復方石斛總黃酮提取及活性研究

馬 丹，尚書游，陳欣雨，付佳欣，阮 軍

（1.荊楚理工學院農業生物技術研究所，湖北 荊門 448000；2.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430048；3.湖北聚瑞生物科技有限公司，湖北 荊門 431900）

0 引言

鐵皮石斛屬蘭科石斛屬多年附生草本植物，屬于石斛品種中的上品，味甘、微寒，歸胃、腎經，具有益胃生津、滋陰清熱之功效［1-2］。 2019 年11 月25 日，國家衛生健康委發文正式將鐵皮石斛納入國家藥食同源目錄中［3］，研究表明石斛中的黃酮類成分具有降血脂［4］、降血糖［5-6］、鎮靜［7］、抗氧化［8］、抗腫瘤［9］等功能。 將鐵皮石斛與其他藥食同源的中藥材組成復方進行功能性的研究成為時下熱點，史瑋琪［10］等用鐵皮石斛復方粉劑（由鐵皮石斛、黃芪、黨參、柴胡、溪黃草、陳皮組成）對羅非魚抗氧化性進行了研究。高大可［11］研究了鐵皮石斛復方制劑（由鐵皮石斛、丹參、西洋參、麥冬組成）的抗氧化性，發現鐵皮石斛復方制劑對DPPH 和羥自由基均有較好的清除作用， 在16.0mg/ml 質量濃度下對DPPH 和羥自由基清除率均達到60%。 鐵皮石斛復方制劑不僅具有較好的抗氧化活性而且還具有延緩衰老的潛在功能，李伯齊［12］的鐵皮石斛復方由鐵皮石斛、黃芪、當歸、枸杞、丹參、女貞子等配伍而成，試驗表明鐵皮石斛復方具有延緩衰老的作用。 本研究在傳統中醫藥理論的指導下將鐵皮石斛、黨參、黃芪、黃精四味藥食同源的中藥材組成復方［12-15］，黃芪與石斛聯用時具有協同作用，使抗氧化抗衰老等作用更有效［12］；石斛與黨參搭配，有健脾益肺、益氣養血之功效［16］。 石斛與黃精配合以突出“補氣滋陰，益脾潤肺，壯腎固精”之功效［17-18］；四味藥材均含有活性成分黃酮［19-22］，通過對復方石斛總黃酮的提取工藝優化，獲得較高提取率，并對提取物進行抗氧化活性和降糖活性測定，為藥食同源復方制劑的產品開發提供理論支持。

1 材料與儀器

1.1 材料

鐵皮石斛、黃芪、黨參、黃精：安徽省亳州市永和堂藥業有限責任公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、維生素C(VitaminC,VC)、氫氧化鈉、DPPH、ABTS、硫酸亞鐵、雙氧水、蘆丁對照品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司分析純； 秀麗隱桿線蟲野生型線蟲株系N2： 明尼蘇達大學秀麗隱桿線蟲遺傳學中心CaenorhabditisGeneticsCenter（CGC）；葡萄糖試劑盒、甘油三酯試劑盒、蛋白質（BCA）測定試劑盒：南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器

LD-96A 酶標儀：中國萊恩德智能科技有限公司；SPX-250B 生化培養箱：中國立辰科技有限公司；T6 新世紀紫外可見分光光度計：中國北京普析通用儀器有限責任公司；FA124 電子分析天平：中國上海力辰邦西儀器科技有限公司；大容量冷凍離心機：中國湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；臺式超聲波清洗機：中國寧波新芝生物科技股份有限公司。

2 試驗方法

2.1 復方石斛提取液的制備

首先將鐵皮石斛、黨參、黃芪、黃精進行冷凍干燥預處理，粉碎過80 目篩后，依據預實驗結果將復方石斛（鐵皮石斛-黨參-黃芪-黃精=2 ∶3 ∶3 ∶2）按比例混合均勻，放于干燥器中待用。 稱取混合粉末2.0g于圓底燒瓶中，按料液比1:20（g:ml）加入60%的乙醇，超聲提取30min，8000r/min 離心10min 得上清液，并用提取溶劑補至同一體積，即得復方石斛提取液。

