AMPAR在抗AMPAR腦炎合并小細胞肺癌患者中的表達

姚海燕，楊潔，楊新光，2

（1.廣州醫科大學附屬第二醫院神經內科，廣東廣州 510260；2.中山大學孫逸仙紀念醫院神經內科，廣東廣州 510120）

自身免疫性腦炎（autoimmune encephalitis，AE）是一種嚴重且經常致命的疾病，與針對可影響神經元功能的抗原的神經元特異性自身抗體有關?？股窠浽贵w包括針對神經元和膠質細胞的細胞表面或突觸抗原的抗體，以及針對細胞內抗原的抗體?？辜毎砻婵乖目贵w通常是致病性IgG，如抗N?甲基?D?天冬氨酸受體（N?methyl?D?aspartic acid receptor，NMDAR）抗體、抗富亮氨酸膠質瘤失活蛋白1（leucine rich glioma inactivated 1，LGI1）抗體、抗接觸蛋白關聯蛋白樣蛋白2（contactin?associated protein?like 2，CASPR2）抗體、抗γ 氨基丁酸受體（γ?aminobutyric acid，GABA）抗體、抗α?氨基?3?羥基?5?甲基?4?異唑丙酸受體（α?amino?3?hydroxy?5?methyl?4?isoxazolepropionic acid receptor，AMPAR）抗體，致病機制包括受體激動劑或拮抗劑作用、補體級聯的激活、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性以及抗原內化，從而改變細胞表面的抗原密度［1?2］。

AE通常有副腫瘤性的起源，由質膜中表達的腫瘤神經蛋白啟動腫瘤靶向免疫反應，這些抗原呈遞給適應性免疫系統并激活免疫細胞［1?2］?？笰MPAR腦炎是幾種新近描述的自身免疫性疾病之一，以突觸表面蛋白為靶點，引起精神和神經癥狀，目前抗AMPAR 腦炎已報道超過35 例［3?11］。在近一半的抗AMPAR 腦炎患者中發現了腫瘤，提示腫瘤是抗AMPAR腦炎的主要病因之一［11］。

雖然一些抗AMPAR 腦炎患者合并腫瘤的病理表現為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）［9］，但SCLC 與抗AMPAR 腦炎之間的病理學聯系尚不清楚。本研究收集2 例伴抗AMPAR 腦炎和80 例不伴抗AMPAR 腦炎的SCLC 患者，免疫組化檢測肺部腫瘤組織AMPAR的表達并描述其表達特征。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2013 年6 月至2019 年11 月，連續從942 例疑似AE患者中收集腦脊液和（或）血清樣本，所有樣本均檢測AE?IgG，包括抗NMDAR、AMPAR1、AMPAR2、CASPR2、LGI1、GABA 抗體。這些樣本來自不同的醫院，但均在廣州醫科大學第二附屬醫院神經科學研究所進行自身抗體篩查。本研究經廣州醫科大學第二附屬醫院倫理委員會批準（2019?hs?11，2020?hs?54），所有患者均知情同意。

1.2 AE抗體檢測和AMAPR?IgG鑒定

參照文獻［12］使用商業化標準的大鼠海馬和小腦組織切片，采用間接免疫熒光法檢測腦脊液和（或）血清AE 抗體。將未稀釋的腦脊液或1∶10稀釋的血清與商業化切片在室溫下孵育3 h，洗滌后與帶有熒光標記的山羊抗人IgG 血清室溫下孵育2 h，洗滌后在顯微鏡下觀察熒光模式和熒光強度。使用基于細胞法（cell?based assay，CBA）試劑盒（德國Euroimmun）檢測AE 抗體陽性的樣本AMPAR1 和AMPAR2抗體表達。

1.3 腫瘤組織的抗神經元抗體免疫組化檢測

收集來自廣州醫科大學附屬第二醫院的兩名抗AMPAR 抗體陽性并且合并SCLC 患者的肺部腫瘤組織切片和80 份商業的無AE 表現的人SCLC 組織芯片（西安Ailina Biotech）。參照文獻［13］，采用親和素?生物素化酶復合物免疫染色方法進行免疫組化檢測。將組織芯片及切片在二甲苯中浸泡3次，每次浸泡5 min，然后在100%乙醇、95%乙醇和90%乙醇中分別浸泡5 min。蒸餾水沖洗，然后PBS洗3 次。室溫下用10%山羊血清孵育芯片及切片30 min 阻斷非特異性蛋白質結合，然后4 ℃下切片分別與CRMP5、NMDAR、AMPAR1、2 等一抗（1∶300稀釋，北京Bioss）以及患者腦脊液（1∶1）孵育過夜。用PBS 洗滌芯片及切片，用含30%甲醇和30%過氧化氫的PBS孵育20 min，PBS洗3次。組織芯片及切片與二抗室溫下孵育2 h，鹽酸二氨基聯苯胺（棕色）染色，最后用蘇木精反染（藍色），顯微鏡下觀察，細胞染色呈棕色為抗體陽性表達。

