卷丹百合LlARR1及其在珠芽形成過程中的表達分析

陳妍竹,張雪敏,俞詩音,王夢迪,杜運鵬,楊鳳萍,張秀海,李玉舒,曹麗

(1.延邊大學農學院,吉林 延吉 133002; 2.北京市農林科學院草業花卉與景觀生態研究所,北京 100097;3.北京林業大學園林學院,北京 100083; 4.北京農業職業學院,北京 102442)

百合是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)植物,屬野百合的一個變種,具備極高的觀賞價值[1]。百合屬植物有110～115個種,其中只有卷丹百合(Liliumlancifolium)、淡黃花百合(Liliumsulphureum)、通江百合(Liliumsargentiae)和珠芽百合(Liliumbulbiferum)這4個種在自然條件下可在莖的葉腋處形成珠芽。珠芽繁殖具有繁殖系數高、低毒,生產的種球質量高,育種周期短等優勢,已成為卷丹重要的繁殖策略之一[2]。在有珠芽百合中,卷丹表現出更多的特殊性。卷丹是在中國分布范圍最廣的百合科百合屬植物,分布于中國17個省、自治區、直轄市。其花大色艷,抗性強,兼具觀賞、食用、藥用價值,為中國食用百合的主要野生種[3]。截至2019年,中國食藥用百合產業規模超過100億元,而卷丹是中國藥典記載的三大藥用百合之一,種植面積約30 km2,產值約45億元,是食藥用百合種植面積最多的種。卷丹一般為三倍體,難以通過有性繁殖方式擴大種群。目前,制約中國食藥用百合產業發展的主要阻礙之一是百合種球退化嚴重。因此脫毒種球的生產是百合產業提質增效、綠色可持續發展的核心。珠芽發生機制的解析,對提高百合的栽培及繁殖效率有著重要的生產意義,對促進百合產業發展具有重要理論和應用價值。

細胞分裂素作為重要的植物激素,幾乎參與植物生長發育的各個方面,如頂端優勢、延遲衰老、頂端分生組織維持、從頭器官再生、根系增殖、頂端分生組織功能和營養信號轉導等[4-5]。研究表明,細胞分裂素參與珠芽的形成,并在珠芽的形成過程中起促進作用[6]。在薯蕷(Dioscoreapolystachya)體外球莖誘導過程中,增加培養基中細胞分裂素的濃度可以顯著提高球莖誘導率[7]。NAVARRO等[8]報道,外施細胞分裂素能夠促進番茄(SolanumlycopersicumL.)腋下塊莖的形成。反應調節因子家族(response regulators,RRs)被認為是植物細胞分裂素響應的主要調節因子,對擬南芥基因組數據進行鑒別分析,發現該家族共有24個基因,被分為了3類:A型、B型和C型[9]。在結構上A型只帶有可接受磷酸的接收器結構域,由細胞分裂素轉錄誘導,是主要的細胞分裂素應答基因,負調控細胞分裂素信號通路,降低對細胞分裂素的敏感性[10-14]。C型ARRs與A型ARRs相似,但它們的表達不是由細胞分裂素誘導的[9,15]。B型ARRs帶有保守的核定位信號(nuclear localization signal, NLS)區域,在亞細胞定位研究中全部定位于細胞核[15]。而B型除具有接收器結構域之外,還包含與DNA結合的MYB-like結構域與反式激活區域,是細胞分裂素信號通路中的正調控轉錄因子,可直接與靶DNA序列結合,激活靶基因的表達[16-17]。ARR1屬于B型ARR基因,是最先被認為是轉錄因子的RRs家族成員之一。研究表明,ARR1在細胞分裂素信號傳遞的通路中起著核心的調控作用[16]。且干細胞分化和腋芽的形成與細胞分裂素信號通路通過B-ARRs激活WUSCHEL基因的表達相關[18-19]。

