新型冠狀病毒快速檢測標本前處理方法改良及其效果評價

萬廣財, 李 鋌, 孫唯秀, 于秀艷

（吉林省腫瘤醫院檢驗科，吉林 長春 130012）

新型冠狀病毒又稱嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）是β 屬的單股正鏈RNA 病毒，直徑為60~140 nm，病毒外觀呈棘突樣的球形［1-2］。SARS-CoV-2 具有傳染性強、傳播速度快和易突變等特點，在國內外流行性傳播［3-4］。隨著SARSCoV-2 的變異，其毒力減弱，但免疫逃逸能力增強。奧密克戎是SARS-CoV-2 的變異株，易感染人的支氣管，但對肺部的損傷較輕。目前主要流行的變異株為奧密克戎XBB.1.5、 XBB.1.16 和 EG.5變異株。EG.5 變異株的F456L 和Q52H 基因發生突變，導致其對人體的呼吸道上皮細胞具有較強的親和力。及時和高效地檢出SARS-CoV-2 及其變異株對新型冠狀病毒感染（corona virus disease 2019，COVID-19）的防治尤為重要。

《新型冠狀病毒肺炎防控方案第十版》指南［5］將實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR） 法作為確診SARS-CoV-2 陽性患者的金標準［6］。RT-qPCR 法具有靈敏度、特異性和精確性較高的特點，廣泛應用于SARS-CoV-2 核酸檢驗［7］。目前多采用胍鹽聯合56 ℃、30 min 水浴的前處理方式以提高滅活效果，但其對SARS-CoV-2檢測結果的影響尚未見報道。此外，SARS-CoV-2附著于呼吸道上皮細胞，傳統的SARS-CoV-2 核酸檢測方法通過單管震蕩SARS-CoV-2 標本提高上皮細胞中SARS-CoV-2 檢出率，該方法使用廣泛，但較為耗時。本研究通過改良的SARS-CoV-2 前處理檢測技術，提高SARS-CoV-2 核酸檢測效率，為高效和快速地檢測SARS-CoV-2 及相關冠狀病毒提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2022 年3 月—2022 年9 月吉林省腫瘤醫院SARS-CoV-2 陰性標本90 例和SARS-CoV-2 陽性標本30 例。納入標準：①有RT-qPCR 檢測結果；②有內參基因的擴增曲線。排除標準：① 無RT-qPCR 檢測結果；② 無內標基因的擴增曲線。研究符合《赫爾辛基宣言》原則。

1.2 主要試劑和儀器核酸提取試劑（批號：20210802A） 和SARS-CoV-2 核酸擴增試劑（批號：20210802A）（上海伯杰醫療科技有限公司），鄭州標源質控品（批號：20210216，濃度為316~3 160 copies·mL－1），含胍鹽的病毒采樣管（批號：20210168，北京熱景生物技術股份有限公司）。全自動核酸提取儀（BG-Abot-96，上海伯杰醫療科技有限公司）， RT-qPCR 儀（ABI7500， 美國Thermofisher 公司），數顯三用恒溫水箱（LH-600，上海皓莊儀器有限公司）。

1.3 研究對象分組分別用傳統方法和2 種改良方法檢測90 例SARS-CoV-2 陰性標本及30 例SARS-CoV-2 陽性標本，按照檢測方法分為傳統組、改良1 組和改良2 組。傳統組采用胍鹽聯合56 ℃、30 min 水浴方式滅活、單管震蕩、標本去編號和單手開蓋方式檢測；改良1 組采用胍鹽滅活、單管震蕩、標本去編號和單手開蓋方式檢測；改良2 組采用胍鹽滅活，上下、左右和180 度角的方式整批震蕩，標本去編號及單手開蓋方式檢測。見圖1。

圖1 改良2 組上下、左右和180 度角的震蕩方式示意圖Fig. 1 Schematic diagram of oscillation ways of vertical,horizontal, and at a 180-degree angle in modified 2 group

1.4 核酸提取各組分別加入200 μL 待測標本、3 個陰性對照、1 個陽性對照和1 個質控品（鄭州標源生物科技有限公司）。采用上海伯杰全自動核酸提取儀及其配套提取試劑進行核酸提取。

1.5 RT-qPCR 法檢測各組標本采用RT-qPCR法檢測各組標本中SARS-CoV-2 內參基因、N 基因和ORF1ab 基因。反應體系：12 μL 核酸擴增反應液、4 μL 酶混合液和4 μL ORF1ab/N 反應液。反應條件：50 ℃、10 min 逆轉錄，95 ℃、5 min 預變性，95 ℃、10 s，55 ℃、40 s，共45 個循環。每次實驗使用同一批號試劑平行測量3 次，取平均循環閾值（cycling threshold，Ct） 值，記錄各組標本SARS-CoV-2 檢出時間。