2.2 蘆丁標準曲線的繪制及提取液總黃酮含量測定

參考劉玉明［23］的方法，稍作調整。 精密稱取蘆丁標準品0.032g，放入100ml 容量瓶中，加入60%的乙醇，超聲溶解并定容，即得蘆丁對照品貯備液溶液。分別量取蘆丁貯備液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml于25ml 容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，放置約6min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 ml，放置約6 min，加入4%氫氧化鈉溶液4ml，用60%乙醇定容，搖勻放置15 分鐘，在510nm 處測定吸光度。

以吸光度為縱坐標，蘆丁標準品溶液濃度為橫坐標繪制A~C 曲線。 對標準曲線進行線性擬合的回歸分析方程：y=12.592x-0.0015，相關系數R2=0.9993，表明樣品濃度在0.006~0.0362mg/ml 范圍內呈現較好的線性相關性。

取復方石斛提取液5ml，同標準曲線制備方法操作，測得吸光度值，代入標準曲線回歸方程計算總黃酮得率。

其中：x 為黃酮含量（mg/ml）；m 為混合干粉質量（g）；V 為提取液體積（ml）；y 為總黃酮得率。

2.3 單因素試驗

準確稱取2.00 g 混合粉末，固定提取溫度25℃，超聲功率200 W，分別在不同乙醇濃度（0%、30%、40%、50%、60%、70%)、不同提取時間（5、15、25、35、45、50min）和不同料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）條件下進行提取，分別考察乙醇濃度、提取時間、料液比對復方石斛總黃酮得率的影響。

2.4 響應面試驗設計

結合單因素試驗結果，根據Box-Behnken 設計原理，采用響應面法進一步優化復方石斛總黃酮提取工藝。 利用Design-Expert10.0 軟件以黃酮得率為響應值設計3 因素3 水平的實驗方案進行分析，響應面因素水平如表1 所示。

表1 響應面因素水平表

2.5 體外抗氧化活性測定

2.5.1 自由基清除能力測定

2.5.1.1 VC 溶液的DPPH 自由基清除率

精確稱取10.0 mg VC，純水溶解，定容至1000 ml 的VC 貯備液。 分別量取VC 貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml，用無水乙醇補足體積至2 ml，再加入2 ml 濃度為0.1 mmol/l 的DPPH 自由基乙醇溶液于試管中混勻，避光靜置30 min，以2 ml 無水乙醇代替VC 溶液作為空白，在波長517 nm 處測定吸光度值。 VC 溶液吸光度值記為A，空白對照吸光度值為A0。 VC 溶液的DPPH 自由基清除率（Y）計算公式如下：

以VC 溶液濃度C 為橫坐標，抑制率Y 為縱坐標，擬合直線方程，計算得到VC 的IC50（半抑制濃度）。

2.5.1.2 樣品的DPPH 自由基清除率

采用最優工藝提取復方石斛總黃酮， 所得提取液測定含量后， 分別吸取0.3、0.36、0.42、0.48、0.54、0.60 ml，用無水乙醇補足體積至2 ml，加入2 ml 0.1 mmol/l 的DPPH，避光靜置30 min 后在517 nm 處測定吸光度值A1，將前述各樣品溶液中的DPPH 用無水乙醇替代，測定吸光度為A2，2 ml 無水乙醇和2 ml DPPH 溶液測得吸光度A0，樣品溶液的DPPH 自由基清除率（Y）計算公式如下：

2.5.2 ABTS+自由基清除活性測定

2.5.2.1 ABTS+自由基工作液配制

取0.2 ml ABTS 二銨鹽儲備液（7.4 mmol/l）和0.2 ml K2S208 儲備液混合（2.6 mmol/l），黑暗環境下室溫放置12 小時，用無水乙醇將混合液稀釋40~50 倍直至吸光度為0.70±0.02，此溶液即為ABTS+自由基工作液。

2.5.2.2 樣品工作液配制

取樣品液（黃酮含量0.0328 mg/ml）10 ml 放入50 ml 容量瓶內，加入純水至刻度線，配成樣品工作液（6.56 μg/ml）備用。

2.5.2.3 VC 工作液配制

精密稱量10.0 mg 的VC，蒸餾水使其充分溶解后，定容至10 ml，再取1 ml VC 溶液定容至100 ml配成VC 工作液（10.0 μg/ml）備用。

2.5.2.4 VC 的ABTS+抑制率標曲的制備

依次取200 μL、250 μL、300 μL、350 μL、400 μL、450 μL VC 工作溶液于試管中，依次加入1800 μL、1750 μL、1700 μL、1650 μL、1600 μL、1550 μL 無水乙醇， 分別加入ABTS+自由基工作液2 ml 于試管中混勻，以無水乙醇作參比液，在波長734 nm 處測定吸光度A。 2.0 ml 無水乙醇和2.0 ml ABTS 自由基工作液混合均勻，測吸光度值A0，以VC 濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制回歸曲線。

