基于高通量測序的抑郁癥患者腸道菌群結構分析

王雅萍,潘苗苗,夏欣媛,肖振明,楊浩,吳志國,趙超,4

1. 上海市嘉定區南翔醫院 心理醫學科,上海 201800; 2. 復旦大學基礎醫學院教育部醫學分子病毒學重點實驗室, 上海 200032; 3. 上海市楊浦區精神衛生中心科教科,上海健康醫學院精神衛生臨床研究中心,上海 200433; 4. 國家老年疾病臨床醫學研究中心(復旦大學附屬華山醫院),上海 200040

重性抑郁障礙(major depressive disorder,MDD)也被稱為臨床抑郁癥,是一種常見的慢性、致殘性精神障礙[1]。全球有超過3.5億人罹患抑郁癥,造成了嚴重的醫療衛生和經濟負擔[2]。高度復雜的遺傳差異和環境因素共同導致了抑郁癥的高復發性和易感性[2],同時也導致現有醫療手段治療效果的有限性。不少研究已關注到腸道菌群平衡在維護宿主健康中發揮了重要的作用[3-4]。近年來有研究證實腸道微生物能夠通過多種途徑調節中樞神經系統的發育,而腸道菌群失調與多種神經精神疾病有很高的相關性[5]。因此,本研究通過16S rRNA高通量測序,對抑郁癥患者與健康人的糞便樣本進行對比分析,并基于抑郁癥患者的腸道菌群結構,為抑郁癥的治療干預提供潛在的微生物靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象

抑郁癥患者組為2020年5月—2021年2月上海市嘉定區瑞金醫院南翔分院門診就診的患者,共19例(男性9例,女性10例),年齡22～40歲。研究隊列的入組標準為:①符合美國《精神障礙診斷與統計手冊》(第五版DSM-5)“重性抑郁障礙”診斷標準,由2名主治醫師以上職稱的精神科醫師診斷一致;②無胃腸道、高血壓、糖尿病等系統性疾病,無雙相情感障礙等其他精神障礙;③糞便標本收集前3個月無抗生素、益生元等微生態制劑使用史。健康對照組為同期參與體檢的健康志愿者,共20名(男性10名,女性10名),年齡24～40歲。入組標準:①無精神疾病及家族史,無精神發育遲滯/障礙;②無重大軀體疾病,不合并胃腸道、高血壓、糖尿病等系統性疾病;③糞便標本收集前3個月無抗生素、益生元等微生態制劑使用史。參與者均自愿參與并簽署知情同意書。本研究經所在醫院倫理委員會批準同意執行(倫理編號2020-6)。

1.2 糞便樣本收集與腸道微生物DNA提取

在清晨未進食前,使用一次性15 mL無菌采便管收集患者和健康人的糞便標本2～3 g,于-80 ℃冰箱內保存。使用OMEGA DNA試劑盒(Omega Bio-Tek, Norcross,美國),按照制造商的說明書提取總基因組DNA樣本,并在進一步分析之前儲存在-20 ℃冰箱中。使用NanoDrop NC2000分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific)和瓊脂糖凝膠電泳來評估提取的DNA樣品的數量和質量。

1.3 量表評估

告知所有參與者問卷調查的目的和具體要求,并進行抑郁癥自我評估量表(PHQ-9)、廣泛性焦慮障礙量表(GAD-7)評估和一般情況調查表評估。①PHQ-9用于篩查及評估抑郁癥狀,共有9個條目,總分值越高則抑郁程度越嚴重;②GAD-7為簡明的焦慮癥狀自評表,共7個條目,總分值越高則焦慮程度越嚴重;③一般情況調查表主要包括對年齡、性別、家族有無精神疾病史、既往病史和現病史、失眠及便秘等情況的調查。

1.4 聚合酶鏈反應擴增及測序

使用正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGAG-GCAGCA-3′)和反向引物806R(5′-GGACTA-CHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌16S rRNA基因V3-V4區域進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增。PCR體系包含 5 μL 緩沖液(5×),0.25 μL快速pfu DNA聚合酶(5 U/μL),2 μL(2.5 mmol/L)dNTPs,1 μL(10 μmol/L)正向和反向引物,1 μL DNA模板和14.75 μL ddH2O。反應條件為98 ℃初始變性5 min,98 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s的25個循環,最后在72 ℃延伸5 min。用Vazyme VAHTSTM DNA清潔珠(南京Vazyme)純化PCR擴增子,并使用Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測試劑盒(美國Invitrogen)進行定量。擴增子經量化匯集后,使用Illumina NovaSeq平臺和NovaSeq 6000 SP試劑盒(500個循環)進行成對端2×250 bp測序。

