血卟啉衍生物在3種肺癌細胞系中的細胞攝取和定位

馬億江,丁曉倩,隋愛華,楊曉暉,曹藝巍,林存智

(青島大學附屬醫院,山東 青島 266555 1 呼吸與危重癥醫學科; 2 醫學研究中心)

在中國,肺癌是最常見的癌癥事件,也是癌癥死亡的主要原因[1-2]。光動力療法(PDT)作為一種有前景的、非侵入性的癌癥治療方式,在近幾十年廣泛用于肺癌的治療。PDT由3個基本成分組成,即光、氧和光敏劑(PS)[3-4]。血卟啉衍生物(HPD)存在化學純度低、組織穿透性差、半衰期長等缺點,但到目前為止仍是最常用、且是唯一一種被FDA批準用于多種實體惡性腫瘤臨床治療的PS[5-6]。PS的細胞攝取、胞內分布是決定PDT功效的重要因素[7]。實體腫瘤由多種具有不同PS攝取特性的細胞組成。因此,細胞水平的藥代動力學是優化PDT效果的一個重要參數[8]。本實驗以人支氣管上皮BEAS-2B細胞作對照,選取3種肺癌細胞系如人肺腺癌A549、人肺鱗癌H520、人肺小細胞癌H446細胞進行研究,在體外通過多功能酶標儀、流式細胞儀、激光掃描共聚焦顯微鏡等儀器檢測細胞內熒光強度,比較分析HPD在4種細胞內的攝取、定位差異,以期為針對不同的肺癌類型選取特定方案(特定的PS注射濃度和時間)來增強HPD介導的PDT療效提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HPD由重慶邁樂生物制藥有限公司生產,規格為5 mL:25 mg;在超凈工作臺分裝后于-20 ℃冰箱避光保存,用含體積分數0.10胎牛血清和體積分數0.01青霉素/鏈霉素雙抗溶液的DMEM高糖完全培養液現配現用。DMEM高糖培養液、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗溶液及40 g/L多聚甲醛固定液均購于大連meilunbio公司,胎牛血清購于武漢Procell公司,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、抗熒光淬滅封片液購于北京Solarbio公司。

1.2 細胞培養

人肺腺癌A549細胞系購于美國菌種保藏中心(ATCC),人支氣管上皮BEAS-2B細胞系、人肺鱗癌H520細胞系、人肺小細胞癌H446細胞系均購于武漢Procell公司,于青島大學附屬醫院中心實驗室液氮罐中保存。4種細胞系均使用含體積分數0.10胎牛血清和體積分數0.01青霉素/鏈霉素雙抗溶液的DMEM高糖完全培養液,于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的飽和濕度孵箱中培養。

1.3 繪制HPD熒光值的標準曲線

取96孔板,將HPD濃度設為5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg/L,每個濃度設3個復孔,應用多功能酶標儀檢測不同濃度HPD的熒光值(激發波長為405 nm,發射波長為630 nm),取其平均值,從低濃度開始繪制標準曲線。

1.4 多功能酶標儀檢測4種細胞系對HPD的攝取

將4種細胞以每孔104個細胞的密度接種于5塊96孔板中,每組設4個復孔,12 h后隨機分為對照組(無HPD孵育)和實驗組(用HPD孵育不同時間)。實驗組加入5 mg/L的HPD,分別于培養箱內繼續避光培養4、8、12、24、48 h,后棄去未結合HPD,加入完全培養液后用多功能酶標儀檢測熒光強度,激發波長為405 nm,發射波長為630 nm。

1.5 流式細胞儀檢測4種細胞系對HPD的攝取

將4種細胞以每孔105個細胞的密度接種于12孔板中,至12 h細胞貼壁以后隨機分為對照組(無HPD孵育)和實驗組(用HPD孵育不同時間)。實驗組加入5 mg/L的HPD,于培養箱內繼續避光培養24、48 h,后棄去未結合HPD。兩組均用PBS洗2次后收集細胞,以PBS重懸,各取400 μL(每組細胞總數為105個),過濾后用流式細胞儀檢測細胞熒光強度。

1.6 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察4種細胞系HPD的細胞定位

將蓋玻片用體積分數0.75的乙醇浸泡、培養液沖洗后置于24孔板中,4種細胞以每孔104個細胞的密度接種,12 h后隨機分為對照組(無HPD孵育)和實驗組(用HPD孵育)。實驗組加入15 mg/L的HPD,于培養箱內繼續避光培養48 h,后棄去未結合HPD,用40 g/L多聚甲醛常溫固定20 min,PBS洗3次后用DAPI避光染8 min,以PBS洗3次。將染色好的蓋玻片蓋于滴有抗熒光淬滅封片液的載玻片上并封片,于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 HPD熒光值標準曲線繪制

