鈦酸鉀晶須改性PMMA 的生物相容性研究

黃天意，高 海，夏 鴻，邱 瀅

（荊楚理工學院醫學部，湖北 荊門 448000）

0 引言

聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）是一種常用于口腔修復的高分子材料，具有價格便宜、可操作性強、可接受的美學性能和生物相容性等優點。 但是由于PMMA 修復體長期處于口腔這個特殊的微環境，唾液浸泡疊加多變的咬合力刺激，修復體破損、折裂的情況屢見不鮮。

晶須是一種在人工調控下具備固定尺寸比例的短纖維，具有高彎曲強度和彈性模量等優點，因此常被用作增強劑以改善復合材料的物理、機械性能［1］。 鈦酸鉀晶須分子式寫作K2O·nTiO2（n=1，2，4，6，8），其物理化學性質、結構會隨著n 值不同而發生變化。 其中當n=6 時，形成的六鈦酸鉀晶須（K2O·6TiO2）加工性價比較高且性質優良， 是選擇優先級較高的復合材料增強劑之一， 本文選擇的鈦酸鉀晶須亦是K2O·6TiO2［1-2］。 六鈦酸鉀晶須具有特殊的隧道式結構，化學性質穩定，已有多項研究證實利用其增強的復合材料相比于原材料機械強度有顯著提升［3-5］。 但是鈦酸鉀晶須尺寸細微，具有較高的比表面積和表面能，致其相比于普通纖維更不容易均勻分散到基質中，因此學者們常采用表面處理的方法彌補這一缺陷，期望可使復合材料機械強度進一步提升［3，6］?；诖?，在前期實驗中本課題組嘗試采用硅烷偶聯劑對鈦酸鉀晶須進行表面處理，之后將其導入PMMA 中，證實所得鈦酸鉀晶須改性PMMA 材料的彎曲強度和彈性模量可顯著上升［3］。

生物相容性是醫療器械進入臨床應用前需要考察的重要指標之一。 PMMA 已進入臨床多年，多項研究證實其具有可接受的生物相容性， 但實際應用中其單體聚合不完全等因素仍可能引起口腔組織損傷［3,7-8］。而關于鈦酸鉀晶須在生物相容性方面的報道也層出不窮，Qi Yumin 等［9］發現成骨細胞可在鈦酸鉀生物薄膜上正常生長增殖，但Abdelgied M 等［10-11］和Horie M 等［12］等人分別通過體外、體內實驗證實鈦酸鉀晶須刺激可引起細胞內多種炎性因子過表達，進而引發炎癥反應。鑒于本實驗合成采用的原料均有引起細胞損傷的可能，且鈦酸鉀晶須的加入是否可能導致PMMA 單體滲出增多，進而加重細胞損傷等問題暫不明確， 本實驗期望通過探究鈦酸鉀晶須改性PMMA 材料對L929 細胞細胞增殖與氧化損傷的影響，初步探究其生物相容性，為未來可能的臨床應用打下基礎。

1 儀器和材料

1.1 主要儀器

QM-3SP2 型行星式球磨機（南京大學儀器廠）； 電熱恒溫水浴箱（上海精宏實驗設備有限公司）；KQ320ODB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；SW-CJ-1F 型單人雙面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；電子天平（Precisa）；CO2恒溫培養箱（SANYO，日本）；酶標儀（Rayto，美國）離心機（Eppendorf，美國）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，日本）。

1.2 主要試劑

日進“自然”系列PMMAⅡ型粉1R 仿生物色（日進齒科材料有限公司劑）；硅烷偶聯劑KH-570（南京創世化工助劑有限公司）；K2O·6TiO2鈦酸鉀晶須（上海凱射豐實業有限公司）；冰醋酸（山東德彥化工有限公司）；無水乙醇（山東德彥化工有限公司）；H-DMEM 液體培養基（Gibco，美國）；青霉素鏈霉素溶液（PAA，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；胰蛋白酶（Hyclone，美國）；MTT 試劑盒（Amresco，美國）；DCFH-DA（上海貝博生物技術有限公司）。

