非編碼RNA在膿毒癥發病中的研究進展

肖志輝,陳曦,吳剛,吳登龍

1. 同濟大學醫學院,上海 200331; 2. 上海市同濟醫院泌尿外科,上海 200065

膿毒癥是一種由細菌、病毒、真菌感染所引起的全身炎癥反應綜合征。它是重癥監護室(intensive care unit,ICU)中患者死亡的主要原因之一。感染性微生物能通過誘導細胞因子釋放來刺激機體產生炎癥反應,而炎癥反應可能會進一步導致全身多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[1]。除此之外,膿毒癥患者并發的全身性低血壓和微循環系統的異常灌注也是導致其全身多器官系統衰竭的重要因素。目前尚無預防和治療膿毒癥患者多器官系統衰竭的有效方法。因此,在細胞和生化水平上識別與膿毒癥相關的變化,早診斷、早復蘇并且及時給予適當的抗生素治療是非常重要的[2]。

最新的研究表明,發生膿毒癥時機體內一些非編碼RNA,如長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、微RNA(microRNA,miRNA)和環狀RNA(circular RNA, circRNA)的表達發生了變化;其轉錄產物也可通過各種不同的機制參與多器官系統衰竭的發病過程。本文闡述了這3類非編碼RNA在膿毒癥及其相關并發癥中起到的作用。

1 LncRNA與膿毒癥

LncRNA是一種大小超過200個核苷酸的轉錄產物。它們可以通過調節染色質構型、控制剪切相關事件、充當其他轉錄產物的誘餌和構建調控蛋白的募集結構來調節基因的表達[3]。此外,它們還參與了免疫反應的調節和幾種免疫相關疾病的發病過程[4]。最經典的例子為Carpenter等[5]的實驗:他們證明了lncRNA-Cox2通過與各種蛋白(如hnRNP A/B、hnRNP A2/B1、SWI/SNF等)相互作用調節染色質重塑和晚期原發性炎癥反應基因的反式活化。同時,Mumbach等[6]證明了LincRNA-EPS可以抑制免疫相關基因,如白細胞介素(interleukin,IL)6、IL1a和Ccl5的表達。此外,lncRNA在一些自身免疫性疾病,如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、多發性硬化癥、1型糖尿病的發病過程中也起到重要作用[7-8]。

Qiu等[9]所做的急性肺損傷(acute lung injury,ALI)動物模型實驗表明,動物模型中?；撬嵘险{基因1(taurine up-regulated gene 1,Tug1)表達下調可誘導機體細胞凋亡和炎癥反應。此外,在這些動物體中,上調Tug1可以改善與膿毒癥相關的肺損傷,減少細胞凋亡,減輕炎癥反應。TUG1還能保護肺微血管內皮細胞,使其免受內毒素的損害。TUG1通過海綿化miR-34b-5p和解除對接頭蛋白GAB1的抑制作用來抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的微血管內皮細胞的凋亡和炎癥反應?？傊?TUG1可通過miR-34b-5p/GAB1通路改善與膿毒癥相關的炎癥反應和細胞凋亡。Li等[10]研究發現,膿毒癥患者的血漿樣本中的Tug1基因下調、miR-223基因上調,還證明了膿毒癥患者TUG1和miR-223的表達呈負相關。此外,TUG1的表達水平與呼吸道感染程度、血肌酐水平、白細胞水平、C反應蛋白水平、APACHE II評分和SOFA評分呈負相關?；谶@些結果,TUG1被認為是一種預測膿毒癥病程和預后的生物標志物。TUG1也被證明與miR27a存在相互作用[11]:在心肌細胞中,TUG1的過度表達會導致腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)α下調,而miR-27a的過表達則會增強TNF-α的表達。上調TNF-α和miR-27a可促進LPS誘導的心肌細胞凋亡,上調TUG1則起到相反的作用。

肺腺癌轉移相關轉錄物1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)也是一種lncRNA,其通過影響miR146a/NF-κBP65來調節內毒素誘導的膿毒癥大鼠的免疫反應[12]。此外,MALAT1可通過募集EZH2下調BRCA1的水平,從而增加骨骼肌細胞的凋亡,并增強與膿毒癥相關的機體免疫反應[13]。在細胞水平,MALAT1可通過miR-150-5p/NF-κB這一通路來調節膿毒癥相關心臟炎癥反應[14]。烏司他汀通過下調MALAT1對LPS相關的心臟微血管內皮細胞功能障礙發揮保護作用[15]。Le和Shi[16]的研究證明,MALAT1可以通過miR-3b的靶向吸附,上調STAT125和降鈣素原(procalcitonin,PCT)的表達。最值得注意的是,MALAT1/miR-125a通路已被證明可以用來預測膿毒癥患者疾病的嚴重程度、器官的損害程度、炎癥反應水平和死亡率。與健康對照組相比,膿毒癥患者的lnc-MALAT1/miR-125a通路表達增加(P<0.001),其在區分膿毒癥組和健康對照組方面具有極好的價值,曲線下面積(area under the cure,AUC)為0.931,95%置信區間為[0.908,0.954][17]。