1.6 統計學分析采用GraphPad Prism 8.0 統計軟件進行統計學分析并繪圖。采用Spearman 相關分析法分析2 組間Ct 值的相關性，相關系數（r）越接近1，相關性越強。采用Bland-Altman 法對2 組間Ct 值進行一致性檢驗［5］。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組SARS-CoV-2 相關性分析改良1 組Ct 值（29.87±1.68） 與傳統組Ct 值（29.92±1.65） 具有強相關性（P<0.01），線性回歸方程為Y=0.992 7X+0.175 6，r=0.975 4（0.966 2—0.982 1）。改良2 組（29.90±1.63） 與傳統組（29.92±1.65）的Ct 值具有強相關性（P<0.01），線性回歸方程為Y=0.975 9X+0.704 6，r=0.986 2（0.980 9—0.990 0）。見圖2~4。

圖2 改良1 組和傳統組目的基因擴增曲線Fig. 2 Amplification curves of target genes in modified 1 group and traditional group

圖3 改良2 組和傳統組目的基因擴增曲線Fig. 3 Amplification curves of target genes in modified 2 group and traditional group

圖4 各組SARS-CoV-2 相關性分析Fig. 4 Correlation analysis on SARS-CoV-2 between various groups

2.2 各組SARS-CoV-2 一致性檢驗改良1 組與傳統組檢測SARS-CoV-2 陰性標本的組間偏差為0.158 2（－0.613 7—0.930 1），檢測SARS-CoV-2陽性標本的組間偏差為0.117 0 （－0.403 1—0.637 1），2 組間Ct 值偏差均小于1，證實改良1 組與傳統組呈良好的一致性。改良2 組與傳統組檢測SARS-CoV-2 陰性標本的組間偏差為0.015 7（－0.550 4—0.581 8），檢測SARS-CoV-2 陽性標本的組間偏差為0.022 7（－0.454 1—0.499 4），2 組間Ct 值偏差均小于1，證實改良2 組與傳統組呈良好的一致性。見圖5。

圖5 各組SARS-CoV-2 一致性檢驗Fig. 5 Consistency test for SARS-CoV-2 in various groups

2.3 各組SARS-CoV-2 檢出時間改良1 組檢測90 例SARS-CoV-2標本檢出時間為15 min，改良2 組檢測90 例SARS-CoV-2 標本檢出時間為10 min，傳統組檢測90 例SARS-CoV-2 標本檢出時間為45 min。與傳統組比較，改良組1 檢出時間可減少約67%，改良2 組檢出時間可減少約11%。

3 討 論

SARS-CoV-2 具有極強的傳染力，人群普遍易感；其主要通過與肺泡上皮細胞表達的血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）結合而侵入人體［8-9］。ACE2 可參與SARS-CoV-2全部生命周期活動［10］。SARS-CoV-2 侵入人體后，疾病進展迅速，主要表現為呼吸困難、嗅覺和味覺消失。研究［11-12］表明：奧密克戎變異株的K417N、E484A、N501Y、F456L 和Q52H 基因及Delta 變異株的刺突蛋白發生變異，使SARS-CoV-2 致病力減弱，免疫逃逸能力增強。因此需要一種快速和高效的核酸檢驗方法檢出SARS-CoV-2。

本研究結果顯示：通過將胍鹽聯合56 ℃、30 min 水浴方式滅活改良為胍鹽滅活，可減少約66%的SARS-CoV-2 檢出時間，2 種滅活方式的Ct值具有強相關性和良好的一致性，提示胍鹽滅活可替代傳統滅活方式。將單管震蕩改良為上下、左右和180 度角整批震蕩，檢出時間可減少約11%，2 種震蕩方式的Ct 值具有強相關性和良好的一致性，提示上下、左右和180 度整批震蕩可替代單管震蕩。改良震蕩方式的檢出時間更短，為更理想的SARS-CoV-2 檢測方法。

SARS-CoV-2 對熱和紫外線敏感，陳培松等［1］研究表明：56 ℃、30min 滅活方式對SARS-CoV-2核酸檢測無明顯影響。胍鹽具有溶解和變性蛋白質的作用，可使核蛋白的二級結構消失。同時胍鹽可滅活核糖核酸酶（ribonuclease，RNase），保護SARS-CoV-2 核酸結構完整性［13-14］。研究［15-20］顯示：胍鹽和56 ℃、30 min 水浴方式均可有效滅活病毒， 保證SARS-CoV-2 核酸含量基本不變，與本研究結果一致。在采用胍鹽滅活的前提條件下，56 ℃、30 min 水浴對上皮細胞中SARS-CoV-2 核酸含量改變無明顯影響，因此在有胍鹽滅活的前提條件下，不推薦56℃、30 min 水浴的滅活方式。

本研究采用的改良SARS-CoV-2 標本檢測方法與傳統檢測方法具有強相關性和良好一致性，可節約核酸檢出時間，提升SARS-CoV-2 核酸檢測效率，可為高效和快速地檢測SARS-CoV-2 及相關冠狀病毒提供參考。