3p的表達StarBase預測顯示lncRNA SNHG15的一段核苷酸序列可以與miR-370-3p互補,見圖3。轉染miR-370-3p可顯著降低WT-SNHG15的熒光素酶活性(P<0.05),而對MUT-SNHG15的熒光素酶活性無顯著影響,見表3。pcDNA-SNHG15組同pcDNA組比較,其miR-370-3p表達量顯著減少(P<0.05);si-SNHG15組同si-NC組比較,其miR-370-3p表達量提高(P<0.05),見圖3。

圖3 lncRNA SNHG15和miR-370-3p靶向關系的驗證

2.4 過表達miR-370-3p對ox-LDL誘導HUVECs細胞損傷的影響與ox-LDL+miR-NC組比較,ox-LDL+miR-370-3p組miR-370-3p的表達水平顯著升高,細胞凋亡率、Bax表達水平、炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達水平均顯著降低,Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.05),見圖4。

圖4 過表達miR-370-3p對ox-LDL誘導HUVECs細胞損傷的影響

2.5 敲減miR-370-3p能逆轉抑制lncRNA SNHG15對ox-LDL誘導HUVECs細胞損傷的影響與ox-LDL+si-SNHG15+anti-miR-NC組比較,ox-LDL+si-SNHG15+anti-miR-370-3p組miR-370-3p的表達量顯著降低,細胞凋亡率、Bax表達水平、炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α增加,Bcl-2減少(P<0.05),見圖5。

圖5 下調miR-370-3p能逆轉抑制lncRNA SNHG15對ox-LDL誘導HUVECs細胞損傷的影響

3 討論

眾多研究表明,lncRNAs與miRNAs的異常表達與許多炎癥相關疾病的發生發展有關。如在脊髓損傷大鼠和LPS誘導的PC12細胞中,lncRNA CASC9低表達,lncRNA CASC9通過下調miR-383-5p報道減輕脊髓損傷中的氧化應激和炎癥反應[12]。lncRNA HOTAIR通過miR-130a-3p/MDM4軸抑制H2O2誘導的H9c2細胞凋亡[13]。在LPS誘導的急性肺損傷細胞模型中,lncRNA NEAT1通過miR-944/TRIM37軸促進WI-38細胞的凋亡和炎癥反應[14]。在IL-1β誘導的自身免疫性甲狀腺炎細胞模型中,lncRNA MALAT1過表達,熊果酸通過抑制lncRNA MALAT1/miR-206/PTGS1軸,減輕Nthy-ori 3-1細胞的損傷[15]。下調lncRNA SNHG15通過miR-183-5p/FOXO1軸抑制腦缺血再灌注損傷[16]。在缺血性腦卒中神經元損傷中,下調lncRNA SNHG15表達通過miR-18a/CXCL13軸發揮保護作用[17]。

越來越多研究表明,lncRNAs與miRNAs的異常表達與As進展相關。lncRNA KCNQ1OT1通過miR-452-3p/HDAC3/ABCA1途徑促進巨噬細胞脂質積聚并加速As的發展[18]。lncRNA ZFAS1通過調節miR-150-5p/Notch3軸促進ox-LDL誘導的HUVECs內皮向間充質轉化[19]。lncRNA H19在As患者和ox-LDL處理的HA-VSMC的血清樣本中表達上調,沉默lncRNA H19通過miR-599/PAPPA軸減低HA-VSMC細胞的增殖、遷移和侵襲能力[20]。在AS患者血清和ox-LDL誘導的人THP-1細胞中,lncRNA GAS5高表達,敲減lncRNA GAS5通過上調miR-135a表達降低細胞炎癥和氧化應激,且下調miR-135a部分逆轉了敲減lncRNA GAS5對它們的抑制[21]。

與上述研究結果相似,本研究顯示,在ox-LDL誘導的HUVECs細胞損傷中,lncRNA SNHG15表達水平升高,miR-370-3p表達水平降低;抑制lncRNA SNHG15和過表達miR-370-3p均顯著降低凋亡率和炎性細胞因子的表達量。提示抑制lncRNA SNHG15和過表達miR-370-3p可抑制HUVECs細胞凋亡和炎癥反應,從而減輕ox-LDL引發的細胞損傷。先前的文獻展示lncRNA SNHG15可參與細胞損傷的調控通過作為競爭性內源RNA負調控miRNA表達[16-17]。在此,StarBase顯示lncRNA SNHG15和miR-370-3p有結合位點,通過雙熒光素酶報告實驗證實,miR-370-3p組的WT-SNHG15含有更低的雙熒光素酶活性,同時過表達和抑制lncRNA SNHG14分別降低和提高miR-370-3p的表達水平,即lncRNA SNHG15靶向負調控miR-370-3p表達。且下調miR-370-3p表達逆轉了抑制lncRNA SNHG15表達對HUVECs細胞凋亡和炎癥反應的影響,提高了細胞凋亡率以及IL-6、IL-1β和TNF-α的表達水平。提示lncRNA SNHG15可能通過調控miR-370-3p表達影響ox-LDL誘導的HUVECs細胞損傷。

綜上所述,lncRNA SNHG15在ox-LDL誘導的HUVECs細胞損傷中上調,抑制lncRNA SNHG15表達通過靶向上調miR-370-3p調控ox-LDL誘導的HUVECs細胞凋亡和炎癥反應。這意味著lncRNA SNHG15可能提供了治療As的潛在的分子靶點,但其在體內的作用以及相關機制尚需進一步研究。