利用5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg/L HPD測得的熒光值繪制標準曲線(圖1),同時做相關回歸分析,得回歸方程Y=2 276×X+17 563(式中Y表示熒光強度,X表示濃度),相關系數r=0.992 0,P=0.000 9,95%CI=(0.878 7～0.999 5)。結果表明,在一定濃度范圍內HPD濃度與熒光強度呈正相關,可以用HPD的熒光強度來代表HPD含量。

圖1 HPD熒光值的標準曲線

2.2 多功能酶標儀檢測4種細胞系對HPD的攝取

將5 mg/L HPD與4種細胞分別共孵育4、8、12、24、48 h,多功能酶標儀檢測熒光強度,繪制時間依賴曲線(圖2)。如圖2所示,4種細胞系的HPD時間依賴曲線總體呈現上升的趨勢,表明隨著時間增加細胞攝取HPD增加。4種細胞系攝取HPD在4、8、12 h無明顯增加,BEAS-2B、A549、H446細胞在12 h之后HPD迅速積累,H520細胞則出現一定的延緩,在24 h后才表現出攝取速率的加快。

圖2 4種細胞系攝取HPD的時間依賴曲線

BEAS-2B(a)、A549(b)、H520(c)、H446(d)細胞分別與HPD共孵育24、48 h,流式細胞儀檢測細胞內HPD熒光強度;4種細胞系在24、48 h時的HPD攝取差異(e)。*、#:P<0.05;**、##:P<0.01;***、###:P<0.001。*:對照組與攝取HPD 24 h比較;#:攝取HPD 24 h與攝取HPD 48 h比較。

2.3 流式細胞儀檢測4種細胞系對HPD的攝取

為了排除細胞增殖差異的影響,進一步量化細胞攝取,對5 mg/L HPD孵育24、48 h的細胞進行流式細胞儀檢測。結果顯示,4種細胞在24、48 h表現出很強的熒光信號,表明HPD在細胞內高效累積,且48 h累積量高于24 h。隨著孵育時間延長細胞攝取HPD增加,但4種細胞系在48 h均未達到攝取飽和。見圖3。HPD孵育24、48 h時,4種細胞內平均熒光強度差異具有統計學意義(F=199.00、71.15,P<0.001),其中A549細胞內HPD平均熒光強度顯著高于H446、BEAS-2B、H520細胞,H446和BEAS-2B細胞內平均熒光強度顯著高于H520細胞(P<0.05),而H446和BEAS-2B細胞內平均熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)。所以,A549細胞攝取HPD的能力最強,BEAS-2B細胞和H446細胞次之,H520細胞攝取HPD的能力最弱。見圖4。

HPD共孵育24 h(a、b)和48 h(c、d),流式細胞儀檢測4種細胞系之間的攝取差異。*、#、△:P<0.05;**、##、△△:P<0.01;***、###、△△△:P<0.001。*、ns:與BEAS-2B實驗組比較;#:與A549實驗組比較;△:與H520實驗組比較。

2.4 HPD在4種細胞內的定位

本文激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結果顯示,與15 mg/L HPD共孵育48 h后,4種細胞系的實驗組細胞內呈現出強度不等的紅色熒光信號,均呈點狀分布于細胞質內,而在對照組幾乎觀察不到。表明4種細胞系攝取HPD定位于細胞質中,且分布未觀察到明顯差異。見圖5。

紅色表示HPD熒光,藍色表示DAPI熒光,比例尺=25 μm。

3 討 論

PDT治療的原理是PS在符合其吸收光譜的光波長照射下,吸收光子的能量轉移給氧分子,產生超氧陰離子、單線態氧等細胞毒性活性氧(ROS),導致氧化應激進而破壞腫瘤細胞。單線態氧的壽命極短(10～320 ns),其在細胞內的擴散范圍僅為10～55 nm,因此PDT的效果在一定程度上取決于所使用PS的細胞內分布、定位[6,9-10]。PS的細胞攝取、細胞內分布和滯留取決于PS的化學性質、PS濃度、孵育時間以及細胞特性,包括細胞體積、增殖狀態、細胞內靶位點與PS結合的親和力以及細胞類型等[7,11]。

