子宮腺肌病患者子宮內膜組織中環氧合酶2 和β-連環蛋白表達水平及其與痛經的關系

張曉穎, 何源哈達, 王靜媛, 宿瑞俊, 王 淇, 魯容鈳, 鄭 博, 鄭 健

（1. 內蒙古醫科大學附屬醫院婦產科疾病研究中心，內蒙古 呼和浩特 010059；2. 內蒙古醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室，內蒙古 呼和浩特 010059；3. 內蒙古醫科大學基礎醫學院病理學教研室,內蒙古 呼和浩特 010059； 4.內蒙古醫科大學附屬醫院臨床檢驗中心，內蒙古 呼和浩特 010059）

子宮腺肌?。╝denomyosis，AM）是指子宮內膜腺體和間質侵入子宮肌層生長產生的病變。大部分AM 患者希望保留子宮，但由于保守治療效果較差，常因月經過多和痛經難忍被迫選擇子宮切除，極大地影響患者身心健康。研究［1-2］顯示：AM 患者痛經率為64.8%~77.8%。最終選擇子宮切除的AM 患者均伴有不同程度的痛經，尤其重度痛經者較多。而目前痛經的發生機制尚未完全闡明，對于不同程度痛經患者的治療存在爭議。血清中CA125 水平升高對于AM 診斷具有一定的參考價值，但由于其特異度和靈敏度較差，臨床診斷和監測AM 仍缺少有效的標記物［3］。研究［4-5］顯示：盡管AM 為良性疾病，但其有與惡性腫瘤相似的特征，如細胞異常增殖、遷移和侵襲，目前尚無有效的臨床治療策略。研究［6-7］顯示：環氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）可能在疾病的早期參與AM 的發生，其在AM 內膜間質細胞中的表達上調可能在細胞侵襲中發揮重要作用。在AM 異位子宮內膜組織中β-連環蛋白（β-catenin）表達水平明顯降低，且在AM 發生過程中起重要作用，但COX-2 和β-catenin 在AM 中的具體作用機制尚未完全闡明［8-9］。本研究探討不同程度痛經AM 患者子宮內膜組織和血清中COX-2 和β-catenin 表達水平，并分析其與痛經的關系，為指導臨床AM 的診療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2018 年1 月—2019 年12 月于內蒙古醫科大學附屬醫院婦產科經腹子宮切除的90 例臨床和術后病理確診AM 的痛經患者。年齡29~52 歲，平均年齡（39.3±1.6）歲，采用視覺模擬評分（visual analogue scale，VAS） 法檢測AM 患者痛經程度，無痛經（－）：0 分；輕度疼痛（+）：1~3 分；中度疼痛（?）：4~6 分；重度疼痛（?）：7~10 分［10］。按其痛經程度分為輕度痛經組30 例、中度痛經組30 例和重度痛經組30 例。90 例AM 患者作為AM 組，取其在位子宮內膜和AM 病灶組織及術前血清。由于臨床中行子宮切除并經病理證實的無痛經AM 患者較少，故選取同期于本院經腹子宮切除的30 例無痛經子宮肌瘤（uterinemyoma，UM）患者作為UM 組，取其正常子宮內膜組織和術前血清。UM 組患者年齡30~52 歲，平均年齡（40.7±2.3）歲，術后病理證實為UM 且為正常子宮內膜。所有研究對象經嚴格篩選，納入標準：① 絕經前女性，符合AM 診斷標準［11］，且經術后病理證實；②臨床資料完整；③術前3 個月內未接受激素類藥物治療；④無內分泌、免疫性疾病和惡性腫瘤；⑤符合倫理學標準，受試對象均簽署知情同意書。排除標準：①并發急性炎癥者；②存在內分泌和免疫性疾病及惡性腫瘤者；③生殖器官發育不良者；④并發卵巢囊腫和子宮內膜異位癥等雌激素依賴性子宮內膜相關性疾病者。本研究留取標本前經內蒙古醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會批準（倫理批號：YKDFY2018097），病理切片均由內蒙古醫科大學附屬醫院病理醫師復核。