通過北京市農林科學院草葉花卉與景觀生態研究所百合組前期珠芽形成過程的轉錄組數據發現,LlARR1基因在卷丹S0(珠芽準備發生期)和S1(珠芽小白點時期)[6]的表達中具有顯著差異。對LlARR1基因在卷丹百合珠芽形成過程中表達分析進行研究,以期能夠進一步闡述卷丹珠芽發生的性狀,為卷丹珠芽發生機制研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料 卷丹獨頭種球及不同品種有珠芽、無珠芽百合種植于北京市農林科學院國家百合種質資源圃中。根據北京市農林科學院草葉花卉與景觀生態研究所百合組前期對珠芽的觀察,將其發生發育階段劃分了4個時期分別為S0、S1、S2、S3[6]。每個時期取9株卷丹,每株卷丹取同一部位的2個相鄰葉腋,每3株卷丹的葉腋作為一個混合樣本混樣;同時取每株卷丹百合上下部葉腋處;不同品種百合取其植株上部葉腋處混合樣本錫箔紙包裹后用液氮速凍,在-80 ℃冰箱中凍存,用于后續總RNA的提取及qRT-PCR的檢測。

1.1.2 不同激素處理卷丹百合 隨機選取30株卷丹百合進行外源激素處理并觀察。噴灑蒸餾水作為對照,且每3 d噴灑100 mg ·L-1生長素IAA和100 mg·L-1生長素轉運抑制劑NPA以及100 mg·L-1赤霉素GA3溶液。每個處理中均使用了10個獨立的植株。

1.1.3 菌株、載體和試劑 EASYspin Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒(愛博森生物科技有限公司,北京),大腸桿菌(DH5α)感受態BC102細胞(博邁德生物技術有限公司,北京),pCE2 TA/Blunt-Zero Vector載體5 min TM TA/Blunt-Zero Cloning Kit,2×Phanta? Flash Master Mix(Dye Plus),2×Rapid Taq Master Mix和反轉錄試劑HiScriptⅢ SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(諾唯贊,南京),DNA通用純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司,北京),熒光定量PCR試劑TB Green? Premix ExTaqTM(寶生物工程有限公司,大連)。

1.2 試驗方法

1.2.1 卷丹百合中LlARR1來源 通過對處于不同發育時期的卷丹葉腋和珠芽混樣進行轉錄組測序分析,并基于前人[20]對細胞分裂素通路研究的基礎上,在轉錄組測序數據中篩選細胞分裂素信號途徑相關所有基因。

1.2.2LlARR1基因克隆及定量引物設計 利用卷丹珠芽發生發育過程轉錄組數據篩選獲得目的基因,利用目的基因的轉錄本序列在ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)獲得其開放閱讀框(open reading frames, ORF)序列,將獲得的長度大于200 bp的ORF序列在NCBI protein BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/-Blast.cgi)依次進行比對,與轉錄組注釋結果相吻合即視為比對成功,保存比對成功的ORF序列用于定量引物設計。將保存的ORF序列提交至GenScript(https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool?page_no= 1& position_no=2&sensors=googlesearch),調整參數orga-nism:other,size range:180～220 bp,Tm≥60 ℃進行定量引物設計,根據引物設計的原則選擇最好的1～2個設計結果作為定量引物,后續再進行定量引物的篩選。

克隆引物和病毒檢測引物的設計則是將該ORF序列提交至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找獲得基因的CDS序列,利用Primer Premier 5軟件設計克隆引物,熒光定量引物,克隆引物和病毒檢測引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 LlARR1基因克隆及定量試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 總RNA的提取及逆轉錄 試驗中選取的材料包括卷丹百合葉腋、卷丹百合不同組織、不同品種百合(有珠芽和無珠芽)開花前的莖稈上部葉腋以及不同激素處理(IAA、NPA、GA3,噴施質量濃度均為100 mg·L-1)的卷丹百合葉腋,其總RNA利用EASYspin Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒提取;根據反轉錄試劑HiScript Ⅲ SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)將提取的RNA反轉錄合成cDNA,反應體系為:5×HiScriptIII qRT SuperMix 4 μL,4×gDNA wiper Mix 4 μL,RNA 1 μg,RNase Free ddH2O添加至20 μL;反應條件為:37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃永久保存。反應結束后,樣品于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.4 轉錄組測序樣品制備及文庫構建 卷丹百合S0、S1、S2、S3,4個時期葉腋樣品,液氮冷凍,-80 ℃凍存。由北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序及初步數據分析。NCBI SRA (順序讀取存檔)登錄號為PRJNA916842。

