右美托咪定對病理性心肌細胞肥大的保護作用

曹雪峰，趙亮，方波，劉旭東，段鳳梅，姬云飛

（1.承德醫學院附屬醫院麻醉科，河北 承德 067000；2.承德醫學院基礎醫學院藥理教研室，河北 承德 067000；3.中國醫科大學附屬第一醫院麻醉科，沈陽 110001；4.承德市中心醫院麻醉疼痛科，河北 承德 067000）

心肌肥厚是重要心血管疾病的高危因素，是心功能惡化及心源性死亡的獨立危險因素，會增加冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、充血性心力衰竭等其他心血管疾病的發生率，而這些疾病都易導致患者病死率的增加甚至猝死的發生［1-2］。對于心肌肥厚的治療，目前仍局限于降低心肌收縮力、擴張血管和降低后負荷等手段，很少直接針對心肌肥大的形成過程進行干預。心肌肥厚的改善可以降低心血管疾病的危險性，深入研究心肌肥厚的發生機制，將為藥物干預及防治心肌肥厚開拓全新的思路。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一種α2-腎上腺素能受體（α2-adrenergic receptor，α2-AR）激動劑，對心血管有直接作用，目前研究［3-7］主要針對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。DEX具有抗交感和穩定循環的功能，圍手術期使用DEX可改善行心臟手術患者的預后［8］，目前關于DEX對病理性心肌肥大的保護作用研究甚少。本研究旨在探究DEX通過誘發代償性心肌肥大來改善病理性心肌肥大的過程。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

二氧化碳細胞培養箱（日本三洋株式會社PHCbi公司）；倒置顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社Olympus公司）；低溫恒速變速離心機（德國艾本德股份公司Eppendorf公司）；ECL化學發光儀（中國天能科技責任有限公司Tanon公司）；激光掃描共聚焦顯微成像系統FV3000（日本奧林巴斯株式會社）。

1.2 主要藥品與試劑

DEX（批號 HY-12719，純度 99.63%）購自美國新澤西MedChemExpress生物科技有限公司；高糖培養基（批號 C11330500BT）購自中國武漢普諾賽生命科技有限公司（規格：500 mL/瓶）；南美胎牛血清（批號 10270106）購自中國Gibco賽默飛世爾科技股份有限公司（規格：500 mL/瓶）；胰蛋白酶含EDTA（批號 10039232）購自中國Phygene飛凈生物高新技術股份有限公司（規格：100 mL/瓶）；二甲基亞砜（批號 KMO0697）購自中國天津科密歐化學試劑有限公司（規格：500 mL/瓶）。心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗體（批號 ab189921）購自英國Abcam生物科技有限公司（規格：100 μL/支）；腦尿鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）（批號 ab19646）、肌球蛋白重鏈（β- myosin heavy chain，β-MHC）抗體和α-actinin抗體（批號 EP2528Y）均購自英國Abcam生物科技有限公司（規格：100 μL/支）。

1.3 實驗分組

實驗分為6組，無血清培養液培養細胞24 h作為對照組（C組）；無血清培養液中加血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，Ang Ⅱ，1 μmol/L），細胞培養24 h作為模型組（A組）；無血清培養液中加入Ang Ⅱ（1 μmol/L）+ DEX（5 μmol/L），培養24 h作為右美托咪定組（AD組）；無血清培養液培養細胞48 h作為C’組；無血清培養液加入Ang Ⅱ（1 μmol/L），培育24 h，停藥24 h作為A’組；無血清培養液加入DEX（5 μmol/L）+Ang Ⅱ（1 μmol/L），培育24 h，停藥24 h作為AD’組。

