血清中MANF、Nesfatin-1水平在T2DM合并NAFLD患者中的變化及其相關性研究

汪惠敏,金國璽,方 言,朱閆慧,裴曉艷

(1.蚌埠醫學院,安徽 蚌埠 233030;2.蚌埠醫學院第一附屬醫院,安徽 蚌埠 233099)

T2DM患病人數占所有糖尿病總數的90%,近年由于青年人患病率顯著上升使得其成為全球公共衛生及財政的一大難題,其發病率的增長主要是因為飲食及生活習慣的改變。NAFLD是一種發病率高達65%的慢性肝病,多項研究數據表明T2DM可以加速NAFLD的病情進展,使其從單純的脂肪堆積逐漸發展成為更為嚴重的肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝硬化,如不及時干預及治療,最終可發展為肝細胞癌[1]。NAFLD也會反作用于T2DM,加重胰島素抵抗,從 而使糖脂代謝更加紊亂,導致發生糖尿病并發癥的風險增加[2]或使已經存在的并發癥更加嚴重。多年來,為了闡明NAFLD背后的免疫致病機制及其與T2DM的聯系,人們做出了大量努力,胰島素抵抗(insulin resistance,IR)似乎是兩種疾病中出現的關鍵事件之一。MANF是一種新發現的因子,保留在細胞中并由內質網應激誘導分泌;Nesfatin-1是一種分泌性肽,主要在食物攝取等方面發揮調控作用;已有文獻顯示,二者皆參與了T2DM和NAFLD發病,但關于其在T2DM合并NAFLD中的具體作用較少報道。本研究主要探討在T2DM合并NAFLD患者血清中Nesfatin-1、MANF的表達水平及其與疾病進展的關系。

1 研究對象及分組

1.1 研究對象選取30例在本院體檢的符合標準的志愿者作為健康對照組(A組);同時選取本院內分泌與代謝疾病科2021年12月至2022年7月收治住院的符合T2DM診斷標準的149例患者為研究對象,根據NAFLD診斷標準分為單純T2DM(即肝臟無脂肪變性)54例(B組)以及T2DM合并NAFLD 95例(C組);根據NAFLD的嚴重程度又將T2DM合并NAFLD組分為輕度脂肪肝、中度脂肪肝、重度脂肪肝三個亞組。

1.2 診斷標準及排除標準

1.2.1 T2DM診斷 根據世界衛生組織(World Health Organization,WHO)診斷標準[3]:符合糖尿病的典型癥狀并同時符合以下三種情況的任意一種:(1)隨機血糖(任意時段)≥11.1 mmol/L;(2)空腹(禁食至少8 h)血糖≥7.0 mmol/L;(3)口服75 g葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)2 h血糖≥11.1 mmol/L,無糖尿病典型癥狀者擇期復查確認。

1.2.2 NAFLD診斷 符合2010年《非酒精性脂肪性肝病診療指南》診斷標準[4]同時根據Fibroscan-502 Touch儀器所得數值,將控制衰減參數(controlled attenuation parameter,CAP)≥238 db/m定義為NAFLD。

1.2.3 NAFLD的分度 采用無創肝纖維化診斷儀(FibroScan-502 Touch)進行檢測,以CAP值為NAFLD的分度標準:(1)肝臟無脂肪變(脂肪變性<11%):CAP值<238 db/m;(2)輕度脂肪肝(脂肪變面積≥11%):238 db/m≤CAP值<260 db/m;(3)中度脂肪肝(脂肪變面積≥34%):260 db/m≤CAP值<293 db/m;(4)重度脂肪肝(脂肪變面積≥67%):CAP值≥293 db/m。

1.2.4 排除標準 過量飲酒史(男性攝入量>140 g/周,女性攝入量>70 g/周);病毒型肝病和自身免疫型肝病;1型糖尿病、妊娠期糖尿病、特殊類型糖尿病;合并重癥感染(如重癥肺炎、呼吸窘迫綜合征)、糖尿病急性并發癥及血液系統疾病(如血小板減少、白血病)等機體代謝狀況嚴重紊亂。

1.3 研究方法

1.3.1 血生化指標檢測 采集空腹靜脈血(禁食至少8 h)送至檢驗科使用生化分析儀檢測:丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL-C)、脂蛋白a、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA);高效液壓色譜法檢測糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HbAlc),放免法檢測空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、空腹胰島素(fasting serum insulin,FINS)。

1.3.2 計算胰島功能評估指標 胰島功能抵抗指數(homa insulin-resistance,HOMA-IR)=FINS×FPG/22.5;胰島功能分泌指數(Insulin secretion function index,HOMA-β)=20×FINS/(FPG-3.5)。