采用EASYspin Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒(愛博森生物科技有限公司,北京)提取總RNA。首先通過Oligo(dT)磁珠富集帶的mRNA,隨后加入Fragmentation Buffer隨機打斷得到的mRNA。以片段化的mRNA為模板,在M-MuLV逆轉錄酶體系中合成cDNA第一條鏈,隨后用RNaseH降解RNA鏈,并在DNA polymerase I體系下,以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經過末端修復,加A尾并連接測序接頭,用AMPure XP beads篩選約370～420 bp的cDNA,進行PCR擴增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產物,最終獲得文庫。文庫構建完成后,首先使用Qubit 2.0 Fluorometer進行初步定量,稀釋文庫至1.5 ng·μl-1,隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer對文庫大小進行檢測,而后,qRT-PCR對文庫有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度高于1.5 nmol·L-1),以保證文庫質量。

1.2.5LlARR1基因克隆 利用卷丹葉腋cDNA為模板進行PCR擴增,擴增體系包含2×Phanta Master Mix 25 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 19 μL,總體系50 μL。反應程序為98 ℃ 30 s,98 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,72 ℃ 15 s,72 ℃ 5 min,共35個循環。擴增后的PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用DNA回收試劑盒(TIANGEN,北京)回收目的片段;將目的片段連接至pCE2 TA/Blunt-Zero Vector載體,并轉化到DH5α(博邁德,北京)感受態中,涂布于LB固體培養基(含50 mg·L-1卡那霉素),37 ℃培養12 h后,隨機挑取單克隆并進行菌液PCR檢測,將條帶位置正確的陽性單克隆菌液送往生工生物工程(上海)有限公司。

1.2.6LlARR1序列分析、蛋白結構預測及系統進化樹構建 通過ProtParam對蛋白理化性質進行分析;利用ProtScale對蛋白親疏水性進行分析;采用TMHMM Serverv 2.0分析編碼氨基酸的跨膜結構域;利用NetPhos 2.0 Server進行磷酸化位點預測;利用NCBI ORF finder在線程序及Conserved domains數據庫對測序獲得的cDNA序列進行開放閱讀框及保守功能結構域分析;利用PredictProte預測蛋白一級結構域;通過SOPMA及SWISS.MODEL預測蛋白的二級和三級結構;利用Cell-PLoc 2.0分析亞細胞定位情況;利用JAlview進行編碼蛋白多重序列比對;利用MEGA7.0進行Neighbor.joining系統進化樹構建。系統發育樹中序列的模體結構采用MEME(https://meme-suite.org/me-me/tools/meme)在線網站進行分析。

1.2.7LlARR1的表達分析 實時熒光定量PCR反應體系:5 μL TB green、1 μL cDNA模板、0.4 μL上下游引物、3.6 μL ddH2O。擴增程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,循環39次。以卷丹18S為內參基因,采用2-ΔΔCt法計算LlARR1的相對表達量。利用Excel 2019、SPSS17.0、GraphPad Prism8等軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 卷丹百合珠芽發生發育時期劃分

根據卷丹百合珠芽發生發育過程將其劃分為4個時期,將第1個葉腋處產生小白點時期記為S1時期,將該葉腋上部1～3個葉片的葉腋記為S0時期,即珠芽準備發生時期。隨著珠芽發育,依次將珠芽綠球期記為S2時期,珠芽成熟期記為S3時期(圖1)。

A. S0:珠芽準備發生期;B. S1:珠芽小白點期;C. S2:珠芽綠球期;D. S3:珠芽成熟期。A.S0: Preparation stage; B. S1: White dot stage; C. S2: Green bulbil stage; D. S3: Mature bulbil stage.

2.2 卷丹ARR1在珠芽發生過程轉錄組中的表達

基于細胞分裂素在腋芽發生過程中的重要性[6],為探究卷丹百合珠芽發生過程中的細胞分裂素相關的關鍵轉錄因子,對S0和S1時期的轉錄組數據進行分析,在細胞分裂素信號通路中,篩選到了一個注釋為ARR1的差異表達基因。相比于S1時期,該基因在S0時期有較高的表達(圖2-A),并且熒光定量的結果與轉錄組數據一致(圖2-B)。