1.2 主要試劑和儀器兔抗人COX-2 抗體和β-catenin 抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，DAB 顯色試劑盒和S-P 試劑盒購自福州邁新試劑公司，人COX-2 酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購自上海艾博抗貿易有限公司，人β-catenin ELISA 試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。微波爐購自日本SANYO 公司， 雙目光學顯微鏡購自日本OLYMPUS 公司，酶標儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）法檢測2 組患者子宮內膜組織中COX-2 和β-catenin 蛋白表達水平石蠟包埋手術切除的AM 組患者病灶組織、AM 組患者在位子宮內膜組織和UM 組患者正常子宮內膜組織，制備厚4 μm 切片，IHC 法檢測2 組患者子宮內膜組織中COX-2 和β-catenin 蛋白表達水平。所有標本在同一條件下按照試劑盒說明書操作。光學顯微鏡下觀察2 組研究對象的子宮內膜組織，以細胞膜和細胞漿有黃色或棕色顆粒著色為陽性，采用Image J 軟件分析陽性細胞平均灰度值。平均灰度值≥180 為陰性，平均灰度值<180 為陽性，以灰度值代表2 組研究對象子宮內膜組織中COX-2 和β-catenin 蛋白表達水平，灰度值越低，代表COX-2 和β-catenin 蛋白表達水平越高。

1.4 ELISA 法檢測2 組患者血清中COX-2 和β-catenin 水平抽取AM 組和UM 組患者術前清晨空腹肘靜脈血3 mL，分離血清，－80 ℃保存。ELISA 法檢測2 組患者血清中COX-2 和β-catenin水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。采用酶標儀檢測波長450 nm 處吸光度（A）值，以A 值代表2 組患者血清中COX-2 和β-catenin 水平。

1.5 統計學分析采用 SPSS 19.0 統計軟件進行統計學分析。UM 組和AM 患者正常子宮內膜組織和血清中COX-2 及β-catenin 表達水平以x±s表示。多組間樣本均數比較采用Mann Whitney 秩和檢驗，組間樣本均數兩兩比較采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗，采用Spearman 相關系數法進行相關性分析。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2 組患者子宮內膜組織中COX-2 和β-catenin蛋白表達水平COX-2 蛋白主要表達于子宮內膜組織細胞漿中，β-catenin 蛋白主要表達于子宮內膜組織細胞膜或細胞漿中。見圖1。與UM 組比較，AM 組患者子宮內膜組織中COX-2 蛋白表達水平均升高（P<0.05），β-catenin 蛋白表達水平均降低（P<0.05）。與AM 組患者在位子宮內膜組織比較，AM 組患者病灶組織中COX-2 蛋白表達水平升高（P<0.05），β-catenin 蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。與輕度痛經組比較，中度痛經組AM 組患者病灶組織和重度痛經組AM患者在位子宮內膜及病灶組織中COX-2 蛋白表達水平升高（P<0.05），中度痛經組AM 患者在位子宮內膜組織中COX-2 蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。與中度痛經組比較，重度痛經組AM 患者在位子宮內膜和病灶組織中COX-2蛋白表達水平升高（P<0.05）。不同程度痛經組AM 患者在位子宮內膜和病灶組織中β-catenin 蛋白表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表1 2 組患者在位子宮內膜和病灶組織中COX-2 和β-catenin 蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of COX-2 and β-catenin proteins in in situ endometrium tissue and lesion tissue of patients in two groups(±s）

表1 2 組患者在位子宮內膜和病灶組織中COX-2 和β-catenin 蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of COX-2 and β-catenin proteins in in situ endometrium tissue and lesion tissue of patients in two groups(±s）

*P<0.05 compared with UM group； △P<0.05 compared with AM group in-situ endothelium tissue.

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表2 不同程度痛經組AM 患者在位子宮內膜和病灶組織中 COX-2 及β-catenin 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of COX-2 and β-catenin proteins in in situ endometrium and lesion tissues of AM patients in different degrees of dysmenorrhea groups(n=30,±s）

表2 不同程度痛經組AM 患者在位子宮內膜和病灶組織中 COX-2 及β-catenin 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of COX-2 and β-catenin proteins in in situ endometrium and lesion tissues of AM patients in different degrees of dysmenorrhea groups(n=30,±s）

*P<0.05 compared with mild dysmenorrhea group；△P<0.05 compared with moderate dysmenorrhea group.

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圖1 2 組患者在位子宮內膜和病灶組織中COX-2 和β-catenin 蛋白表達情況（IHC,×400）Fig. 1 Expressions of COX-2 and β-catenin proteins in endometrium tissue and lesion tissue of patients in two groups(IHC,×400)

2.2 2 組患者血清中COX-2 和β-catenin 水平與UM 組比較，AM 組患者血清中COX-2 水平升高（P<0.05），β-catenin水平降低（P<0.05）。見表3。與輕度痛經組比較，中度痛經組和重度痛經組患者血清中COX-2 水平升高（P<0.05）。各不同程度痛經組患者血清中β-catenin 水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

表3 2 組研究對象血清中COX-2 和β-catenin 水平Tab. 3 Levels of COX-2 and β-catenin in serum of patients in two groups[±s，cB/（mg·L－1）］

表3 2 組研究對象血清中COX-2 和β-catenin 水平Tab. 3 Levels of COX-2 and β-catenin in serum of patients in two groups[±s，cB/（mg·L－1）］

*P<0.05 compared with UM group.