1.3.3 采用酶聯法檢測Nesfatin-1、MANF、IL-6水平 試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被Nesfatin-1、MANF、IL-6抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Nesfatin-1、MANF、IL-6呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度,計算樣品濃度。

1.3.4 體格指標測定 測量患者的身高(cm)、體重(kg),跟據公式計算體質指數(body mass index,BMl)=體重(kg)/身高(m)2。

1.3.5 標準化代謝疾病管理中心(Center for Standardized Metabolic Disease Management,MMC)檢測 采用內臟脂肪測量裝置(HDS-2000)檢測皮下脂肪面積以及內臟脂肪面積。

1.4 統計學方法分析采用SPSS 25.0統計軟件對數據進行分析處理,符合正態分布的計量資料以“均數±標準差”的形式表示,數據間的比較采用單因素方差分析;非正態分布的數據以中位數(四分位間距)表示,用非參數檢驗法分析;最終采用多元Logistic回歸分析T2DM合并NAFLD的影響因素,統計結果以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料及相關生化指標的比較三組人群在性別、年齡、病程、身高、AST、ALT、TBIL上差異無統計學意義(P>0.05),在內臟脂肪、皮下脂肪、體重、BMI水平上差異有統計學意義(P<0.05)。進行事后多重檢驗顯示:與A組相比,B組在內臟脂肪、皮下脂肪、BMI水平上顯著升高,差異有統計學意義(P值分別是0.000、0.000、0.044,t值分別是8.153、11.941、2.024);與A組相比,C組內臟脂肪、皮下脂肪、體重、BMI水平升高,差異有統計學意義(P值分別是0.000、0.000、0.000、0.000,t值分別是15.820、19.468、3.821、4.633);與B組相比,C組在內臟脂肪、皮下脂肪、體重、BMI水平升高,差異有統計學意義(P值分別是0.000、0.000、0.014、0.000,t值分別是4.711、3.716、2.487、4.242)(如表1)。

表1 一般資料及生化指標的比較

2.2 糖脂代謝指標的比較三組人群在HDL、LDL、脂蛋白a水平上差異無統計學意義(P>0.05),在HbA1c、FPG、TC、FFA、IL-6、FIns、HOMA-IR、HOMA-β、MANF、Nesfatin-1水平差異有統計學意義(P<0.05)。經事后多重比較分析顯示:與A組相比,B組在HbA1c、FPG、TC、FFA、IL-6水平顯著升高,差異有統計學意義(P值分別為0.000、0.000、0.025、0.033、0.000,t/z值分別是13.252、5.003、2.278、2.545、5.673),在FIns、HOMA-IR、HOMA-β、MANF、Nesfatin-1水平降低,差異有統計學意義(P值分別是0.000、0.015、0.000、0.000、0.003,t/z值分別是-4.427、-2.816、-6.410、-3.631、-3.071);與A組相比,C組在HbA1c、FPG、TC、TG、IL-6、FINs水平升高,差異有統計學意義(P值分別為0.000、0.000、0.023、0.000、0.000,t/z值分別為17.907、6.611、2.305、4.468、7.894),在FIns、HOMA-β、MANF、Nesfatin-1水平降低,差異有統計學意義(P值分別為0.000、0.000、0.000、0.024,t/z值分別為-5.814、4.078、5.540、-2.652);與B組相比,C組在FIns、TG、HOMA-IR水平升高,差異有統計學意義(P值分別為0.024、0.001、0.007,t/z值分別為2.656、3.570、3.052),在Nesfatin-1水平降低,差異有統計學意義(P=0.022,t=-2.308)(如表2)。

2.3 T2DM合并NAFLD組各亞組間指標比較三組在FIns、BMI、皮下脂肪、HOMA-IR、MANF、Nesfatin-1、IL-6水平差異有統計學意義(P<0.05)。經事后多重檢驗顯示:與輕度組相比,中度組MANF水平減低,差異有統計學意義(P=0.012,t=2.602);與輕度組相比,重度組在FIns、BMI、皮下脂肪、HOMA-IR、IL-6水平升高(P值分別為0.021、0.007、0.034、0.012、0.000,t/z值分別為-2.690、2.793、-2.529、-2.882、5.110),MANF、Nesfatin-1水平減低(P值分別為0.001、0.001,t值分別為-3.599、-3.457),差異有統計學意義;與中度組相比,重度組IL-6水平升高,差異有統計學意義(P=0.001,t=3.603)(如表3)。

表3 T2DM合并NAFLD組各亞組間指標的比較

2.4 多元Logistic回歸分析T2DM合并NAFLD嚴重程度的影響因素將有統計學意義的指標納入多元有序Logistic回歸,將因變量T2DM合并NAFLD的嚴重程度(輕度、中度、重度)進行賦值,經多元有序Logistic回歸分顯示:MANF、IL-6與T2DM合并NAFLD嚴重程度的密切相關(P<0.05),MANF是T2DM合并NAFLD的保護性因素,IL-6是T2DM合并NAFLD的危險性因素。(如表4)