**表示差異極顯著(p<0.01)。下同。 ** indicates a significant difference (p<0.01). The same as below.

2.3 卷丹LlARR1基因CDS全長克隆及其編碼氨基酸序列分析

為獲得LlARR1基因CDS序列,將其轉錄本序列提交至ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)找到一條全長2 148 bp的序列,使用引物LlARR1-F和LlARR1-R對卷丹LlARR1基因進行PCR擴增,獲得1條長度約為2 000 bp的條帶(圖3-A),純化回收后連接TA/Blunt-Zero Vector載體轉化大腸桿菌后,通過菌液PCR挑選條帶正確的陽性克隆單克隆菌液送測序。測序結果表明,LlARR1基因開放閱讀框(ORF)長2 148 bp,共編碼715個氨基酸。如圖3-B中,紅色方框為起始密碼子,藍色方框為終止密碼子。

注:M代表DNA marker trans2K plus; 1,2指LIARR1基因的PCR產物。Note:M represents for DNA marker trans2K plus,1,2 refers to the PCR product of the LIARR1 gene.

2.4 LlARR1基因系統進化樹構建

經分析,16種ARR1蛋白聚為5個小分支,具有較高的支持率,LlARR1與卷丹(Liliumlancifolium)、雜交百合(Liliumhybrid division)的ARR1序列處于同一個進化分支上,表明它們的親緣關系最近(圖4)。模體結構分析顯示,基序1,2,3比較保守,不同物種的16個ARR1蛋白均含有1,2,3基序,且均無特有基序,說明ARR1蛋白是比較保守的。此外,聚合在系統進化樹同一分支內的不同植物ARR1的模體基序是相似的,關系越近,模體基序越相似。

圖4 LlARR1與其他物種同源蛋白的系統進化樹及模體分析Fig.4 LlARR1 Phylogenetic tree and motif analysis of proteins homologous to other species

2.5 卷丹LlARR1蛋白生物信息學分析

2.5.1 卷丹LlARR1蛋白的理化性質分析 對卷丹LlARR1基因編碼的蛋白質的理化性質進行預測分析,結果顯示,該蛋白分子式為C3361H5329N987O1102S29,相對分子質量為78 125.98,理論等電點為5.76,脂肪系數為72.24。LlARR1蛋白的氨基酸中共含有82個帶負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu),70個帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)(圖5-A)。不穩定系數為50.68,蛋白親水性平均值為-0.517,因此LlARR1為不穩定疏水性蛋白(圖5-B)。LlARR1蛋白從內到外無跨膜區域,有接近1的概率表明該蛋白位于膜外,推測是一種非跨膜蛋白(圖5-C)。LlARR1蛋白含有可能發生磷酸化的位點有81個,包括Ser(絲氨酸)60個、Thr(蘇氨酸)16個、Tyr(酪氨酸)5個(圖5-D)。

圖5 LlARR1蛋白理化性質分析Fig.5 Analysis of physicochemical properties of LlARR1 protein

2.5.2 卷丹LlARR1蛋白質二、三級結構的預測分析 采用NCBI CD search在線網站分析LlARR1基因編碼蛋白質的結構域,該蛋白有2個specific-hits,為REC_typeB_ARR-like和myb SHAQKYF位點,分別屬于REC superfamily、SANT superfamily(圖6-A)。

圖6 LlARR1蛋白質二三級結構預測Fig.6 Prediction of secondary and tertiary structure of LlARR1 protein

注:不同字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。Note: The different letters within the same column mean significant difference by Duncan’s multiple range test at p<0.05.The same as below.

利用SOPMA在線軟件對蛋白質的二級結構進行預測和分析。結果表明,LlARR1蛋白的二級結構的含量中:無規則卷曲(黃色c)(58.32%)>α螺旋(藍色h)(26.01%)>延伸鏈(紅色e)(10.63%)>β轉角(綠色t)(5.03%),因此可推斷,無規則卷曲和α螺旋是LlARR1蛋白的主要組成成分(圖6-B)。蛋白質的多肽鏈在二級結構的基礎上進行盤曲或折疊形成具有規律的三維空間結構。利用在線軟件SWISS-MODEL對蛋白質三級結構進行預測分析,獲得了LlARR1蛋白的三維結構模型,發現LlARR1以DNA-binding response regulator作為目標建模,含有8個α螺旋,6個β折疊 ,組分間均以β轉角(loop)相連(圖6-C)。采用CellPLoc 2.0亞細胞定位顯示,該蛋白主要定位于細胞核。

