新型冠狀病毒檢測方法及其生物傳感器的研究進展

李 彤,李勝南,劉貴銘,劉鳳海,郭麗雙

(牡丹江醫學院 1.公共衛生學院;2.學術理論研究部,黑龍江 牡丹江 157011)

新型冠狀病毒(SARS-COV-2)自暴發以來不斷產生新的變異株。2021年5月,出現Delta(德爾塔)變異株,2021年11月,在南非患者標本中檢出B.1.1.529變異株,世界衛生組織(WHO)將其命名為Omicron(奧密克戎)變異株[1]。奧密克戎傳染性是普通流感病毒的5倍,迅速成為全球的主流變異株,有咳嗽、發熱、頭痛、喉嚨疼痛以及腦霧等類似流感癥狀。到現在為止,被WHO認定為高傳播性的SARS-CoV-2變異株共有15種,其中包括B.1.617.2、BQ.1和BQ.1.1等,這些變異株可以使病毒更容易傳播,具有更高的病毒復制能力和傳染性。

迄今為止,人類已經發現了7種冠狀病毒,分別是人冠狀病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1)、急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)、中東呼吸綜合征病毒(MERS-CoV)和新型冠狀病毒。新型冠病毒屬于套式病毒目,冠狀病毒科,已命名的有Alpha(阿爾法)、貝塔、Gamma(伽瑪)、Delta和Omicron共5個屬,新冠疫情過程中均已出現。新型冠狀病毒為單股正鏈RNA病毒,表面有特異性蛋白結合標志物,例如膜(Membrane,M蛋白、小包膜(Envelope,E)蛋白、核衣殼(Nucleocapsid,N)蛋白和刺突(Spike,S)蛋白,基因測序發現開放閱讀框(opening reading frame,ORF)存在1ab基因、N基因和E基因高度保守序列[2],通常作為新冠病毒檢驗的識別靶點,本文對新型冠狀病毒檢測方法進行綜述。

1 主要檢測方法

新型冠狀病毒常用檢測方法包括病原學檢測、核酸檢測、血清學檢測。病原學檢測主要是對病原體本身進行的檢驗,從病人樣本中用細胞培養法進行的病原菌本身的分析。對病毒進行了分離、培養和鑒別,并對其進行了電子顯微鏡的觀測,能夠在疾病爆發的初期就發現個體身上是否存在病毒,屬于最直觀的檢測方法,方法的缺點是病毒分離難度大、儀器設備價格昂貴。核酸檢測通過檢測新冠病毒中特異性RNA序列作為病毒診斷的標志物[3],是最值得信賴的檢測方法。目前全國抗疫過程中應用最普遍的新型冠狀病毒檢測方法是逆轉錄-聚合酶鏈反應,主要針對新型冠狀病毒ORF基因組中的1ab與N基因進行檢測,由于Omicron變異位點位于S蛋白,1ab 基因和 N 基因未發生變化,因此,原有的核酸檢測方法同樣適用于Omicron變異株,方法的靈敏度、特異度沒有影響。血清免疫學檢測通過配體或特殊物質與新型冠狀病毒表面特異性的蛋白標志物結合,呈現肉眼可見的斑點或顏色,方法操作簡便,但實驗結果的準確度較低,常作為篩選方法(見表1)。

表1 新型冠狀病毒主要檢測方法

2 生物傳感器技術

生物傳感器是一種能夠將待測生物分子轉化為可識別的光學或電學信號進行檢測的分析儀器,是目前臨床檢驗診斷新冠病毒開發的熱點。該儀器包括以下要素:一是用于識別固定化生物敏感材料的元件,如酶、抗體和抗原、微生物、細胞、組織、核酸及其他生物活性物質;二是高效能的能量換能器(例如氧電極、光敏管、場效應管、壓電晶體等),具備高速分析、信號轉化的能力。與現有檢測方法相比,生物傳感器技術具有選擇性高、成本低和操作簡便等優點,可以有效地檢測病毒核酸序列,對開發新冠病毒診斷技術呈現出巨大的潛力,被認為最有可能替代傳統檢測的方法,適用于早期檢測階段及感染監測。根據反應的原理分類,生物傳感器可以劃分成電化學生物傳感器、壓電生物傳感器、表面等離子共振生物傳感器、場效應晶體管生物傳感器等。