已知一個特定的細胞類型有它自己的PS吸收和清除的比例(即細胞動力學特征)。早在1990年PERRY等[12]就研究證明了Photofrin Ⅱ的細胞攝取在不同細胞系間有所差異。隨后FICKWEILER等[13]的實驗研究證明了另外一種PS(ATMPn)在皮膚細胞系之間的細胞攝取差異。CHWIKOW-SKA等[14]在2003年研究顯示,Photofrin Ⅱ在不同腫瘤細胞(乳腺腺癌MCF7細胞和白血病T細胞淋巴瘤Jurkat細胞)之間存在著攝取差異。本研究探討臨床上應用的HPD(喜泊分)在不同組織學類型肺癌細胞中攝取的差異性。多功能酶標儀檢測結果顯示,支氣管上皮BEAS-2B細胞、肺腺癌A549細胞、肺小細胞癌H446細胞與HPD共孵育12 h后,HPD迅速累積,而肺鱗癌H520細胞攝取HPD速率緩慢,在24 h后攝取加快。由于多功能酶標儀檢測的是細胞總的熒光強度,所以在24、48 h進一步用流式細胞儀量化細胞內平均熒光強度,結果顯示,4種細胞48 h的細胞內平均熒光強度均高于24 h。以上結果表明,隨著時間增加4種細胞系攝取HPD的速率不同,也進一步證實細胞類型不同,其PS攝取存在差異。

本實驗中細胞與HPD共孵育48 h后,肺腺癌A549細胞內的平均熒光強度甚至達到了肺鱗癌H520細胞的2倍,肺小細胞癌H446細胞內熒光強度也遠高于肺鱗癌H520細胞,表明不同類型的肺癌細胞之間HPD攝取存在差異?？赡茈S著孵育時間的延長,細胞的增殖狀態影響了PS的攝取。此外,也可能是由于在HPD孵育初期,HPD更多地定位于線粒體,隨后在溶酶體中表現出時間依賴性的攝取[15]。這也解釋了本研究4種細胞與HPD共孵育4、8、12、24、48 h細胞內HPD熒光強度隨著時間延長而增強的現象。

PS的特性之一是選擇性靶向腫瘤組織[16]。有研究發現,腫瘤細胞中HPD的攝取量甚至比相應組織的正常細胞高5倍[17]。然而本研究結果顯示,正常支氣管上皮BEAS-2B細胞內HPD的攝取量高于肺鱗癌H520細胞,與肺小細胞癌H446細胞相比無統計學差異;雖然肺腺癌A549細胞內HPD的攝取量高于正常支氣管上皮BEAS-2B細胞,但遠不到5倍。1990年,PERRY等[12]的實驗也表明,正常肺纖維母細胞CCL-210細胞內PS的濃度高于肺癌細胞。這可能是由于體內體外實驗條件差異所引起,在體內情況下,多種因素可能促進HPD對腫瘤組織的高選擇性?？赡芤蛩匕?腫瘤組織中的腫瘤相關巨噬細胞(TAM)水平高于正常組織[18];與正常組織相比,腫瘤毛細血管相對高的滲透性和擴散作用[19];腫瘤組織存在增強滲透性和保留效應[20]。也有研究表明,在體外單獨腫瘤細胞中PS的累積并不是都高于正常組織來源的細胞[21]。

PS在細胞內的定位對于確定PS的靶點很重要,而PS的靶點可能決定了PDT產生光動力損傷的位點和程度,并且決定了細胞死亡的途徑和類型[22-23]。卟啉主要通過被動擴散、與脂蛋白結合以及與外周苯二氮受體結合等方式在細胞中累積,定位于線粒體、溶酶體、內質網、高爾基體、核膜等細胞膜結構,在細胞中發出彌漫性熒光[24-26]。本研究在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察4種細胞系HPD的細胞內定位,結果顯示,HPD在細胞質內彌漫性分布,并未觀察到明顯的分布差異,其亞細胞定位是否有差異需進一步研究。

綜上所述,在體外控制一定條件的情況下,不同的人肺癌細胞系攝取HPD存在差異,HPD的細胞攝取能力肺腺癌A549細胞>肺小細胞癌H446細胞>肺鱗癌H520細胞。然而是否所有的肺腺癌細胞均具有高HPD攝取能力,以及HPD細胞攝取與組織學分型的相關性,還需要進一步研究驗證。未來將在本實驗的基礎上選用動物移植瘤模型、類器官模型等模擬體內環境,探究HPD對腫瘤組織高選擇性的機制。