甲病毒單輪感染顆粒的構建及其應用

孫欣然,田思成,馬艷龍,馮飛,張榮

復旦大學上海醫學院基礎醫學院教育部/衛健委/醫科院醫學分子病毒學重點實驗室,上海市重大傳染病與生物安全研究院,上海 200032

甲病毒屬于披膜病毒科,其基因組為單股正鏈RNA,主要通過節肢動物傳播,可以感染多種包括人類在內的脊椎動物和無脊椎動物。甲病毒可分為舊世界甲病毒和新世界甲病毒兩類。舊世界甲病毒包括基孔肯亞病毒 (Chikungunya virus, CHIKV)、馬雅羅病毒(Mayaro virus, MAYV)、阿良良病毒(O’nyong-nyong virus, ONNV)、羅斯河病毒(Ross river virus, RRV)、辛德畢斯病毒(Sindbis virus, SINV) 和塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus, SFV)等,主要導致流行性急性和慢性關節炎;新世界甲病毒包括東方馬腦炎病毒(eastern equine encephalitis virus, EEEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV)和西方馬腦炎病毒(western equine encephalitis virus, WEEV),通過地方性周期性傳播,可感染大腦中的神經元細胞,導致腦炎甚至死亡[1]。甲病毒基因組全長約12 kb,具有5’帽和3’多聚腺苷酸尾,包含2個開放閱讀框(open reading frame,ORF),分別編碼4個非結構蛋白(nonstructural protein,nsp)nsp1～nsp4和5個結構蛋白(C,E3,E2,6K,E1)[2]。甲病毒入侵靶細胞第一步是通過與靶細胞表面黏附因子結合進而與特異性受體相互作用來實現的[3]。已有文獻報道了甲病毒相關的黏附因子和特異性受體,包括C型凝集素(C-type lectin)[4]、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)[5-6]、Mxra8 (matrix remodeling associated 8)[7]、低密度脂蛋白受體A類結構域3(low density lipoprotein receptor class A domain containing 3,LDLRAD3)[8]、極低密度脂蛋白受體(very low density lipoprotein receptor,VLDLR)[9]等。目前,仍有一些致關節炎甲病毒(如CHIKV)在全世界范圍內傳播。盡管甲病毒存在傳播流行的風險,但由于某些甲病毒(如CHIKV、VEEV等)需要在生物安全三級實驗室甚至安全等級更高的實驗室開展研究,極大阻礙了該領域的發展。此外,目前沒有針對甲病毒的特異性抗病毒藥物和疫苗被獲批用于臨床治療。

假病毒具有可操作性強、生物風險低、檢測方便、靈敏度高等優勢,故被廣泛應用于高致病性病毒的研究,如冠狀病毒[10-11]、埃博拉病毒[12]、流感病毒[13]、CHIKV[14]、漢坦病毒[15]等。假病毒可以模擬活病毒感染的入胞過程[16],也可以測量與活病毒相關抗體的效價[17-18]。本研究構建了基于鼠白血病病毒(murine leukemia virus, MLV)基因組的假病毒系統,通過質粒轉染將編碼MLV-gag/pol及異源病毒包膜蛋白的基因導入細胞表達,攜帶異源病毒包膜蛋白的假病毒顆粒會分泌到細胞培養基中[19-20]。此外,利用甲病毒成員基因組的兼容性,本研究還構建了基于SINV的病毒復制子顆粒(virus replicon particle, VRP)系統,采用報告基因如綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)基因取代結構蛋白基因,而編碼不同甲病毒成員結構蛋白的基因則通過反式互補表達,輔助包裝出具備單輪感染特性的VRP。通過對甲病毒入侵感染相關的宿主因子如HS和受體Mxra8進行驗證,來說明假病毒和VRP能夠反映活病毒的入胞特征,從而為研究甲病毒家族成員的入侵感染機制和抗病毒策略等提供安全可靠的實驗工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和感受態細胞293T細胞、BHK-21細胞、MEF細胞、MEFB3gat3(beta-1, 3-glucuronyltransferase 3)敲除細胞、MEFMxra8敲除細胞均由本實驗室保存,大腸埃希菌Stbl3感受態細胞購自Thermo公司。

1.1.2 質粒pCAGGS載體質粒、pSINV、pCAGGS-Capsid、MLV-gag/pol和pMIG-GFP均由本實驗室保存。

1.1.3 試劑本研究所用試劑包括AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen,AP-GX-250)、NucleoSpin Plasmid Mini kit (MN,740588.250)、MUL Assembly Cloning Kit(朗晶生物,PT008-200)、Polybrene(Sigma,TR-1003-G)、NEBNext Ultra II Q5 Master Mix(NEB,M0544L)、XhoI(NEB,R0146S)、EcoRI(NEB,R3101S)、EZ-Trans轉染試劑(李記生物,AC04L092)。