2.5.2.5 樣品的ABTS+抑制率曲線制備

依次取200 μl、400 μl、600 μl、800 μl、1000 μl、1200 μl 樣品工作溶液于試管中，再依次加入1800 μl、1600 μl、1400 μl、1200 μl、1000 μl、800 μl 無水乙醇， 再分別加入ABTS+自由基工作液2 ml 于試管中混勻，以無水乙醇作參比液，在波長734 nm 處測定吸光度A。 以2 ml 無水乙醇和2 ml ABTS+自由基工作液混合均勻，測吸光度值A0，以樣品濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制回歸曲線。ABTS+自由基清除率（Y）計算公式如下：

2.5.3 羥基自由基清除率的測定

樣品工作液和VC 工作液配制方法同2.5.2， 依次取200μl、400μl、600μl、800μl、1000μl、1200μl 樣品工作溶液于試管中，加蒸餾水補足至2.0ml，加入500μlFeSO4(6mmol/l)，1000μlH2O2(6mmol/l)，充分振搖，放置10min；加入500μL 水楊酸（6mmol/l)，充分振搖，室溫放置30min。 510nm 處測定吸光度，重復3 次，取平均值，VC 作為陽性對照。

式中：A0 為空白對照，500μL 蒸餾水代替樣品；A1 為樣品吸光度，A2 為不加雙氧水的吸光度值。

2.6 復方石斛提取物對秀麗隱桿線蟲體內降糖活性的測定

2.6.1 線蟲藥物制備

按最優工藝得到的復方石斛提取液進行冷凍干燥得到干燥粉末， 分別稱取粉末， 加二甲基亞砜溶解，微孔濾膜過濾，制備成濃度為60、120、240mg/ml 的樣品溶液各三份，分別命名為60-1、60-2、60-3、120-1、120-2、120-3、240-1、240-2、240-3。

2.6.2 線蟲培養

采用液體培養法用96 孔板培養。 每孔加入100μlS-complete 培養基，其中設置僅含有2%D-葡萄糖的高糖對照組，以及添加不同濃度藥物和2%D-葡萄糖的高糖處理組。 培養線蟲至成蟲第三天，收集不同處理組的線蟲用M9 緩沖液洗3 次去除黏附的雜菌，在冰上充分研磨，再在4℃下10000rpm 離心5 min，按照葡萄糖、BCA 測定試劑盒說明書步驟測定線蟲勻漿液上清中葡萄糖、蛋白質含量，每個實驗重復三次。 按試劑盒測定步驟操作，得蛋白標準曲線方程為Y=0.0147x+0.1136（R2=0.9993），將測定的空白孔和樣本孔吸光度值代入標準曲線方程，得到各樣本蛋白質含量。 根據葡萄糖測試盒測定步驟操作，測定各空白孔、標準孔和樣本孔吸光度值，并代入下列計算公式得到葡萄糖含量。

2.7 數據處理

數據通過Design-Expert10.0 軟件和Excel 進行處理分析。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 不同料液比對黃酮得率的影響

考察不同料液比對復方石斛總黃酮得率的影響發現，隨著料液比從1∶15 到1∶35 變化時，黃酮得率隨著溶劑體積增加而增大。 在1∶35 時達到最大值2.33%，該復方石斛總黃酮得率略低于單一的紫皮石斛總黃酮提取率［24］。 但繼續增加溶劑體積為1:40 時其得率為1.99%，黃酮得率稍微降低。 這是因為溶質的溶出速率與濃度梯度呈正相關，濃度梯度越大，溶出速度越快，相同時間內溶出量越多。在相同料液比下，復方石斛總黃酮得率均高于鐵皮石斛花總黃酮得率［25］。 因此，在相同的提取時間內，隨著料液比的增加，濃度梯度增大，黃酮溶出增加。當料液比為1∶35 時大部分黃酮都已溶出，繼續增加溶劑的量，得率不再繼續增加。 因此選擇1 ∶30 與1∶40 為最低和最高水平進行響應面分析實驗。