2.1 電化學生物傳感器利用分析物與電極表面識別元件的相互作用產生電化學信號實現對生物體的檢測。電化學生物傳感器具有便攜性、低成本和簡便的前處理的優點,同時也具有穩定性差、抗干擾能力不足和檢出限高等缺點,需要進一步的優化和改進才能達到臨床應用效果。

電化學生物傳感器按其識別元件制備不同,可以分為DNA生物電極傳感器和免疫生物電極傳感器。Damiati等[10]用生物素-親和素探針固定玻碳電極表面,差分脈沖伏安法成功檢測SARS-CoV-2中ORF1ab序列,檢出限達100 fg/mL。Tripathy等[11]用金納米粒子電沉積于電極表面固定巰基自組裝核酸探針,實現檢測SARS-CoV-2病毒特異序列,可以實現病毒快速檢測。Zhao等[12]在功能化石墨烯表面固定SARS-CoV-2特異序列,用于診斷確診患者,檢出率達85.5%,檢出限為200 copies/mL。

針對冠狀病毒的四種結構蛋白作為生物受體,可以將特異識別的生物信號轉化為所需的電信號,構建電化學免疫生物傳感器。Soares等[13]用單層羧甲基殼聚糖膜作為基質,進一步包被S蛋白抗體,與樣品中S蛋白結合制備免疫傳感器,用交流阻抗法成功檢測SARS-CoV-2,檢出限達0.179 fg/mL。Mojsoska等[14]使用S蛋白抗體進行功能化石墨烯電極,可以檢測20 μg/mL S蛋白的信號,相當于濃度5.5×105PFU/mL SARS-CoV-2,整個檢測過程約1 h。Rahmati等[15]將葡萄球菌蛋白 A 固定S蛋白抗體且用Cu2O納米立方體修飾的絲網印刷電極表面,在20 min內檢測到SARS-CoV-2,在0.25 fg/mL～1 μg/mL范圍有效測定,檢測限為0.04 fg/mL。Kiew等[16]研究了電極表面修飾鈀納米薄膜固定血管緊張素轉化酶2用于檢測SARS-CoV-2的S蛋白,檢出限達0.1 μg/mL,用時僅為21 min。

2.2 石英晶體微天平生物傳感器石英晶體微天平(Quartz Crystal Microbalance,QCM)生物傳感器的工作原理是利用石英晶體所產生的壓電效應,從而實現高效的性能表現,當施加機械作用力于石英晶體時,在施力的方向上產生電勢,晶體便會受到相應的作用力從而形成了電場,某些電介質在一定的應力下變形時,材料中的電荷會被極化,并在材料的表層帶上電荷,從而制備壓電生物傳感器。QCM具有低成本、免標記、高靈敏度等優點,同時也存在檢測過程中必須引入氧化還原離子對等缺點,因此阻礙了該項技術的開發。

按照壓電材料的不同,可以將它們分成三種類型:壓電單晶傳感器、壓電多晶傳感器和有機壓電材料傳感器。其中,壓電單晶傳感器中石英晶體微天平在SARS-CoV-2檢測應用已有報道。Zuo等[17]研制了馬多克隆抗體包被QCM用于檢測氣相痰液中SARS-CoV-2,可在2 min內有效檢測出0.6～4 μg/mL病毒抗原。Pandey等[18]通過具有疏水性和帶正電荷氨基酸殘基的S蛋白的結合位點與帶負電荷的羧基電極表面相互吸附實現檢測 SARS-CoV-2,靈敏度可達ng級。Narita等[19]闡述了開發壓電和磁致伸縮傳感器的策略,可以通過輸出電壓的變化來檢測SARS-CoV-2,表現出巨大潛力。Kabir等[20]將S蛋白抗體固定在聚氟乙烯表面構建壓電生物傳感器實現檢測SRAS-CoV-2。