1.2 方法

1.2.1 甲病毒包膜蛋白編碼序列的合成根據GenBank公布的甲病毒成員序列,將以下病毒的包膜蛋白(E3-E2-6K-E1)基因交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成:SINV(U38305.1)、CHIKV-AF(EF452493.1)、CHIKV-LR(KY575571.1)、CHIKV-181/25(MT635337.1)、VEEV(L01442.2)、WEEV(KJ554983.1)和EEEV(AY705241.1)。

1.2.2 甲病毒包膜蛋白序列的擴增使用SnapGene軟件設計聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)引物,以合成的包膜蛋白序列為模板,對甲病毒包膜蛋白序列進行PCR擴增。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。

1.2.3 重組質粒pCAGGS-env的構建與鑒定利用XhoI和EcoRI對pCAGGS載體質粒進行雙酶切,獲得線性化質粒載體。通過MUL Assembly Cloning Kit將PCR產物分別和pCAGGS線性化載體片段進行無縫連接,獲得包含甲病毒包膜蛋白的質粒pC-env-SINV、pC-env-CHIKV-AF、pC-env-CHIKV-LR、pC-env-CHIKV-181/25、pC-env-VEEV、pC-env-WEEV和pC-env-EEEV。對獲得的質粒進行酶切鑒定,將鑒定結果符合預期的質粒送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。

1.2.4 病毒顆粒的包裝將處于對數生長期的293T細胞鋪于12孔板中,24 h后,在細胞密度達到70%～90%時準備轉染。

假病毒顆粒包裝:每孔加入的質?？偭繛?.37 μg,各質粒比例為pC-env∶MLV-gag/pol∶pMIG-GFP=0.74∶1∶1。按4∶1的質量比使用EZ Trans轉染試劑將各質粒共轉染進293T細胞,轉染48 h后收集上清液并于-80 ℃ 保存。

復制子顆粒包裝:每孔加入的質?？偭繛? μg,各質粒比例為pC-env∶pSINV-GFP∶pC-capsid=1∶1∶1。使用EZ Trans轉染試劑按4:1的質量比將各質粒共轉染進293T細胞,轉染后48 h收集上清液并于 -80 ℃保存。

1.2.5 感染實驗將處于對數生長期的細胞鋪于96孔板中,24 h后,在細胞密度達到90%～100%時準備感染。

假病毒顆粒感染實驗:每孔加入100 μL病毒懸液(30 μL病毒+70 μL含2%胎牛血清和6 μg/mL polybrene的培養基)進行感染。感染24 h后,換成新鮮的含2%胎牛血清的培養基繼續培養。感染48 h后,利用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測病毒感染效率。

復制子顆粒感染實驗:每孔加入100 μL稀釋后的病毒懸液(30 μL病毒+70 μL含2%胎牛血清的培養基)進行感染。感染24 h后,利用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測病毒感染效率。

1.3 統計學分析

通過Graphpad Prism 8進行統計學分析和繪圖。組間比較采用one-way ANOVA分析,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 含甲病毒包膜蛋白的假病毒顆粒的構建

使用三質粒系統包裝假病毒,包括表達甲病毒包膜蛋白的表達質粒(pC-env)、包裝質粒(MLV-gag/pol)和轉移質粒(pMIG-GFP),構建策略如圖所示(見圖1A)。將三質粒共轉染進293T細胞,48 h 后收集細胞上清液,感染BHK-21細胞,并通過熒光顯微鏡和流式細胞術檢測GFP的表達(見圖1B、1C)。結果顯示,所有假病毒顆粒均能檢測到熒光蛋白的表達, 表明假病毒顆粒包裝成功。

2.2 假病毒在驗證入胞感染中的應用

假病毒能在一定程度上模擬活病毒的入胞感染過程。因此,本研究利用假病毒感染驗證HS和Mxra8對入胞的影響。用假病毒感染B3gat3基因敲除的MEF細胞,同時以野生型細胞做對照,發現所有假病毒在敲除細胞中的感染效率均顯著降低。在Mxra8基因敲除細胞中,只有包膜蛋白源自CHIKV的假病毒感染效率明顯降低(P<0.000 1),而致腦炎甲病毒成員的假病毒感染未受到影響(見圖2A、2B)。以上結果表明,HS是甲病毒入胞相關的通用宿主因子,而Mxra8是致關節炎甲病毒的特異性入胞受體,與已發表的結果一致[5-7]。因此,本研究認為建立包裝的假病毒是研究甲病毒入侵感染過程的有效工具。

A: Fluorescence microscopy of pseudovirus infection on MEF WT cells, B3gat3 KO cells and Mxra8 KO cells. B: Flow cytometry analysis of pseudovirus infection on MEF WT cells, B3gat3 KO cells and Mxra8 KO cells, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1 compared with MEF WT group. KO: knockout.