圖1 不同料液比對黃酮得率的影響

3.1.2 不同醇濃度對黃酮得率的影響

考察不同乙醇濃度對復方石斛總黃酮得率的影響發現，隨著乙醇濃度的增加，復方石斛總黃酮得率在乙醇濃度為60%時達到最高，為2.54%。這是由于黃酮在植物中主要以苷的形式存在，分子有一定的極性，乙醇溶液隨濃度增加，極性減弱。當乙醇濃度增加到60%時，大多數黃酮處于這個極性范圍，溶出增加。 當繼續增加乙醇濃度，溶劑極性進一步降低，總黃酮溶出減少，而弱極性物質溶出增加。 也有可能是因為乙醇濃度增加導致細胞內蛋白質發生凝固，阻礙黃酮溶出［26-27］，因此60%乙醇為最佳值。

圖2 不同醇濃度對黃酮得率的影響

3.1.3 不同超聲時間對黃酮得率的影響

考察不同提取時間對復方石斛總黃酮得率的影響發現，5-35 min 時，隨提取時間增加，總黃酮得率增速較快。 在45 min 時達到峰值，50 min 時有所降低，該結論與唐靜月等［25］的研究結論相似。 表明提取時間少于45 min 時，黃酮在料液比1 ∶20(g:ml)的提取溶劑中未完全溶出。 同時由于黃酮中酚羥基易氧化，時間繼續延長，導致黃酮氧化后失去還原能力，含量測定時吸光度值變小，從而得率測定值下降。 綜合考慮選擇提取時間在30、40、50 min 進行下一步優化。

圖3 不同超聲時間對黃酮得率的影響

3.2 響應面試驗結果

3.2.1 響應面數據分析

根據單因素實驗的結果分析，運用Box-Behnken 響應面優化方法，設計3 因素3 水平試驗，對乙醇濃度A、超聲時間B、液料比C 這3 個因素進行優化，結果見表2、表3。

表2 響應面試驗設計及結果

表3 模型的顯著性檢驗及方差分析

用Design Expert10.0.1 進行實驗設計，優化出17 組試驗，進行回歸擬合得到復方石斛總黃酮得率的二次多項回歸方程為：Y=＋2.27 ＋0.19 A ＋0.54 B ＋0.13 C-0.15 AB －0.16 AC ＋0.11 BC －0.17 A2－0.13 B2－0.37 C2

分析二次多項回歸方程，一次項系數絕對值大小順序為：B>A>C，可得出影響復方石斛總黃酮得率的因素順序為超聲時間B>乙醇濃度A>液料比C。

由表3 可知，該回歸模型P<0.01，同時失擬項P=0.9693>0.05，失擬項無顯著性差異，回歸系數R2=0.9722,R2Adj=0.9366，說明該模型具有較高的可信度，回歸方程可以很好地預測復方石斛總黃酮提取的最佳工藝。

該模型中一次項乙醇濃度A、超聲時間B 和二次項C2的P 值均<0.01，一次項C、二次項AC 和A2的P 值<0.05。 說明乙醇濃度和料液比的交互作用對復方石斛總黃酮提取率有顯著影響，并且乙醇濃度和料液比這兩個因素對響應值的影響不是簡單的線性關系， 而是存在一定交互作用。 由三個因素的F值的大小可知，影響復方石斛總黃酮得率的因素順序是B（超聲時間）>A（乙醇濃度）>C（料液比）。而乙醇濃度和超聲時間的交互項AB、超聲時間和料液比的交互項BC 的P 值>0.05，說明這兩個交互項對結果影響不顯著。

響應面曲線的坡度陡峭程度可以反映各個影響因素對響應值的影響大小，響應面的坡度越陡峭，表明兩因素交互作用明顯；反之兩因素交互不明顯。由交互作用圖可知，AC 即料液比與乙醇濃度交互作用曲面最陡，因此其交互作用最為顯著，與方差分析結果一致。