2.6 LlARR1在卷丹百合不同組織及植株上下莖部的表達分析

為探究LlARR1的表達模式,通過qRT-PCR檢測了卷丹百合不同組織及同一植株S0時期莖稈上下部中LlARR1的相對表達量。從圖中可以看到,LlARR1在葉腋中的表達最高,在花柱中的表達水平最低,并且其在珠芽中的表達水平顯著低于葉腋(圖7-A),推測LlARR1的表達主要集中于珠芽準備發生時期,即S0時期,但在珠芽發育時期的表達處于較低水平。隨后發現,LlARR1在莖稈上部的表達水平顯著高于莖稈下部,而卷丹珠芽的發生主要集中于莖稈上部(圖7-B)。因此,基于以上結果可以說明,LlARR1可能主要在珠芽發生過程中發揮作用。

2.7 ARR1在不同百合品種中的定量分析

為進一步探究ARR1在珠芽發生中表達模式,選取了不同系列的11種百合來檢測莖稈上部ARR1的表達量,分別是A系列品種(‘Flore Pleno’‘Pearl White’‘Red Velvet’)、A復色品種(‘Fore-ver Linda)、Free A系列(‘Easy Whisper’)、Tiger A系列(‘Strawberry Event’)、LA重瓣系列(‘Must See’)、OA系列(‘Hotel California’)、O系列(‘Brasilia’)、OT系列(‘Red Morning’)和T系列(‘Orange Planet’)。以上11種百合中,OA系列的‘Hotel California’和A系列的‘Flora pleno’均可以自然產生珠芽,‘Must See’在植株開花后才能產生珠芽外,而其余8個品種在自然條件下均不能產生珠芽。檢測發現,ARR1在2種可以產生珠芽的百合中的表達水平顯著高于其他9個品種(圖8)。而圖9中ARR1在‘Red Velvet’、Strawberry Event’2個不產生珠芽品的相對表達量高于‘Must See’。這可能是由于取樣時‘Must See’尚未產生珠芽。該結果進一步說明ARR1可能作用于珠芽的發生過程,并可能發揮一個正調控因子的作用。

圖8 ARR1在不同百合品種中的表達水平Fig.8 Expression levels of ARR1 in different varieties of lily

注:以NPA作為相對的量;*表示差異顯著(p<0.05);**表示差異極顯著(p<0.01):ns表示無顯著差異(p>0.05)。Note: NPA is used as a relative quantity;* indicats significant difference (p<0.05); ** means highly significant difference (p<0.01); ns means no significant difference (p>0.05).

2.8 LlARR1在不同激素處理中的表達分析

珠芽的發生發育受到多種激素的調控[2]。為探究LlARR1對不同激素的響應,對卷丹植株進行了3種激素處理(IAA、NPA、GA3)(圖9)。結果發現,對照植株中,LlARR1在S2時期有一個小峰值,推測其在珠芽發育過程中也發揮作用。IAA處理中,LlARR1的表達在S0時期被顯著抑制,但在后期的S3時期被顯著上調。NPA的處理緩解了S0時期IAA對LlARR1的抑制,但在后期的S2時期,NPA對LlARR1有一定的抑制作用。在赤霉素處理中,LlARR1在S0時期被顯著抑制,但在后期的發育過程中均被上調。由該結果推測,LlARR1可能在珠芽準備期發揮的作用與生長素和赤霉素相反,但在后期的珠芽發育過程中發揮相似的作用。

3 結論與討論

擬南芥中的細胞分裂素信號通路涉及3個組成部分:擬南芥組氨酸激酶(AHKs)、擬南芥組氨酸磷酸轉移酶(AHPs)和擬南芥反應調節因子(ARRs)[21-22,17]。擬南芥中的細胞分裂素受體家族由3個組氨酸激酶組成:AHK2、AHK3和AHK4(CRE1或WOL1)[23-24]。AHPs是AHK細胞分裂素受體的下游靶蛋白,并將磷酸基轉移到下游的ARRs,B型ARRs是最終的磷酸化受體[25-28]。已有研究表明,ARR1可能是細胞分裂素通路中參與調控珠芽發生的相關基因。YANG等[29]通過轉錄組分析發現,細胞分裂素的高生物合成和低降解可能促進卷丹上部葉腋處珠芽的形成,HE等[30]的研究發現,細胞分裂素可以促進珠芽的形成,尤其是珠芽的啟動,而ARR1是細胞分裂素信號通路中重要的轉錄因子[31],推測卷丹珠芽形成過程中ARR1基因可能發揮重要作用。而其研究檢測了ARR1在卷丹珠芽發生過程中的表達,發現在珠芽發生過程中ARR1的表達表現出先升高后下降的趨勢,這與本研究結果有所不同,可能是由于對發生時期的劃分有所不同所導致,但這些結果均說明ARR1可能參與卷丹珠芽的發生。在擬南芥的腋芽發生過程中,外源施加細胞分裂素,可以促進ARR1的表達進而激活WUS的表達來促進腋芽的再發生,這可以說明細胞分裂素在腋芽的發生過程中起著重要的作用[18]。目前,對ARR1在卷丹珠芽發生發育過程中的表達模式及其結構性質進行具體的探討較少,且缺少ARR1參與珠芽發育過程的研究,本研究初步劃分了卷丹珠芽的發生發育時期,并對LlARR1在卷丹發生發育時期的表達模式進行了檢測。

