基于鐵死亡相關基因表達構建肝細胞癌患者臨床預后模型

趙爽，熊號峰，侯斐，張譯之，亢倩，孫麗瑩

（首都醫科大學附屬北京友誼醫院重癥肝病科，肝病中心，首都醫科大學附屬北京友誼醫院肝臟移植中心，首都醫科大學附屬北京友誼醫院國家消化系統疾病臨床醫學研究中心，北京 100091）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝臟惡性腫瘤，約占原發性肝癌的75%～85%，是癌癥死亡的第四大原因［1］。盡管手術切除、消融、栓塞、靶向藥物治療、免疫治療、化療等各種治療手段越來越多，但肝細胞癌患者的生存率仍然很低，由于治療耐藥和腫瘤復發，5 年生存率仍低于20%［2］。肝移植是肝細胞癌根治性治療手段之一，中國肝移植注冊中心數據顯示：2018 — 2020 年國內肝移植數量平均6000 例/年，其中肝癌肝移植占比35%［3］。肝細胞癌是一種高度異質性疾病，這使得預后預測具有挑戰性。在個體水平上評估死亡風險仍然很困難，因此臨床迫切需要建立一個可靠的預測模型來進行風險分層和預后預測。

鐵死亡是一種鐵依賴性的，區別于細胞凋亡、細胞壞死、細胞自噬的新型細胞程序性死亡方式，由脂質過氧化驅動［4-5］。鐵死亡的核心事件包括鐵積累增加、脂質修復系統受損和脂質過氧化，最終導致膜破壞和細胞死亡［6］。誘導鐵死亡已成為引發癌細胞死亡的有希望的治療方法，特別是對于對傳統治療有抗藥性的惡性腫瘤［7-8］。

近年來，鐵死亡在肝臟疾病領域迅速受到關注，因為肝臟容易受到氧化損傷，鐵超載是大多數肝臟疾病的主要特征［9］。研究表明，鐵死亡在肝細胞癌中起著至關重要的作用，現有研究主要集中在索拉非尼誘導的鐵死亡及其潛在調節靶點。研究發現一些鐵死亡相關基因，如Rb［10］、NRF2［11］和MT1G［12］，可能會保護肝細胞癌抵抗索拉非尼誘導的鐵死亡。然而，鐵死亡相關基因是否與肝癌患者預后相關在很大程度上仍然未知。此外，鐵死亡與肝移植缺血/再灌注密切相關，研究者發現鐵過載可以加重移植后缺血/再灌注損傷，與肝臟對缺血/再灌注損傷的敏感程度有關［13］。因此，更深入地了解鐵死亡相關基因在肝細胞癌患者中的作用和相關機制可能有助于臨床實踐中的風險分層和個體治療選擇。

本研究分析了鐵死亡相關基因的預后能力和鐵死亡影響HCC 預后的潛在機制，并對肝移植后缺血/再灌注損傷中鐵死亡相關基因表達變化進行了初步探討。我們構建了基于鐵死亡相關基因的風險模型來評估HCC 的預后，旨在幫助促進肝細胞癌患者的分級和個體化治療。

1 資料與方法

1.1 研究對象：HCC 患者的肝組織轉錄數據和相應的臨床信息從TARGET 數據庫下載［14］。共收集358 個HCC 樣本肝組織轉錄組數據及相匹配的臨床信息，包括生存時間、生存狀況、年齡、性別和TNM分期。鐵死亡相關基因集從FerrDb 數據庫獲取。5 例無缺血肝移植［15］和5 例傳統肝移植患者的肝穿組織轉錄組數據（GSE113024）從GEO 數據庫下載。

1.2 HCC 患者分子亞群的鑒定：行單變量Cox 回歸以篩選與HCC 總生存期相關的基因。然后與鐵死亡相關基因集取交集，篩選出與預后相關的鐵死亡相關基因，最后根據預后相關鐵死亡基因的表達矩陣使用共識聚類進行聚類分析。并根據一致性累積分布函數圖和曲線下面積圖以及樣本聚類一致性分析選擇確定聚類數。

1.3 差異表達基因的篩選及通路分析：使用R 包“Limma”進行微陣列數據線性模型分析，以識別亞組之間的差異表達基因［16］。隨后，使用R 包“cluster Profiler”基于差異表達基因進行KEGG 通路富集分析。

1.4 建立風險預測模型：使用“glmnet”R 包基于前面篩選的鐵死亡預后相關基因進行LASSO-Cox回歸［17］。根據最小λ 確定風險預測模型的候選基因。然后進行多變量Cox 回歸以篩選構建模型的基因。風險模型最終提供風險評分，根據中位數將患者分為高風險組和低風險組。通過繪制列線圖以可視化該風險預測模型，并繪制時間相關受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）和校準曲線，以評估預測效率并驗證模型的準確性。