圖4 復方石斛抗氧化能力交互作用圖

3.2.2 復方石斛總黃酮提取工藝驗證

通過Design-Expert 軟件對復方石斛總黃酮提取的優化試驗結果， 得出最佳提取工藝為當乙醇濃度為59.561%，超聲時間47.034 min，液料比為36.535 時，總黃酮提取率達到最大值2.613%。 根據表3的顯著性分析，為了方便試驗操作，將試驗條件修正為：乙醇濃度60%，超聲時間50 min，液料比為35，在該條件下重復三次試驗，總黃酮提取率平均為2.59%，與理論值接近。

3.3 復方石斛提取物體外抗氧化活性

3.3.1 DPPH 自由基清除能力

在最佳工藝條件下制備復方石斛提取液，配制梯度濃度后分別測定其DPPH 抑制率，測定結果見圖5。 通過擬合的直線方程計算出復方石斛提取液對DPPH 的IC50 為7.189 μg/ml，陽性對照組VC 測定結果IC50 為1.292 μg/ml，復方石斛提取液的抗氧化活性略遜于VC，但其仍具有可觀的清除能力。 隨著提取液濃度的增加，對DPPH 的抑制率也逐漸增強。當提取液濃度達到9.84 μg/ml 時，DPPH 自由基清除率為80.65%。 在相同濃度下該復方石斛提取液的DPPH 自由基清除能力優于高大可等[11]人的復方石斛提取液。

圖5 復方石斛和VC 對抗氧化活性的影響

3.3.2 ABTS 自由基清除能力

由圖6 可知，隨著樣品濃度的增加，其ABTS+自由基清除率緩慢增加。當抑制率為50%時，VC 濃度約為1.1340 μg/ml，樣品濃度約為1.288 μg/ml，可以看出，兩者對ABTS+的抑制活力比較相近。在一定濃度范圍內的同一濃度下，VC 的ABTS+自由基清除能力高于復方石斛提取液。 當樣品濃度為3.96 μg/ml時，抑制率達到93.95%。

圖6 ABTS 自由基清除能力

3.3.3 羥基自由基清除能力

由圖7 可以看出，當抑制率為50%時，VC 濃度約為1.079 μg/ml，樣品濃度約為1.468 μg/ml，二者對羥基自由基的抑制活性比較接近，但是VC 對羥基自由基清除效果更好。該結果與王林青等［28］人的研究結果一致。 當樣品濃度為3.936 μg/ml 時，對羥基自由基的抑制率達到了94.37%，表明復方石斛提取液具有較好的羥基自由基清除能力。

圖7 羥基自由基清除能力

3.4 復方石斛提取物對秀麗隱桿線蟲體內降糖活性的測定

BCA 濃度測定和葡萄糖含量測定結果見表4，空白組的葡萄糖含量均高于其余組，表明復方石斛提取液對秀麗隱桿線蟲具有降糖作用。 當提取物制備成120 mg/ml 的溶液時，被線蟲攝取后產生較好的降糖活性，其葡萄糖含量為0.03 mmol/g，蛋白含量為6.08 μg。 葡萄糖含量隨著樣品濃度的增加而先降低，后升高。 表明樣品濃度過高反而會降低復方石斛提取液的降糖作用。

表4 BCA 濃度測定和葡萄糖含量測定

4 結論

本研究是以復方石斛（鐵皮石斛－黨參－黃芪－黃精=2:3:3:2）為原料進行總黃酮的提取，通過單因素實驗和響應面法對提取工藝進行優化， 得出復方石斛總黃酮的最優提取工藝條件為乙醇濃度60%，超聲時間50 min，液料比為35，總黃酮提取率為2.59%。 并測定了提取物體外抗氧化活性和體內降血糖活性。 結果表明， 測定其對DPPH、ABTS+、 羥基自由基的半數抑制率分別為7.189 μg/ml、1.288μg/ml、1.468 μg/ml， 其與陽性對照VC 的DPPH 抑制活性相差較大， 但是增大濃度后， 最大抑制率達到80.65%，對ABTS+和羥基自由基的抑制活性與VC 較接近，最大抑制率分別可以達到93.95%和94.37%。 采用線蟲實驗測定其體內降糖活性，當提取物制備成120 mg/ml 的溶液時，有較好的降糖活性。 在該工藝條件下所得提取物具備抗氧化活性的同時也有一定的降糖活性。 本研究為開發多功能保健食品提供了研究思路，如延緩衰老的食品等。