1.3 細胞系

小鼠成纖維細胞L929 細胞系（上海中科院）。

2 實驗方法

2.1 鈦酸鉀晶須表面處理

把無水乙醇和蒸餾水按照9∶1 的質量配比混合，使用冰醋酸調節混合溶液至pH=4，以5%的質量分數將KH-570 加入混合液，超聲震蕩約30 分鐘使KH-570 預水解。 以質量比1∶5 將鈦酸鉀晶須溶于蒸餾水中，震蕩，快速攪拌使之均勻分散為懸濁液。 保持攪拌速度不變的同時向懸濁液中加入已預水解的KH-570，配比為鈦酸鉀晶須質量的3%。繼續攪拌15min 后靜置30min，過濾去上清液后置于50℃烘箱干燥1d，打散，鈦酸鉀晶須表面處理完成。

2.2 試件制作

把上述經過硅烷偶聯劑表面處理的鈦酸鉀晶須以10%的質量分數配比加入PMMA 粉母料中，置入球磨儀持續研磨1h 使二者均勻混合，作為改性材料實驗組，PMMA 母料為PMMA 對照組。 按照原母料說明書，在室溫約23℃左右條件下，按規定粉液比例將兩組粉末與單體均勻混合，在面團期壓入標準模具（25mm×5mm×2mm），待其硬固后取出，打磨拋光，備用。

2.3 浸提液制備

將兩組試件分別超聲清洗30min 后，轉移至超凈臺中，分別置于做好標記的6 孔板中加75%乙醇浸泡35min，無菌PBS 沖洗3 遍，紫外燈照射大于1h，待兩組試件自然干燥。 按照浸提液制取標準，以1 g/5mL 的比例，加入提前配制的培養基（DMEM 高糖培養基+10%胎牛血清+1%雙抗），置于恒溫培養箱（37℃、5%CO2）內，24 小時后收集培養基即為兩組試件浸提液，標記并置于4℃冰箱保存。

2.4 實驗分組

陰性對照組：DMEM 高糖培養基+10%胎牛血清+1%雙抗；

PMMA 組：PMMA 試件浸提液；

改性材料組：鈦酸鉀晶須改性PMMA 材料試件浸提液。

2.5 細胞培養

實驗對象選取小鼠成纖維細胞（L929），取凍存，復蘇，使用DMEM 高糖培養基+10%胎牛血清+1%雙抗在恒溫培養箱（37℃、5%CO2）中連續培養。24h 換液一次。換液前觀察細胞活力與生長狀態，當細胞密度達到約80%～85%時，進行傳代培養。

2.6 細胞增殖檢測

選取對數生長期L929 細胞，接種至96 孔板中，每孔約3×103個細胞，每組6 個重復孔，放回原恒溫培養箱中過夜培養。 待細胞貼壁狀態良好，更換各組培養液為浸提液，共培養24h。 檢測之前，吸棄原有浸提液，每孔加入混有20μLMTT 試劑的DMEM 高糖培養基200μL（含10%血清和1%雙抗），放回原恒溫培養箱繼續培養4h，之后小心吸棄孔中液體，PBS 漂洗后加入150μL 二甲基亞砜，震蕩10min，待每個孔溶液顏色穩定時，使用熒光酶標儀檢測在490nm 波長下的吸光度（OD）值。

2.7 ROS 檢測

選取對數生長期L929 細胞，將細胞接種至黑壁（防止孔壁熒光滲漏）96 孔板中，每孔約2×104個細胞，每組6 個重復孔，放回原恒溫培養箱中繼續培養24 小時。吸棄原有培養基，加入各組浸提液，再次放回原恒溫培養箱繼續培養24h。 吸棄孔中液體，PBS 洗滌兩次，每孔加入10μM 的DCFH-DA，放回原培養箱避光處理30min，PBS 洗滌細胞3 次，使用熒光酶標儀檢測熒光強度（激發波長488 nm；發射波長525nm）。

2.8 統計學分析

每個實驗重復3 次以上，數據采用均值±標準差表示。 并使用SPSS Statistics22 進行數據分析，采用單因素方差分析、S-N-K 和LSD 檢驗，比較各組之間是否存在差異，當P<0.05 時，說明存在統計學差異。

3 實驗結果

3.1 不同浸提液染毒L929 細胞后細胞增殖結果

MTT 法檢測細胞增殖是對材料細胞毒性評價最常用的指標之一，簡而言之，我們可以通過所得OD值的大小判斷細胞數目的多少。 按照公式：細胞增殖率=（各組平均OD 值/陰性對照組的平均OD 值）×100%計算細胞增殖率，各組各組相對OD 值、細胞增殖率(%)和毒級如表1 所示。