本研究通過對S0和S1時期卷丹珠芽轉錄組測序分析,從差異基因中篩選得到了差異顯著的基因ARR1,并進行生物信息學分析。氨基酸多序列同源比對發現LlARR1和其他植物的同源性較高,表明植物中ARR1蛋白的氨基酸序列較為保守,在模體分析中這一點也得到了驗證。模體結構分析發現,不同植物ARR1蛋白基序大多比較保守。此外,系統進化樹及模體結構分析還發現,親緣關系越近的種屬,ARR1蛋白的模體結構越相似,LlARR1與卷丹ARR1的模體結構一致,說明二者確為同一基因,與雜交百合ARR1相似度最高,推測二者可能具有相似的功能。且LlARR1編碼一個由715個氨基酸殘基組成的蛋白序列,為疏水性不穩定蛋白,無跨膜區,有大量磷酸化作用位點,理論等電點為5.76。亞細胞定位預測結果發現,LlARR1定位于細胞核中。蛋白結構預測分析發現,LlARR1以DNA-binding response regulator作為目標建模,無規則卷曲和α螺旋是LlARR1蛋白的主要組成成分。

LlARR1的表達模式分析發現,相對于S1時期,LlARR1珠芽S0時期有較高的表達水平(圖2),主要集中在葉腋處表達,并且其在莖稈上部葉腋處S0時期的表達遠高于莖稈下部的表達(圖7),推測LlARR1在珠芽啟動過程中發揮正調控因子的作用。該推測被LlARR1在不同百合品種中的表達結果進一步驗證,即LlARR1在自然發生珠芽的百合品種葉腋處有較高的表達水平。在不同激素處理的卷丹百合中,LlARR1的表達在S0時期均被生長素和赤霉素顯著抑制,由該結果推測,LlARR1可能在珠芽準備期發揮的作用與生長素和赤霉素相反。而生長素處理下的卷丹百合在S1時期與對照植株相比有顯著上調,由此可以推測LlARR1可能在S1時期協同生長素并促進卷丹珠芽的形成,這與YANG等[29]的結果相一致(圖9);且譚長龍等[32]的研究也表明,較低含量的生長素有利于珠芽魔芋側葉萌發。同時在之后的S3時期進一步與生長素有協同,促進珠芽的發育,但外源噴施生長素是否能增加珠芽的發生還有待探究。而在赤霉素處理中,LlARR1在后期的發育過程中均被上調,由此推測在后期的珠芽發育過程中其與赤霉素可能協同發揮作用。龔明霞等[33]對山藥進行外源噴施赤霉素,發現其可能抑制珠芽形成,而在本文研究中還不能證明赤霉素的外源施加對卷丹百合珠芽形成起到正調控或負調控作用,同時赤霉素是否能夠促進卷丹珠芽的發生發育還有待探究。

本研究從卷丹葉腋中克隆到細胞分裂素傳遞通路中的核心轉錄因子LlARR1,全長2 148 bp,編碼715個氨基酸,為不穩定疏水性蛋白,與雜交百合ARR1親緣關系最近,且在不同植物物種中ARR1氨基酸較為保守。對其表達模式分析表明,LlARR1可能參與了卷丹珠芽的發生和發育,且在珠芽發生發育過程中可能發揮促進作用。但后期仍需對LlARR1在卷丹珠芽發生及發育過程中的功能進行驗證,從而了解細胞分裂素在珠芽形成中的作用,以期為珠芽發生調控及其分子機制的研究提供理論依據。