NEAT1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1)也是一種被廣泛研究的、參與膿毒癥病理生理過程的lncRNA。NEAT1可通過let-7a/TLR4通路促進炎癥反應,加重膿毒癥相關的肝損傷[18]。此外,NEAT1可通過miR-370-3p/TSP-1通路促進膿毒癥的進展[19],還可通過調節miR-17-5p/TLR4通路促進內毒素誘導的巨噬細胞炎癥反應[20]。NEAT1下調后可通過miR-125/MCEMP1通路抑制膿毒癥小鼠的免疫反應[21]。與健康對照組相比,燒傷導致的膿毒癥患者血清中的NEAT1表達量增加,miR-495-3p表達量下降,前者可調節血管生成并激活TGFβ1/SMAD信號通路[22]。最新的研究表明,NEAT1可通過調節miR-9-5p/TFRC和GOT1通路促進鐵死亡,導致膿毒癥相關性腦病惡化[23]。表1總結了常見的lncRNA (如TUG1、MALAT1和NEAT1)在膿毒癥發病過程中所起的作用。

此外,其他幾種lncRNA也可通過調節免疫反應來影響膿毒癥的進程。Li等[43]研究發現,MEG3-4可調控免疫應答基因的轉錄水平,從而動態調節肺部炎癥反應:MEG3-4以競爭的方式結合到miR-138上,與編碼致炎細胞因子IL-1β的mRNA競爭,從而增加IL-1β的豐度,并可加強體外培養的小鼠肺泡巨噬細胞、肺上皮細胞以及肺組織對細菌感染的炎癥反應;MEG3-4介導的miR-138在細胞質中的海綿作用增加了IL-1β的自分泌活性,從而誘導了由NF-κB介導的負反饋機制,從而降低MEG3-4的豐度,減少炎性細胞因子的產生。及時降低MEG3-4豐度可緩和肺部感染細菌小鼠體內的促炎反應,防止感染向膿毒癥進展。這些發現揭示了MEG3-4通過免疫反應基因的轉錄調節來動態調節肺部炎癥反應,將與lncRNA相關的誘餌和海綿機制延伸到抗菌免疫,從而影響炎癥反應和疾病進展。Yang等[44]研究發現,沉默HULC可抑制細胞凋亡和炎癥反應。HULC負向調控miR-128-3p的表達,敲低HULC后,miR-128-3p上調,使HMEC-1細胞免受LPS誘導的損傷。RAC1是miR-128-3p的靶點,在LPS刺激的HMEC-1細胞中,提高RAC1可削弱HULC介導的對凋亡和炎癥的抑制作用。通過調節miR-128-3p/RAC1軸,HULC敲低后可部分逆轉LPS誘導的膿毒癥。Wang等[45]研究發現,lncRNA XIST與miR-150-5p通過TXNIP通路調節膿毒癥誘導的心肌損傷。XIST影響細胞焦亡,敲低XIST可減輕脂多糖誘導的細胞損傷。Liu等[46]研究提示,ZFAS1通過靶向miR-590-3p/AMPK/mTOR信號介導的心肌細胞自噬和焦亡來加速膿毒癥所致心功能障礙的進展。

2 miRNA與膿毒癥

miRNA的大小約為22個核苷酸,它們通過與靶mRNA的不同區域尤其是與其3′端非編碼區結合來調節基因的表達。它們既可以降解靶基因,也可以抑制其翻譯?，F已發現幾種miRNA可以影響膿毒癥的進程。許多研究已經報道了這些轉錄產物在膿毒癥中的表達改變。例如,與健康對照組相比,膿毒癥患者血漿miR-494-3p水平降低,與TLR6上調相關。在脂多糖誘導的RAW264.7細胞中,miR-494-3p的表達水平降低,同時TLR6和TNF-a的表達上調。在RAW264.7細胞中強制過表達miR-494-3p可降低TNF-α水平,抑制NF-κB p65的核轉位。TLR6已被證明是miR-494-3P的靶點?？傊?miR-494-3p可以通過影響TLR6的表達來減輕膿毒癥相關的炎癥反應[47]。miR-218是另一種參與膿毒癥發病過程的miRNA。這種miRNA可以通過JAK/STAT通路降低VOPP1的表達,從而減輕膿毒癥的炎癥反應[48]。

miR-122是膿毒癥中的另一種重要的miRNA,與C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)相比,miR-122對膿毒癥和傷口感染具有更高的診斷價值。雖然其特異性和準確性較低,但miR-122也被認為是膿毒癥的預后標志物[49]。