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表4 不同程度痛經組AM 患者血清中 COX-2 和β-catenin水平Tab. 4 Levels of COX-2 and β -catenin in serum of AM patients in different degrees of dysmenorrhea groups[n=30,±s，cB/（mg·L－1）］

表4 不同程度痛經組AM 患者血清中 COX-2 和β-catenin水平Tab. 4 Levels of COX-2 and β -catenin in serum of AM patients in different degrees of dysmenorrhea groups[n=30,±s，cB/（mg·L－1）］

*P<0.05 compared with mild dysmenorrhea group.

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2.3 AM 組患者在位子宮內膜和病灶組織及血清中COX-2 和β-catenin 表達水平與痛經程度的相關性AM 組患者病灶組織中COX-2 蛋白表達水平與β-catenin 蛋白表達水平呈負相關關系（r=－0.364，P<0.05），即隨著COX-2 蛋白表達水平升高，β-catenin 蛋白表達水平降低。AM 組患者在位子宮內膜和病灶組織中COX-2 蛋白表達水平與患者痛經程度呈正相關關系（r=0.511，P<0.05；r=0.696，P<0.05），即隨著痛經程度加重，其表達水平逐漸升高；AM 組患者在位子宮內膜和病灶組織中β-catenin 蛋白表達水平與痛經程度無相關性（P>0.05）。AM 組患者血清中COX-2 水平與β-catenin 水平呈負相關關系（r=－0.534，P<0.05）；COX-2 水平與痛經程度呈正相關關系（r=0.613，P<0.05），即隨著痛經程度加重，患者血清中COX-2 水平逐漸升高。

3 討 論

上皮-間質細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 是AM 發病的重要因素［12］。研究［13］顯示：子宮和宮腔的手術操作可使子宮內膜及子宮內膜-肌層交界區（endometrial-myometrial interface，EMI）發生損傷，從而激活組織損傷和組織修復機制及子宮內膜向內凹陷，通過EMI 逐漸侵犯子宮肌層。子宮高雌激素和高蠕動狀態也可導致子宮內膜損傷內陷及組織修復，進而發生EMT［3］。EMT 是生物細胞的程序性發育，其特征為細胞黏附喪失、E-鈣黏蛋白表達抑制和細胞遷移率升高［14］。子宮內膜細胞侵犯子宮肌層并于該處增生，進而引起周圍肌層組織增生和肥大，導致子宮腺肌病的形成［15］。研究［16］顯示：分泌期AM 在位內膜組織轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 和Smad3 水平升高，誘導EMT 發生，促進了上述過程。EMT 與細胞E-鈣黏蛋白/β-catenin 復合體的穩定性有密切關聯，E-鈣黏蛋白/β-catenin 復合體負責調控細胞的遷移和侵襲，誘導上皮向間質轉化，這可能與AM 的發生發展有關。