表4 多元回歸分析T2DM合并NAFLD嚴重程度的影響因素

3 討論

NAFLD是全球慢性肝病的常見原因,主要以肝脂肪變性為特征[5]。相關臨床研究表明,NAFLD是T2DM的主要危險因素,且通常作為T2DM患者的并發癥發現[6],事實上,有研究表明90%的T2DM患者會合并NAFLD,且T2DM患者NASH的患病率是無T2DM患者的3倍。NAFLD與2型糖尿病之間存在雙向關系[7],T2DM增加NAFLD發展成NASH和肝纖維化的風險[8],NAFLD也會增加發生T2DM神經系統、心血管系統等并發癥的風險[9]。

MANF是新發現的一種神經營養因子,也是一種定位于內質網的可溶性分泌蛋白[10]。MANF最初被發現是一種在各種腫瘤中高度突變的蛋白,其后被發現在帕金森、腦出血、代謝性疾病中也發揮作用。近年的研究表明,MANF不僅在食物攝取和維持穩態[11]中發揮作用,同時還參與調節肝臟代謝。有研究學者證明,MANF表達在NAFLD早期增加,隨后在高FFAs刺激下逐漸降低。MANF缺乏增加了脂肪生成并加重了HepG2細胞脂肪變性,而MANF過表達抑制了脂肪生成并從FFAs誘導的脂肪變性中拯救了HepG2細胞。因此MANF是肝脂肪變性過程中的潛在治療靶點[12]。T2DM的特征在于外周組織中的胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷,代謝功能障礙和胰腺β細胞死亡引起的高血糖狀態[13],當胰島β細胞不能補償胰島素抵抗的程度,就會導致導致代謝應激,包括線粒體氧化和內質網應激激活未折疊蛋白(unfolded protein response,UPR),Lindahl等人的研究[14]發現MANF可保護β細胞免受內質網應激誘導的細胞死亡,同時他們還發現,過表達MANF可以增強β細胞增殖減少細胞死亡。這表明MANF在糖尿病β細胞保護和再生中起著重要作用。

Nesfatin-1是一種與食物攝入相關的新肽,主要起調控作用,且在中樞和外周組織中廣泛表達[15]。有研究學者發現Neaftin-1可以通過抑制氧化應激及細胞凋亡,從而減輕高糖誘導狀態下PC12細胞損傷,從而減輕糖尿病神經并發癥;Nakata M等研究發現[16],Nesfatin-1可以通過增強胰島β細胞中L型Ca2+通道的敏感性促進Ca2+內流,釋放更多胰島素,從而在調節葡萄糖穩態中發揮調節作用[17],同時脂類代謝、調節胃腸功能[18]、心血管及生殖功能也與它相關。最新報道還顯示,Nesfatin-1具有強大的抗炎,抗凋亡和抗氧化能力,可以改善幾種疾病的癥狀[19],如腦缺血再灌注、帕金森、潰瘍性結腸炎等。目前關于Nesfatin-1在T2DM合并NAFLD患者中的具體作用機制國內外多項研究結論均不相同,國外有研究表明T2DM患者存在低Nesfatin-1狀態[20];國內有研究則顯示T2DM患者Nesfatin-1的水平較正常人相比是升高的[21]。同時Nesfatin-1可以通過血脂代謝、調節血糖和葡萄糖轉化等過程,加劇脂肪肝的發生,增加NAFLD的發病風險,國內有學者通過高脂喂養構建NAFLD大鼠模型,發現Nesfatin-1參與NAFLD大鼠代謝紊亂與肥胖的過程。

IL-6是一種炎性因子,炎癥介質通過激活NF-κB途徑并增強IL-6的敏感性,導致細胞炎癥,最終導致細胞凋亡,有研究顯示MANF,Nesfatin-1可能通過抗炎、抗凋亡等機制,從而抑制T2DM合并NAFLD的發展。

本研究結果顯示,三組患者間血清MANF、nesfatin-1水平存在顯著差異,且在不同程度的T2DM合并NAFLD患者間也存在差異,相關性研究提示血清MANF、Nesfatin-1與IL-6呈負相關,MANF與Nesfatin-1呈正相關,Logistic回歸提示MANF、IL-6是疾脂肪肝的重要影響因素。

綜上所述,由于脂肪肝進展為NASH的可能性很高,尤其是合并多種并發癥時,因此早期評估和治療T2DM合并NAFLD勢在必行。血清MANF、Nesfatin-1參與T2DM合并NAFLD的發生發展且與疾病嚴重程度密切相關,同時也為治療T2DM合并NAFLD提供了新思路。