在膿毒癥小鼠模型中,miR-208A-5p水平降低和SOCS2水平升高與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性增強、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)活性降低相關。此外,在該動物模型中,miR-208A-5p的下調與低水平的TNF-α、IL-6、NF-kB p65和HIF-1α有關。miR-208A-5p的沉默可減輕膿毒癥動物模型的心肌細胞線粒體腫脹程度,抑制心肌細胞凋亡。綜上所述,抑制miR-208A-5p的表達被認為是減輕膿毒癥相關心肌損傷的一種方式。這一功能是通過NF-κB/HIF-1α通路介導的[50]。

miR-21是另一種miRNA,其在膿毒癥中的作用已被廣泛證實。Xue等[51]的一項研究表明,miR-21的下調可以抑制炎性小體激活、ASC嗜熱體、抑制內毒素誘導的細胞焦亡和感染性休克。另一項在膿毒癥動物模型中的研究表明,miR-21的上調抑制了炎癥反應和細胞凋亡[52]。同樣,骨髓間充質干細胞來源的外切體復合物已被證明可以通過上調miR-21來減輕膿毒癥小鼠的癥狀并提高其存活率[53]。

miR-328是另一種在膿毒癥患者和膿毒癥動物模型中表達失調的miRNA。miR-328的表達與血肌酐、白細胞、CRP、降鈣素原水平和APACHE II評分、SOFA評分呈正相關。同時,Sun等[54]通過接受者操作特征 (receiver operating characteristic,ROC)曲線評價了miR-328在膿毒癥中的診斷價值,結果顯示AUC為0.926,敏感性為87.60%,特異性為86.36%。這一結果提示該miRNA的血清水平可以正確地鑒別膿毒癥。因此,miR-328被認為是膿毒癥的診斷生物標志物。此外,miR-328的下調可以改善膿毒癥相關的心功能障礙和組織炎癥反應。miR-452是另一種應用于膿毒癥診斷的miRNA。值得注意的是,因為這種miRNA在膿毒癥并發急性腎損傷的患者中的表達比其他膿毒癥患者更高,所以該miRNA的血清和尿液水平可能是膿毒癥并發急性腎損傷的早期診斷的標記物[55]。表2中總結了幾種常見的miRNA在膿毒癥診斷中的作用。

3 circRNA與膿毒癥

circRNA是最近發現的一組具有封閉環狀構型的非編碼RNA,由共價鍵將線性轉錄產物的兩端連接形成,其在多種疾病的病理過程中發揮著至關重要的作用。大量證據表明,一些轉錄產物如mRNA可以作為蛋白質生物合成的直接模板在核糖體中翻譯產生蛋白質,而circRNA主要在轉錄中發揮調節功能。許多研究評估了circRNA在膿毒癥中的作用[63]。在膿毒癥刺激的肺損傷的發展過程中,circRNA可調控基因表達,如circC3P1通過影響miR-21的表達來減少膿毒癥相關性急性肺損傷中炎性細胞因子的產生和細胞凋亡[64]。

膿毒癥患者與健康個體血清外泌體中circRNA的表達存在差異,這可能與疾病的發生和發展有關。Tian等[65]的研究表明,膿毒癥患者和健康對照組之間有132個circRNA的表達存在差異: RT-PCR法提示circRNA_104484和circRNA_104670 在膿毒癥患者血清中表達上調;ROC分析表明,這2種circRNA具有作為膿毒癥診斷新型生物標志物和分子治療靶點的潛力。

circSTRN3也是一種被認為可以作為未來治療膿毒癥相關急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)靶點的circRNA。RT-PCR法已證實circSTRN3在膿毒癥患者的血清中表達上調。在膿毒癥誘導的AKI中, STRN3上調,進而通過miR-578/TLR4軸,促進AKI的發病,因此circSTRN3可能成為AKI治療的未來靶點[66]。

circVMA21能夠通過miR-9-3p/SMG1通路調節氧化應激反應和炎癥反應,來改善膿毒癥相關性AKI[67]。circ_0114428/miR-495-3p/CRBN通路是參與膿毒癥相關性AKI發病機制的另一個分子通路[68]。此外,circPRKCI的表達水平與膿毒癥的嚴重程度和28天內的死亡風險相關[69]。