2.3 場效應晶體管生物傳感器場效應晶體管(Field Effect Transistor,FET)生物傳感器通過調節FET電壓改變電場效應可以有效控制FET流過通道的電流大小,當固定在基質上的抗體與抗原結合到其表面時,可引起電荷密度和離子變化,指示出病毒的量,可用于檢測DNA、蛋白質、細胞和離子等生物識別物。它具有靈敏度高、分析速度快、無需標記等優點,缺點是電流容量小、耐壓低。Seo 等人[21]將SARS-CoV-2的S蛋白的特異性抗體固定于石墨烯單層上,開發了FET生物傳感器,實現檢測1～100 fg/mL的S蛋白,培養介質中檢出限達到1.6×10 pfu/mL。Kang等[22]開發了石墨烯表面固定SARS-CoV-2的S1蛋白抗體FET傳感器,實現SARS-CoV-2的檢測,檢出限達10-18mol/L(相當于10-16 g/mL),并將血清樣本的診斷時間降至2 min。Li等[23]將MXene與石墨烯修飾電極表面構建超敏感電子傳導層,開發同時檢測流感病毒和SARS-CoV-2的FET傳感器,線性范圍為1 fg/mL～10 pg/mL,平均反應時間僅為50 ms。

2.4 表面等離子共振生物傳感器表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)生物傳感器通過激光照射誘導介質表面產生等離子共振,導致反射波衰減現象,增加拉曼效應 (Raman scattering),可以通過傳感器芯片進行實時、原位、動態地測量不同生物分子之間相互作用的過程,達到痕量病毒檢測的目的。該方法的優點是靈敏度可達pmol甚至fmol級,缺點是方法不穩定容易導致測定結果偏差。Akib等[24]提出了石墨烯基多層(BK 7/Au/PtSe 2/Graphene) 涂層搭建SPR生物傳感平臺,通過琥珀酰亞胺酯固定S蛋白抗體、特異SRAS-CoV-2探針作為配位體,實現對SRAS-CoV-2檢測,檢測抗刺突蛋白的SPR角靈敏度達到153.85 °/RIU,SPRF靈敏度達到726.50 THz/RIU,最終檢測病毒RNA的SPR角靈敏度達到140.35 °/RIU,SPRF靈敏度達到500 THz/RIU。Lewis等[25]研制在金納米表面吸附生物素,固定鏈霉親和素?；m配子,建立生物素-親和素檢測平臺,實時檢測SARS-CoV-2的S1蛋白,動態范圍為 1～100 nmol/L,檢出限為0.26 nmol/L,響應時間10 min。

3 小結

到現在為止,SARS-CoV-2仍在繼續在世界范圍內傳播,新型冠狀病毒感染病毒爆發正處于全球性和持續性兩個方面的兩難境地。2019年底至今新型冠狀病毒的研究與開發已經發展的很快,雖然RT-PCR依然是檢測新冠肺炎的一種快捷的檢測手段。目前的新冠病毒檢驗方法在準確率、耗時和特異性等方面存在不同的缺陷,相比之下,生物傳感器技術恰好能夠彌補這些方面的不足。由于技術尚處于探索階段,在穩定性、探針制備等許多方面存在不足,契待進一步開發和完善。

從未來檢測方法開發的趨勢上看,新冠病毒的體外檢測產品,除了需要較高特異性和靈敏度以外,快速、成本低和操作簡便也十分關鍵。然而,若想同時實現上述目標并非易事,現已開發的傳感器技術難以勝任,大多數體系成本在較高水平,因此難以推廣使用。未來,電化學生物傳感器的發展方向應當聚焦于以下幾個方面:(1)這些微型裝置的性能需要進行優化,以達到簡潔高效的效果;對程序進行優化,最大程度地降低成本,以易于推廣和商業化。(2)通過特定的應用程序和機器,實現對數據的分析和對疾病進展的跟蹤。(3)通過開發便攜式設備可同時實現目標在線檢測和現場快速檢測,為患者提供高效、便捷的服務。