1.4 實驗方法

1.4.1 新生大鼠心室肌細胞（neonatal rat ventricle myocytes，NRVMs）分離培養：無菌環境下，將新生大鼠心室肌剪成1 mm3，用DMEM沖洗。棄去上清液，加入含0.25%胰蛋白酶消化，37 ℃進行5 min，棄去消化液，細胞轉移到含有20 mL DMEM 培養液的試管中，以1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，細胞沉淀再次用培養液重懸。重懸液經篩網過濾，用差速貼壁分選法分離2 h后計數，以1×105/cm2細胞濃度接種于培養皿中，3 d后可以用于實驗。本研究獲得承德醫學院動物保護與使用委員會批準，并按照《國家衛生研究院實驗動物中心小動物區動物使用》要求執行。

1.4.2 離體心肌肥厚模型建立：細胞貼壁3 d后，用含有1%胎牛血清的DMEM培養液替換正常細胞培養液，加入濃度為1 μmol/L的Ang Ⅱ，于37 ℃、5%CO2、95%濕度環境中培養，培養1 d后，通過檢測心肌細胞面積、體積、肥大相關基因（ANP、BNP和β-MHC）蛋白含量來判斷模型是否成功。

1.4.3 免疫熒光化學染色：心肌細胞用PBS洗3 遍，冷甲醇固定30 min，加入TritonX2100，1%BSA室溫孵育1 h，封閉羊血清封閉5 h，一抗37 ℃孵育，熒光二抗37 ℃孵育，共聚焦成像系統觀察蛋白表達和定位。

1.4.4 心肌細胞面積測量：將細胞接種于6孔板（3×105/孔）上，不同組別分別加入生理鹽水，Ang Ⅱ和DEX（5 μmol/L）孵育24 h，應用醫學圖像分析系統測量單個細胞表面積，確認心肌細胞肥大的發生情況。

1.4.5 CCK-8檢測細胞活性：當細胞生長至70%～80%融合時，用胰酶消化，收集貼壁細胞后計數，制成5×104/mL密度的細胞懸液，在96孔板中配置100 μL的細胞懸液。在培養箱預培養24 h（37 ℃，5%CO2）。更換1%FBS+DMEM低血清培養液，隨機分為6組，并設置空白對照孔。分別在常氧和低氧培養箱中培養24 h。每孔加入10 μL CCK溶液。在培養箱內孵育1～4 h，2 h后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.4.6 Western blotting檢測：心肌細胞（細胞數量約2×106～3×106）吸管吹打后冰里放置30 min，離心（20 000 r/min、4 ℃、10 min），取上清液，按Bradford法測定蛋白濃度。稀釋后100 ℃變性5 min，8%～10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，半干式電轉膜60～120 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入ANP、BNP、β-MHC抗體，4 ℃過夜，加入二抗室溫孵育1 h后DAB 顯影，凝膠成像儀分析系統掃描，計算各條帶與內參照（β-actin）的相對灰度值作為各蛋白表達的相對含量。

1.5 統計學分析

采用GraphPad Prism軟件進行統計分析。數據以±s表示。2組間差異比較采用t檢驗。采用單因素方差分析（ANOVA）比較多組間差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠心肌細胞的形態變化

與C組比較，A組和AD組細胞面積均增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。提示Ang Ⅱ和DEX能夠誘導心肌細胞肥大。見圖1。

圖1 Ang Ⅱ、DEX誘發心肌細胞發生肥大Fig.1 Cardiomyocyte hypertrophy induced by AngⅡand DEX

2.2 3組大鼠心肌細胞ANP、BNP和β-MHC蛋白的表達

與C組比較，A組和AD組的ANP、BNP和β-MHC蛋白表達均增加，且AD組增加更為顯著（圖2），差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 DEX增加心肌肥大相關蛋白的表達Fig.2 DEX increased the expression of cardiac hypertrophy associated protein