表1 各組相對OD 值、細胞增殖率(%)和毒級表

由表1 可知，PMMA 組和改性材料組的細胞增殖率相對于陰性對照組都有所降低，依次為84.7%、85.3%，但根據ISO 標準，細胞毒性為0 級。 進一步通過單因素方差分析，發現兩組與陰性對照組之間存在顯著的統計學差異（P<0.001），但PMMA 組和改性材料組之間無統計學差異（P>0.05）。

3.2 不同浸提液染毒L929 細胞后ROS 檢測結果

使用DCFH-DA 探針檢測各組浸提液作用于L929 細胞后ROS 表達量變化， 以陰性對照組為標準計算ROS 相對表達量：相對表達量=（各組平均熒光強度/陰性對照組的平均熒光強度）×100%，結果如表2 所示。

表2 ROS 相對表達量表

由表2 可知，PMMA 組和改性材料組相比于陰性對照組分別增加45.9%、37.8%，通過進一步統計分析，發現兩組與陰性對照組之間的差異有顯著的統計學意義（P<0.001），但PMMA 組和改性材料組之間無統計學差異（P>0.05）。

4 討論

近年來，關于口腔修復新材料的報道層出不窮，例如聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯等，但是PMMA 仍然是在口腔修復臨床治療中使用頻率最高的義齒基托材料之一［13-14］。 面對PMMA 仍然存在少許瑕疵這個現實問題，眾多學者嘗試利用納米銀粒子、石墨烯、納米金剛石等物質對其進行改性，期望達到錦上添花的效果［15］。 本課題組前期實驗嘗試利用鈦酸鉀晶須強化PMMA，成功合成復合材料并證明在鈦酸鉀晶須質量分數為10%時復合材料機械強度達到峰值［3］。為深入研究復合材料的性質，本研究嘗試利用其浸提液與L929 細胞共培養，探究其對L929 細胞增殖及氧化損傷的影響，進而論證鈦酸鉀晶須改性PMMA 的生物相容性。

本研究通過MTT 法檢測了鈦酸鉀晶須改性PMMA 材料對L929 細胞增殖的影響， 參照標準（ISO 10993-5）： 經計算后細胞增殖大于75%認定為無細胞毒性，50%～75%為細胞毒性輕微，25～50%為中度的細胞毒性，小于25%為高度細胞毒性。本次實驗PMMA 組和改性材料組細胞增殖率均大于75%，證明其無細胞毒性。關于PMMA 的細胞毒性評級，與Zhou Wen 等［16］和Salim S A 等［17］研究結果一致，但Jiao Yang 等［18］卻認為PMMA 存在細胞毒性，初步分析可能是由于實驗采用的PMMA 母料或細胞株不同導致的實驗結果差異； 與之相似的是本次實驗PMMA 組和改性材料組均與陰性對照組有顯著差異 （P<0.001），說明其對L929 細胞增殖確有抑制作用，只是暫未達到細胞毒性的范疇。

ROS 在機體內有多種表現形式，例如羥自由基（·OH）、超氧陰離子、過氧化氫（H2O2）等，其在細胞和機體的各種生理和病理調節過程中扮演著重要角色［19-20］。 ROS 可分為內源性和外源性，正常情況下，細胞自身產生的ROS 為內源性ROS，如線粒體氧化磷酸化過程中產生的ROS，而因治療、環境暴露等因素而增加的ROS 一般為外源性ROS［20］。 相對低水平的內源性ROS 可作為第二信使激活某些酶促反應或轉錄因子，調控細胞的代謝，促進細胞增殖。 但某些外源性ROS 常超出機體緩沖能力，可通過非酶促糖基化作用介導脂質過氧化、DNA 和蛋白質等大分子損傷［21-22］。 研究發現PMMA 浸提液刺激可使細胞ROS 生成顯著增加，與Zhang Yu 等［7］實驗結果一致，說明PMMA 可能存在潛在的致炎能力。 與此同時，改性材料組也顯示出ROS 水平顯著上升（P<0.001），但與PMMA 組無統計學差異，說明鈦酸鉀晶須的加入對原PMMA 材料的致炎能力無明顯影響。

綜上所述，使用經硅烷偶聯劑表面處理的鈦酸鉀晶須改性PMMA 材料，在不影響其生物相容性的基礎上，顯著地提升了復合材料的機械強度，表明鈦酸鉀晶須改性PMMA 材料具有一定臨床應用的潛力。