2.3 構建SINV VRP及VRP安全性驗證

本研究還構建了基于SINV基因組骨架的VRP三質粒系統:pSINV-GFP、pC-env和pC-Capsid,分別為26S啟動表達GFP報告基因的SINV基因組、表達不同甲病毒成員的包膜蛋白E3-E2-6K-E1及SINV的衣殼蛋白,具體的構建策略如圖3A所示。首先構建了SINV VRP,即由SINV提供自身包膜蛋白。將三質粒共轉染到293T細胞,轉染后24 h到48 h,可以觀察到GFP陽性細胞增多(見圖3B)。為了驗證SINV VRP的感染性,用收集的SINV VRP感染293T細胞,可以觀察到熒光信號(見圖3C)。為了驗證單輪感染復制子顆粒的安全性,將獲得的復制子顆粒進行連續傳代。經過2次傳代后,細胞均不表達GFP(見圖3D),表明安全的單輪感染復制子顆?？梢蕴娲畈《緛硌芯科淙肭痔匦缘?。

A: Schematic diagram of VRP construction. B: Fluorescence microscopy of three-plasmid co-transfection. C: Fluorescence microscopy of SINV VRP infection on 293T cells. D: Safety verification of SINV VRP by fluorescence microscopy. hpi: hours post infection. P1: the first passage; P2: the second passage.

2.4 構建含不同甲病毒包膜蛋白的VRP

由于甲病毒基因組及其編碼蛋白的相似性,不同成員間具有靈活的兼容性,可以構建含不同甲病毒包膜蛋白的嵌合VRP。因此,本研究僅通過替換表達包膜蛋白的pCAGGS-env質粒,分別包裝了CHIKV-AF、CHIKV-181/25、EEEV、WEEV的嵌合VRP。在轉染后24 h到48 h,可以觀察到GFP陽性細胞明顯增多(見圖4A)。同時,將收集的上清液感染MEF細胞,可以觀察到GFP陽性細胞(見圖4B),表明不同甲病毒成員的SINV嵌合VRP包裝成功。

A: Fluorescence microscopy of three-plasmid co-transfection. B: Fluorescence microscopy of VRP infection on MEF cells. hpi: hours post infection.

2.5 VRP在入胞感染中的應用

因為單輪感染的VRP可以替代活病毒成為研究入侵感染相關宿主因子的工具,本研究利用上述構建的嵌合VRP感染驗證HS和Mxra8對病毒入侵的影響。與之前假病毒感染結果相似,所有VRP感染效率在B3gat3基因敲除細胞中均顯著降低,而VRP感染Mxra8基因敲除細胞時,只有含CHIKV包膜蛋白的VRP感染效率明顯降低,含致腦炎甲病毒EEEV和WEEV包膜蛋白的VRP感染效率沒有明顯變化(見圖5A、5B)。結果表明,HS是甲病毒入侵相關的通用宿主因子,而Mxra8只特異性地影響致關節炎甲病毒如CHIKV的入侵感染,與之前文獻報道的結論一致[5-7]。

A: Fluorescence microscopy of VRP infection on MEF WT cells, B3gat3 KO cells and Mxra8 KO cells. B: Flow cytometry analysis of VRP infection on MEF WT cells, B3gat3 KO cells and Mxra8 KO cells. **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1 compared with MEF WT group. KO: knockout.