2.3 CCK-8細胞活性檢測結果

為了檢測不同藥物濃度對細胞活性的影響，加入高濃度DEX（10 μmol/L和20 μmol/L）組，結果顯示，與C組比較，A組細胞活性明顯降低；而與A組比較，AD組以及Ang Ⅱ+DEX（10 μmol/L）、Ang Ⅱ+DEX（20 μmol/L）細胞活性明顯升高。為了研究藥物作用時長對細胞活性的影響，同樣的組別，繼續孵育細胞至36 h再次檢測CCK-8，結果顯示細胞趨勢與24 h一致（圖3）。證實Ang Ⅱ誘導心肌肥大，細胞活性降低；而DEX誘導心肌肥大，細胞活性明顯升高。DEX明顯改善了Ang Ⅱ引起的細胞活性降低，與A組比較，AD組與C組細胞活性差異均有統計學意義（P＜0.01）。

圖3 DEX增加病理性心肌肥大細胞的活性Fig.3 DEX increased the activity of pathological myocardial mast cells

2.4 C’、A’和AD’各組肥大相關蛋白的表達

將大鼠心肌細胞分成3組驗證肥大相關蛋白ANP、BNP和β-MHC的表達。與C’組比較，A’組ANP、BNP、β-MHC蛋白表達明顯增加。與A’組比較，AD’組肥大相關蛋白ANP和BNP的表達明顯減少，β-MHC并無明顯改變（圖4）。停藥24 h后，DEX能明顯減少Ang Ⅱ引起的病理性心肌肥大相關蛋白的表達，而停藥后A’組肥大相關蛋白未見減少。證實DEX通過誘導代償性、類似于生理性心肌肥大來產生心肌保護作用。

圖4 DEX對病理性心肌肥大發生的影響Fig.4 Effect of DEX on pathological cardiac hypertrophy

3 討論

DEX具有鎮痛、鎮靜和抗焦慮的臨床作用［9-11］。DEX與其他全身麻醉藥物合用可以減少麻醉藥物的用量，復合局部麻醉藥物的使用可以延長麻醉作用時間。與苯二氮卓類鎮靜藥物相比，DEX能鎮靜且不抑制呼吸，患者進入類似于生理睡眠的狀態，大大提升了麻醉的安全性和患者的舒適度。DEX應用范圍廣且不良反應輕，近年研究重點已轉移至臟器保護方面，包括對心肌的保護作用。DEX可以減少心肌缺血/再灌注損傷中的促炎細胞因子和氧化產物，從而減輕心肌損傷［12］。DEX通過抑制線粒體活性氧生成減輕阿霉素心臟毒性［13］。本研究結果顯示，與C組比較，A組細胞面積增大，心肌肥大相關蛋白ANP、BNP和β-MHC表達增加，證明離體心肌肥大模型建立成功。AD組細胞面積進一步增大，肥大相關蛋白表達進一步增加，提示DEX促進了心肌肥大的發生。既往研究［3-4］發現DEX有心肌保護作用，提示DEX可能誘發生理性心肌肥大的發生。

生理性心肌肥厚是指體育鍛煉或妊娠等所致的心肌肥厚，隨著體育鍛煉終止或妊娠結束生理性心肌肥厚將恢復［14］。生理性肥厚引起左心室容積增加、室壁厚度增大，但室壁厚度與心臟質量成比例增加，不發生心肌纖維化，是一種良性的適應性改變，有助于提高心功能，對病理性的心肌損傷具有保護效應。為探究DEX引起的心肌肥大的性質，本研究模擬了體外實驗C’組、A’組和AD’組。其中AD’組類似于身體鍛煉或妊娠結束，隨著加藥終止，肥大相關蛋白ANP、BNP明顯減少，接近C’組，而A’組沒有隨加藥的終止而減少。這說明DEX誘發的心肌細胞肥大是可逆的且為代償性，對肥大心肌細胞是一種保護作用。

本研究存在一定局限性，缺少體內實驗驗證，未來將開展體內實驗，進一步研究DEX誘發生理性心肌肥厚保護心肌細胞的分子機制。探討心肌肥厚發生機制對心血管領域研究具有重要的理論價值和臨床意義，有望為臨床診療提供新思路。