1.5 統計學分析：使用R studio（版本4.0.3）和GraphPad 進行統計分析。對于正態分布數據，應用student's t 檢驗，對于非正態分布數據，使用Wilcox 檢驗。分類數據采用χ2檢驗。使用Kaplan-Meier 方法進行生存分析。使用對數秩檢驗計算生存時間差異的顯著性。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基于鐵死亡相關基因的HCC 分子亞群一致性聚類：為了研究鐵死亡相關基因在HCC 患者中的預后意義，我們使用TARGET 數據庫中358 個HCC 患者肝組織轉錄組數據，通過單因素Cox 回歸篩選出了與預后相關的基因，再通過與鐵死亡相關的基因的交集，共篩選到153 個與HCC 預后有關的鐵死亡相關基因。

一致性聚類是一種為確定數據集中可能的聚類數量和成員提供定量證據的方法，可以發現具有生物學意義的聚類，并廣泛應用于癌癥分子亞類鑒定?；谏鲜龊Y選出的153 個預后相關鐵死亡相關基因進行了一致性聚類。綜合分析一致性累積分布函數圖、曲線下面積圖以及樣本聚類一致性圖，選擇了聚類數k=2，將患者分為了兩個亞組（C1、C2）（圖1 A-D）。熱圖顯示，兩個分子亞群之間鐵死亡相關基因的表達顯著不同（圖1E）。更重要的是，生存分析圖表顯示，兩組之間患者總生存期有顯著差異（圖1F，表1），兩組之間年齡、性別沒有明顯差異（表1）。這些結果表明，鐵死亡相關基因可以將HCC 患者分為兩個具有不同總生存期的分子亞組。

表1 肝癌患者兩個分子亞組的一般資料對比

圖1 基于鐵死亡相關基因的肝細胞癌分子亞群的一致性聚類分析

2.2 基于兩個分子亞組之間的差異表達基因的通路富集分析：我們進一步分析了兩個分子亞組之間的差異表達基因，以進一步探索鐵死亡相關基因參與肝細胞癌預后的可能機制?；鹕綀D顯示了差異倍數＞1.5 倍，P ＜0.05 條件下兩組之間的差異表達基因（圖2A）。

圖2 兩個分子亞組之間的差異表達基因

我們進一步對兩個分子亞組之間的差異表達基因進行了KEGG 通路富集，結果表明富集到Th1 、Th2、Th17 細胞分化、T、B 細胞受體信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、細胞周期、炎癥介質調節、膽汁分泌等KEGG 通路（圖2B）。上述結果提示鐵死亡相關基因可能通過影響患者免疫微環境及膽汁酸代謝參與肝細胞癌的預后轉歸。

2.3 構建模型的鐵死亡基因篩選：為了構建風險模型，我們評估了肝細胞癌患者中差異鐵死亡相關基因的預后預測能力。LASSO-Cox 回歸將12 個LMRG 確定為風險模型的潛在候選者（圖3A B）。隨后我們通過多變量Cox 回歸從其中確定了6 個基因（KLF2、MYCN、FZD7、PRDX6、HILPDA、SLC7A11）作為風險模型的最終基因組合（圖3C）。最后，我們構建了預后風險模型如下：Risk Score = 0.29667926×MYCN -0.4078465×KLF2+0.3 7424548×FZD7+ 0.45779341×PRDX6+0.30693856×HILPDA+0.26201538×SLC7A11。該模型總體的預后差異顯著性logtest=1.47071078672503e-13，sctest=1.4790442467149e-17，waldtest=5.11123236475942e-16，C-index 為0.747596243085719。

圖3 建立基于鐵死亡相關基因的風險模型

上述研究結果表明，基于鐵死亡基因構建的風險模型可以將HCC 患者分為具有不同總生存期的高風險和低風險組（圖3 D、E）。如圖3D 所示，MYCN、FZD7、PRDX6、HILPDA 和SLC7A11 的表達隨著風險評分的增加而升高，而KLF2 的高表達預測HCC 患者的死亡風險較低。

2.4 風險模型在不同臨床亞組中均可以預測肝細胞癌患者的死亡風險：我們進一步評估了該風險模型在HCC 患者不同臨床亞群中的預測能力。我們發現，該風險模型在不同性別、年齡、TNM 分期的患者中所區分出的高風險組和低風險組的生存率有明顯的差異（圖4）。研究表明，構建的風險模型在不同的臨床亞組中表現出可靠的預測能力。

2.5 預測模型可視化及評價：我們使用列線圖對預測模型進行了可視化（圖5A）。并對模型進行了校準分析，以評估列線圖的預測準確性，結果顯示預測和觀測數據之間存在一致性（圖5B）。ROC 曲線顯示：1、3、5 年的曲線下面積分別為0.81、0.83、0.89（圖5C）。這些結果表明，我們構建的基于鐵死亡相關基因的預測模型可以較好地預測HCC 患者的死亡風險。