1.5 生物信息學分析與統計

使用DADA2進行引物去除、質量過濾、拼接和嵌合體去除,并使用QIIME2進行評估。使用Vsearch(v2.13.4_linux_x86_64)在97%的相似度水平上對測序讀數進行映射。參照Greengenes數據庫(Release 13.8, http://greengenes.secondgenome.com/)對獲得的運算分類單元(operational taxonomic unit, OTU)數據進行分析。使用QIIME2調用mafft和FastTree構建系統發育樹。在OTU水平上使用了Chao1指數、ACE指數、Shannon指數和Simpson指數分析物種Alpha多樣性。使用Unifrac距離進行主坐標分析。使用QIIME2統計特征表來分析門和屬水平的物種組成。使用線性判別分析(LEfSe)來分析樣本間存在的差異微生物(Kruskal-WallisP值小于0.05,LDA得分閾值大于2.0)。R(4.0.0版)用于心理量表和樣品的OTU豐度的Pearson相關分析及可視化。使用SPSS 16.0 進行數據分析,采用Kolmogorov-Smirnov來檢驗數據的正態性,采用t檢驗和Wilcoxon檢驗來評價數據差異的顯著性,雙側P<0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況統計

健康組與抑郁癥組男女比例均接近1∶1,抑郁癥組年齡為29.00±8.09歲,健康對照組年齡為34.65±4.44歲。抑郁癥組出現失眠和便秘情況的比例分別達到了79.0%和57.9%,而健康組失眠和便秘比例分別為10%和15%,兩組失眠與便秘狀況的構成比差異具有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 一般情況統計

2.2 微生物結構分析

2.2.1 腸道菌群多樣性分析Alpha多樣性稀釋曲線顯示,兩組樣本的測序量都達到了飽和,多樣性指標趨于穩定(見圖1A)。抑郁癥組與健康對照組Chao1指數與ACE指數的差異無統計學意義(P=0.547 5,P=0.493 8),即兩組腸道微生物樣本的群落豐富度無顯著差異。兩組Shannon指數與Simpson指數的差異也無統計學意義,表明兩組被試腸道微生物群落的多樣性沒有顯著差異(見表2)。使用Unifrac距離算法對比兩組樣本的Beta多樣性,健康組樣本分布較為集中,抑郁癥組樣本較為分散,兩組樣本點重合度較低,提示了兩組被試腸道微生物群落構成存在差異(見圖1B)。

A: Alpha多樣性稀釋曲線,紅色為抑郁癥組,藍色為健康組;B: Beta多樣性主坐標分析(PCoA);C: OUT聚類維恩圖;D～E: 門/屬水平微生物堆積柱狀圖;F: LEfSe差異微生物群的LDA柱狀圖。

表2 腸道微生物Alpha多樣性

2.2.2 腸道菌群物種組成分析聚類分析顯示,健康對照組和患者組樣本中檢測到68個共有OUTs(見圖1C)。健康組與抑郁癥組在門水平結構組成相似,主要為厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)(見圖1D)。與抑郁癥組相比,健康組厚壁菌門和放線菌門的相對豐度更高,而變形菌門和擬桿菌門的相對豐度較低。兩組樣本在屬水平的物種組成上也體現出明顯差異。樣本豐度均值比較顯示,抑郁癥組布勞特氏菌屬(Blautia)、芽殖菌屬(Gemmiger)、巨單胞菌屬(Megamonas)和埃希菌屬(Pseudescherichia)明顯高于健康組(見圖1E)。LEfSe分析展示了兩組樣本中具有顯著差異的標志性物種,以LDA>2為閾值在健康組中共篩選到15個差異微生物類別,分別為糞球菌屬(Coprococcus),醋弧菌屬(Acetivibrio),Int～estinimonas,瘤胃球菌科(Ruminpcoccaceae),Harryflintia,芽孢桿菌目(Bacillales),毛螺菌屬(Lachnospira),Peptacetobacter,羅賓遜貝屬(Robinsonella),Acetanaerobacterium,韋氏非滲透桿菌屬(Dysosmobacter),伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia),Cloacibacillus,Vallitalea和Paoillibacter。在抑郁癥組中共篩選到6個標志性物種,分別為大芬戈爾德菌屬(Finegoldia), 干酪乳桿菌 (Lactobacilluscasei), 腸桿菌目(Enter～obacterales),腸桿菌科(Enterobacteriaceae), 紡錘鏈桿菌屬(Fusicatenilbacter),和梭狀芽孢桿菌(Clostridia)(見圖1F)。