3 討論

甲病毒成員可通過節肢動物如蚊蟲進行傳播,威脅公共衛生安全并具有潛在暴發流行的風險。近年來,一些社會和生態因素影響了節肢動物的地理分布,甲病毒開始在世界范圍內傳播和流行,并伴有較高的發病率和死亡率。目前,尚沒有具體的策略來應對和預防甲病毒感染。甲病毒入侵靶細胞的第一步是通過病毒表面包膜糖蛋白與特異性受體結合來實現的,因此研究甲病毒的入胞機制,開發阻斷病毒入胞的抗病毒策略,具有重要意義。

盡管甲病毒成員之間具有相似性,包裝的假病毒也表達了相似的結構蛋白,但包裝效率仍表現出了一定的差異。假病毒的包裝效率受多種因素的影響,不同的包裝系統會影響其包裝效率。常見的假病毒包裝系統包括MLV包裝系統、慢病毒載體包裝系統和水皰性口炎病毒包裝系統,可以嘗試用其他假病毒包裝系統對MLV包裝系統包裝效率低的甲病毒進行重新包裝測試;還可以通過優化包裝系統中的質粒提高假病毒的滴度,改變外源基因插入的位置或者通過強啟動子驅動外源基因,使獲得的病毒滴度提高100～1 000倍[12];此外,不同的轉染試劑、轉染質粒的比例、轉染試劑與質粒的比例以及轉染時的細胞系選擇,也會影響假病毒包裝效率。

本研究圖2A中, MLV-EEEV、MLV-WEEV和MLV-VEEV在Mxra8敲除細胞中的熒光強度明顯低于在MEF野生型細胞中的熒光強度,而圖2B中統計分析的差異不顯著;同樣,圖5A中,VRP-EEEV和VRP-WEEV在Mxra8敲除細胞中的熒光強度也有所降低,但圖5B中統計分析的差異亦不顯著。這種結果的差異可能是不同檢測手段導致的。熒光顯微鏡下視野選擇具有隨機性,用來觀察部分細胞的熒光表達水平;流式細胞術檢測全部細胞的熒光表達情況,能反映整體細胞的熒光表達水平。此外,熒光顯微鏡無法辨別表達弱熒光信號的細胞;而流式細胞術的檢測靈敏度更高,可以捕捉更多表達弱熒光信號的細胞。

目前,甲病毒復制子系統開發常用的甲病毒包括SINV[21]、SFV[22]和VEEV[23]。本研究在包裝SINV、CHIKV-AF和CHIKV-181/25的VRP時,包裝效率較低,收集的上清液中感染細胞比例低,而在包裝EEEV和WEEV的VRP時,包裝效率較高,這可能是SINV VRP系統對包膜蛋白序列的兼容性不同導致的。由于VRP系統的可行性和適用性需要驗證,VRP感染效率低會影響后續實驗結果的觀察分析和判斷,因此可以嘗試通過構建基于SFV或VEEV的VRP系統來提高包裝效率,或者基于CHIKV包裝CHIKV-AF和CHIKV-181/25的VRP。收獲的VRP可感染多種細胞系并確定易感細胞系,有助于后續實驗中不同實驗條件下細胞系的選擇。

本研究在構建VRP時,將衣殼蛋白基因與包膜蛋白基因分別克隆到2個獨立的質粒中表達。這種構建策略與衣殼蛋白和包膜蛋白被克隆到同一質粒表達的構建策略相比,具有一定的優勢。首先,同一質粒表達衣殼蛋白和包膜蛋白,只須發生一次重組就能獲得完整的病毒基因組,而分別表達衣殼蛋白和包膜蛋白,須發生2次重組才能產生完整的病毒基因組,形成野生型病毒,重組率低,安全性更高。此外,用同一質粒表達衣殼蛋白和包膜蛋白時,會引入突變使得p62喪失細胞內剪切功能,由此產生的病毒顆粒需要糜蛋白酶的激活才能具有感染性,應用難度大,使用成本較高,而分別表達衣殼蛋白和包膜蛋白時,不用引入p62的突變,不需要糜蛋白酶的激活,降低了操作難度,減少了使用成本,應用更為廣泛[24-25]。

4 結論

本研究成功構建了基于MLV的假病毒系統和基于SINV的VRP系統。兩系統都產生了單輪感染性顆粒,可以在二級生物安全實驗室進行操作,安全性較好;可以模擬甲病毒的真實感染過程,本研究利用這兩種系統驗證了B3gat3基因和Mxra8基因對甲病毒入侵過程的影響;同時表達熒光蛋白報告基因,可以便捷地量化檢測結果?；贛LV的假病毒系統將基因整合到宿主基因組中,報告基因的表達更穩定,適合長時間檢測?；赟INV的VRP系統利用了SINV的復制特性,可以更快速高效地合成所插入的報告基因,檢測更靈敏,也能更真實地模擬活病毒的感染過程。此外,由于本研究構建的病毒顆粒只能完成一輪感染,無法還原活病毒持續感染誘導出的病變反應,存在一定的局限性。本研究構建的MLV假病毒系統和SINV VRP系統為研究甲病毒入侵和研發抗病毒藥物提供了安全可靠的實驗工具。