研究［17］顯示：β-catenin 具有雙重功能，根據其在細胞中的定位調節細胞-細胞黏附和基因轉錄的協調。在細胞質膜上，β-catenin是E-鈣黏蛋白/β-catenin 單元的組成部分，維持細胞分化和正常結構的穩定性。β-catenin 的核易位依賴于Wnt 信號通路，而核β-catenin 可以作為轉錄激活因子調節細胞的增殖和分化。WANG 等［18］發現：過表達Talin1通過激活Wnt/β-catenin 通路誘導EMT，增強AM在位子宮內膜和異位子宮內膜組織中上皮細胞的遷移及侵襲能力。YOO 等［19］發現：在子宮內膜增生期和分泌期，AM 在位子宮內膜和腺肌病灶組織的上皮細胞中TGF-β2 水平明顯高于正常子宮內膜組織，且子宮內膜上皮細胞中β-catenin 與TGF-β2 呈顯著正相關關系，證實β-catenin 激活TGF-β2 導致子宮內膜上皮細胞發生EMT，從而促進AM 的發生發展。LIU 等［20］研究顯示：腫瘤壞死因子α 誘導蛋白8 樣2 （tumor necrosis factor -α-induced protein -8-like 2，TIPE2） 在AM 患者在位和異位子宮內膜組織中水平降低，其主要通過靶向β-catenin 逆轉EMT，有效抑制子宮內膜細胞的遷移和侵襲。本研究結果顯示：與UM 組比較，AM組患者病灶和在位子宮內膜組織中β-catenin 蛋白表達水平降低，提示AM 的發生可能是由于在位子宮內膜組織細胞質膜上β-catenin 表達減少，E-鈣黏蛋白/β-catenin 復合體穩定性降低，導致在位子宮內膜組織中細胞間黏附能力降低，出現細胞遷移和侵襲，誘導EMT。且AM 組患者在位子宮內膜組織與病灶組織中β-catenin 蛋白表達水平無明顯差異，表明AM 病灶組織細胞與其在位子宮內膜組織細胞的來源可能是相同的，即在位子宮內膜組織中細胞發生EMT，通過EMI，逐漸侵犯子宮肌層，最終形成AM 病灶。本研究結果顯示：與UM 組比較，AM 組患者血清中β -catenin 水平降低，提示β-catenin 在AM 子宮內膜組織和血清中的調控作用可能是相同的。本研究中AM 患者子宮內膜組織和血清中β-catenin 表達水平與痛經程度無相關關系，且不同程度痛經組AM 患者病灶組織中β-catenin 表達水平也無明顯差異，表明β-catenin 表達水平降低可能只是參與了AM 的發生，未進一步參與AM 痛經程度的加重，這與黃先華等［21］研究結果一致。

COX-2 是花生四烯酸轉化為前列腺素（prostaglandin，PG）的限速酶，PG 與痛經程度直接相關。研究［22-24］顯示：COX-2 對于增強子宮內膜腺體的侵襲能力和加劇局部炎癥損傷具有調控作用。上調COX-2 表達可以誘導EMT［25-26］。部分醫源性操作導致EMI 破壞，引起血小板聚集和缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）生成，發生組織缺氧，進而激活血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF） 和COX-2 等信號通路，導致血管生成。同時COX-2高表達可能導致PGE2 生物合成釋放增加，增強子宮內膜腺體的侵襲能力并增加子宮收縮能力，導致痛經［27］。研究［11］顯示：正常子宮內膜、在位子宮內膜和異位子宮內膜組織中COX-2 表達與月經量和痛經程度有關。在COX-2 抑制劑塞來昔布治療的AM 模型小鼠中可觀察到EMT 逆轉，子宮內膜纖維化減少，表明COX-2 表達抑制可顯著誘導子宮內膜間質細胞凋亡，抑制EMT 發生［28］。本研究結果顯示：與UM 組比較，AM 組患者在位子宮內膜和病灶組織中COX-2 蛋白表達水平升高，且與AM 組患者在位子宮內膜組織比較，AM 組病灶組織中COX-2 蛋白表達水平升高，提示COX-2 蛋白表達水平升高有利于AM 患者在位子宮內膜組織中細胞向AM 病灶處遷移和侵襲，促進了AM 的發生發展。與UM 組比較，AM 組患者血清中COX-2 水平升高，提示AM 子宮內膜組織和血清中COX-2起相同作用。本研究結果顯示：與輕度痛經組比較，中度痛經組AM 患者病灶組織和重度痛經組AM 患者在位子宮內膜及病灶組織中COX-2 蛋白表達水平升高，且與中度痛經組比較，重度痛經組AM 患者在位子宮內膜和病灶組織中COX-2 蛋白表達水平升高，COX-2 蛋白表達水平與痛經程度呈正相關關系，提示COX-2 參與了AM 的發生發展，并對痛經有促進作用。AM 組患者子宮內膜組織和血清中COX-2 表達水平升高與β-catenin 表達水平降低有關聯。β-catenin 是Wnt 信號通路的關鍵調控因子，由于細胞質膜中的β-catenin 向細胞核中轉移導致其表達水平降低，并通過激活細胞核內的Wnt 信號靶基因COX-2、C-myc 和CyclinD1 等因子轉錄和相應蛋白表達增強促進細胞生長和增殖，抑制細胞凋亡，進一步加劇了EMT 的發生［9］。膜聯蛋白A2 等細胞因子可能通過使細胞核外的β-catenin 表達下調并借助其介導的信號轉導通路，上調細胞核中COX-2 的表達［29］。

綜上所述， COX-2 表達水平升高和β-catenin表達水平降低及二者的關聯性均可誘導AM 發生和子宮內膜異位侵襲，COX-2 高表達可能促進了痛經的發生發展。檢測患者血清中COX-2 水平可能成為診斷和監測AM 的新的標記物，為AM 相關痛經的有效治療靶點藥物研究提供參考。