2.3 抑郁量表與微生物組相關分析

在PHQ-9和GAD-7總分的比較中,抑郁癥組和健康組得分的差異有統計學意義(P<0.001,見圖2A)。為調查腸道微生物與心理健康狀況的相關性,結合兩組具有顯著差異的18種微生物類別與心理評估量表總分進行Pearson相關分析,可知健康組富集到的類球菌屬(Coprococcus)與GAD-7總分呈顯著負相關(P<0.05),Peptacetobacter與PHQ-9總分存在顯著正相關(P<0.05,見圖2B),其余差異微生物與兩種量表分別呈現出不同的相關性,但不具有統計學意義。

A: 抑郁癥組與健康組的PHQ-9和GAD-7量表總分直方圖,***P<0.001;B: PHQ-9和GAD-7總分與LEfSe差異微生物的Pearson相關性分析,*P<0.05。

3 討論

為盡可能減少影響菌群的變量因素的干擾,本研究以菌群結構相對穩定的青年人(20～45歲)為研究對象,限于嘉定地區,并排除了軀體疾病和抗生素、益生菌等對菌群的干擾進行研究。本研究共收集到19例抑郁癥患者和20例健康人的糞便樣本,經16S rRNA高通量測序和生物信息學分析顯示,與健康人相比,抑郁癥患者存在腸道菌群失衡。抑郁癥組與健康組的微生物α多樣性的差異無統計學意義,而β多樣性體現出了明顯的分群(PC1解釋度為22.96%,PC2解釋度為20.49%)。菌群物種組成分析表明,兩組樣本在門和屬分類水平的構成和相對豐度均存在差異,抑郁癥組的腸道菌群結構和組成均出現了顯著的變化。進一步的標志性物種分析顯示,抑郁癥組的糞便樣本中富集了腸桿菌科(Enterobacteriaceae)[6]和大芬戈爾德菌屬(Finegoldia)[7]等炎癥相關的微生物。炎癥激活被認為是抑郁癥和焦慮癥發病機制中重要的一環,重性抑郁障礙患者在急性期促炎因子水平較高[8],而腸道微生物群的特異性變化以及由此產生的促炎級聯反應可能誘發了抑郁癥的免疫失調[9],在疾病發生發展中具有重要作用。此外,全身系統性炎癥反應或外周炎癥信號可以通過血腦屏障傳遞進入中樞神經系統[10],細菌代謝物的浸潤也會直接或間接誘導中樞神經系統的炎癥激活,進而造成腸腦軸的功能失調[11],可成為精神疾病的病理生理學基礎。因此,腸道微生物群的失衡可能參與了抑郁癥的發病機制,針對特異微生物靶點的干預或許可以有效控制抑郁癥患者體內的炎性狀態。

本研究在對心理健康狀況與標志性微生物的相關分析中發現,健康組富集的糞球菌屬(Coprococcus)與焦慮狀況呈顯著負相關,抑郁癥患者樣本組中并未富集到糞球菌,這與近期研究的結論相似[12]。有研究報道,抑郁癥患者在接受治療后,其糞便中糞球菌的比例顯著增高[13],而糞球菌的豐度與良好的臨床治療表現明顯正相關[14],因此糞球菌的相對豐度或可作為抑郁癥臨床轉歸的微生物預測指標。其他類似研究多以自然隊列為研究對象,然而影響菌群的變量較多,導致難以發現與抑郁癥本身相關的菌群特征。本研究盡可能排除影響菌群的潛在混雜因素,從而更容易獲得與抑郁癥本身相關的菌群結構特征。此外,由于研究樣本量有限,且抑郁癥樣本組存在便秘的患者比例較高,因此這種基線差異可能對健康人與抑郁癥患者腸道微生物狀態的比較產生潛在影響。綜上所述,本研究發現了腸道微生物結構失調與抑郁癥的相關性,并提出了治療抑郁癥的潛在微生物靶點,為抑郁癥的治療和干預提供了相應的依據。