圖5 列線圖的構建和模型評價

2.6 肝移植缺血/再灌注中鐵死亡相關基因表達差異：我們進一步分析了無缺血肝移植和傳統肝移植患者肝穿組織差異表達基因，以研究鐵死亡相關基因在缺血/再灌注損傷中表達的變化。熱圖顯示了差異倍數＞1.5 倍，P ＜0.05 條件下兩組之間的鐵死亡相關差異表達基因（圖6）。

圖6 缺血/再灌注損傷中鐵死亡相關基因的差異表達

3 討 論

HCC 是一種侵襲性癌癥，病死率高，仍然是一個全球性的健康威脅。在這項研究中，HCC 患者被分為兩個基于鐵死亡基因的分子亞組，并構建了基于鐵死亡相關基因的HCC 預后預測風險模型，有助于HCC 的分級診斷和治療。

作為一個新的領域，腫瘤中的鐵死亡在過去幾年中受到了關注，越來越多的證據表明其可以影響腫瘤的發病和進展。我們基于鐵死亡相關基因使用共識聚類法確定了HCC 患者的兩個分子亞群，兩個亞群有明顯不同的生存率。我們的結果表明，鐵死亡基因表達的失調可能與HCC 患者預后有關。

為了進一步闡明鐵死亡參與HCC 預后的潛在機制，我們對兩個分子亞群的差異表達基因集行了KEGG 通路富集分析，并富集到了Th 細胞分化、T、B 細胞受體等免疫相關通路及膽汁酸代謝通路。微環境中的免疫相關細胞對HCC 的發展和進展有重大影響，并受到越來越多的關注［18］。先前的研究發現，肝臟中浸潤的記憶B 細胞［19-20］、Th17［21］和Th2［22］的豐度增加與HCC 的不良預后相關。Th2 細胞因子抑制腫瘤監視［23］，而Th17 細胞具有促進HCC 發展的潛力［22］。另外，膽汁酸代謝的穩態對保護肝臟至關重要［24］，使BAs 成為肝臟疾病的潛在生物標志物［25］。越來越多的證據表明，膽汁酸代謝與肝細胞癌的進展和預后有關［26-29］。膽汁酸水平的改變不僅會導致代謝紊亂、肝臟炎癥、氧化應激和纖維化，還會引起對凋亡的抵抗，從而促進腫瘤發生和進展［30］?；谏鲜鼋Y果，我們推測鐵死亡可能會通過改變HCC 的免疫微環境及影響膽汁酸代謝，從而參與HCC 的臨床轉歸。

為了進一步驗證鐵死亡對HCC 預后的預測潛力，我們篩選了6 個鐵死亡相關基因（KLF2、MYCN、FZD7、PRDX6、HILPDA、SLC7A11） 構建了一個風險預測模型，并使用列線圖進行模型的可視化。列線圖的校準分析及ROC 曲線結果表明該基因對HCC 預后具有較好的預測能力。另外，該風險模型在不同性別、年齡、TNM 分期和腫瘤狀態的HCC 患者中均可以較好預測患者的死亡風險。這些結果表明，我們構建的基于鐵死亡相關基因的預測模型可以較好地預測HCC 患者的死亡風險。

肝移植是HCC 根治性治療手段之一，肝移植后再灌注損傷可能導致嚴重并發癥，如移植后肝功能衰竭、缺血性膽道病變和再灌注后綜合征等。鐵死亡與肝移植缺血/再灌注損傷密切相關，鐵過載是肝移植后肝損傷的獨立危險因素［13］。我們的研究發現肝移植后缺血/再灌注損傷中存在明顯的鐵死亡相關基因表達改變。因此，HCC 患者鐵死亡相關基因表達，有望成為評估患者對缺血/再灌注損傷敏感性和移植后缺血/再灌注損傷嚴重程度的新指標。

本研究存在一定的局限性。首先，預測模型需要進一步的在更大的隊列及前瞻性隊列中進行驗證，其次，鐵死亡影響HCC 預后的具體機制還有待進一步的闡明。最后，對于鐵死亡相關基因在肝移植缺血/再灌注損傷中發揮的作用及機制還需進一步的研究。綜上所述，我們基于鐵死亡相關基因構建了臨床預后風險模型，并初步探索了鐵死亡參與HCC 預后的可能機制以及在肝移植后缺血/再灌注損傷中的表達變化。進一步探索鐵死亡參與HCC 預后的潛在機制以及其在肝移植后缺血/再灌注損傷中的作用，可能發現HCC 治療和肝移植后缺血/再灌注損傷治療的新靶點。