circHIPK3可通過miR-124-3p/KLF6通路加重膿毒癥性急性腎損傷(sepsis-induced acute kidney injury,SAKI)的炎癥反應,也可通過miR-148b-3p/DNMT1/3a加速SAKI細胞衰老[70]。circHIPK3在SAKI中高表達,circHIPK3沉默可減輕SAKI小鼠的腎臟損傷,并通過減輕炎癥反應和抑制細胞衰老來提高SAKI細胞的活力。在機制上,circHIPK3通過競爭性結合miR-124-3p上調KLF6的表達,從而促進KLF6與NLRP3的結合,激活NLRP3/caspase-1介導的細胞焦亡,最終加重SAKI炎癥反應。circHIPK3通過競爭性結合miR-148b-3p上調DNMT1/3a的表達,從而提高Klotho啟動子的甲基化水平,加速SAKI細胞的衰老。下調miR-124-3p或miR-148B-3p可減弱HIPK3沉默對SAKI的保護作用。

circ_RASGEF1B是環狀RNA RasGEF結構域成員。有研究證明, circ_RASGEF1B通過與miR-146a-5p結合,上調miR-146a-5p靶點PDK1的表達,從而促進LPS誘導的腎小管上皮細胞凋亡和炎癥反應[71]。Hong等[72]的研究結果提示,circFADS2在膿毒癥患者血清中表達上調;其對LPS誘導的炎癥反應具有保護作用,可抑制后者誘導的肺細胞凋亡。表3總結了幾種常見的circRNA在膿毒癥中的作用。

4 討論

盡早診斷膿毒癥對于提高患者生存率極為重要。特征性的診斷標準物有助于對患者進行早期診斷并提供適當的治療。然而,目前臨床常用的生物標志物缺乏特異性。

大量文獻指出,lncRNA、miRNA和circRNA與膿毒癥的并發癥有關。一些lncRNA如NEAT1、XIST、MALAT1、MEG3、ZFAS1、HULC、MIAT和TUG1在膿毒癥發生發展和診斷中已經顯示出較大的潛力[16,43-46,93-95]。作為這一方向被研究最多的lncRNA,NEAT1已被證明是let-7a、let-7b-5p、miR-330-5p、miR-370-3p、miR-124、miR-125、miR-17-5p、miR-165p、miR-93-5p、miR-370-3p、miR-144-3p、miR-944、miR495-3p、miR-22-3p、miR-31-5p和miR-590-3p的分子海綿[22,96-97]。通過阻斷這些miRNA, NEAT1可以影響膿毒癥發病過程中的幾個分子通路。它可通過增強免疫反應和靶器官的相關損傷參與膿毒癥相關的多器官損傷過程。lncRNA 和miRNA可以改善膿毒癥時靶器官的不良病理事件,特別是心臟和腎臟[45,98-101]。它們似乎有潛力成為膿毒癥早期診斷和治療的靶點。然而,這一領域尚未成熟,需要在更多的動物模型和細胞系中進行驗證。

膿毒癥具有早期表現出免疫過度激活、晚期表現出免疫抑制的特點。因此,本文認為,具有抗炎活性的miRNA在膿毒癥早期可能對機體是有益的,但在膿毒癥晚期時其可能是有害的。然而,具有促炎活性的miRNA在早期膿毒癥中可能是有害的,但在晚期膿毒癥中可能是有益的[102]。

circRNA作為新發現的非編碼RNA,與炎癥、免疫抑制和內皮功能等各種分子反應有關,并且在膿毒癥的進展過程中發生顯著的改變。circRNA對核酸外切酶具有很強的抵抗力并且在血液中有較高的穩定性,故其顯示出作為生物標志物的優秀潛力。circRNA的血清水平升高后,其平均半衰期為 48 h,而血清中其他線性非編碼RNA的半衰期約為10 h。此外,circRNA還具有組織特異性和發育階段特異性。circRNA/miRNA/mRNA軸在多種疾病中的調控功能已經得到證實,其中包括膿毒癥。circRNA已被證實可通過海綿化miRNA來調節膿毒癥的進展。然而,對circRNA參與調節的膿毒癥誘導的器官衰竭的理解仍處于較早期的階段,尚未在臨床中廣泛應用。因此,迫切需要進一步的研究來證實circRNA在不同疾病進展中的調節作用,并確定某種疾病存在的特定circRNA[103]。

膿毒癥是一種危急重癥,任何一種治療方案都應兼顧有效性和及時性,盡可能地減少膿毒癥所帶來的嚴重并發癥。由于膿毒癥相關并發癥的病因還不完全清楚,因此須對不同類別的非編碼RNA進行高通量測序來發現膿毒癥背景下這些轉錄產物之間的復雜網絡。