2 結果

2.1 AMPAR?IgG檢測

4 例（0.4%，4/942）患者的腦脊液和血清抗AMPAR 抗體陽性，其中3 例患者經病理證實為SCLC，2例患者肺部腫瘤組織可用于免疫組化檢測。所有3 例患者的臨床資料見表1。3 例患者皆為男性，都出現記憶迅速下降和精神行為異常，磁共振成像（MRI）均顯示非特異性腦損傷。

表1 抗AMPAR2抗體陽性患者3例臨床資料

2.2 抗神經元抗體免疫組化檢測

2 例AMPAR?IgG 陽性患者腫瘤組織免疫組化檢測顯示AMPAR1、AMPAR2、CRMP5 均為強陽性，但NMDAR 為陰性。1 例AMPAR2 抗體陽性患者肺部腫瘤組織AMPAR2 高表達，并與患者的腦脊液抗體發生反應。見圖1，圖2。80例無AE的SCLC患者肺部腫瘤組織AMPAR2均為陽性。

圖2 小細胞肺癌患者肺部腫瘤組織中的免疫組化檢測

3 討論

抗AMPAR 腦炎既往少見報道，H?ftberge等［9］在10 573 例疑似AE 或副腫瘤神經綜合征的患者中檢測出22 例攜帶AMPAR 抗體（0.2%，22/10 573）。本研究僅0.4%的患者（4/942）AMPAR?IgG 陽性，顯示抗AMPAR腦炎在中國患者中也很罕見。

SCLC一直被認為是不同類型AE的重要病因之一。H?ftberge 等［9］報道，SCLC 患者抗GABA 腦炎發生率較高（50%～60%），但僅在22 例抗AMPAR 腦炎患者中發現4 例SCLC（18%），顯示SCLC 在抗AMPAR 腦炎中的比例要低于抗GABA 腦炎。但本研究在4例抗AMPAR腦炎患者中發現了3例（75%）SCLC，高發生率可能與樣本量較小有關，因此需要進一步增加樣本量進行檢測。

副腫瘤性AE 的發生機制尚不清楚。一般來說，腫瘤靶向免疫反應是由腫瘤神經蛋白啟動的，這些蛋白呈現給適應性免疫系統并激活免疫細胞［1］。這些抗原也在神經細胞中表達，因此受到多種途徑的攻擊，包括受體激動劑或拮抗劑作用、補體級聯的激活、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性和抗原內化［1］。

AMPAR 是一類離子型谷氨酸受體，在哺乳動物中高度保守，并介導了大腦中的大部分快速興奮性神經傳遞。針對AMPAR 胞外結構域的抗體已在一組AE 腫瘤患者中被報道，包括胸腺瘤、乳腺癌、小細胞肺癌或非小細胞肺癌［3］。Bataller 等［4］發現，乳腺導管浸潤性腺癌強表達AMPAR，并與AE 患者的IgG 發生反應，從而表明AMPAR?IgG 具有特異性的體液免疫作用。雖然在抗AMPAR 腦炎患者中可以發現SCLC，但目前還沒有病理證據表明神經AMPAR 抗原也在癌細胞中表達，因此我們收集了2例合并抗AMPAR 腦炎的SCLC 患者的肺部腫瘤組織，檢測顯示2 例患者肺部腫瘤組織不僅表達AMPAR 抗原，并且可與患者腦脊液IgG 發生反應。此外，本研究顯示80 例（100%）無AE 的SCLC 患者的腫瘤組織中均有AMPAR 抗原的強表達。目前認為腫瘤表達的AMPAR 可能有助于AMPAR 抗體的產生，從而激活腦炎患者的體液免疫和細胞免疫，這與之前其他腫瘤類型的研究結果一致［4］。雖然目前普遍認為SCLC 的存在是AE 的誘發因素，但抗AMPAR 腦炎或其他類型的AE 只能在少數SCLC 患者中發現［14］。這與我們目前的研究一樣，大部分表達神經元抗原的SCLC 并沒有誘導抗AMPAR 腦炎或其他類型的AE。因此，AE患者中，腫瘤組織蛋白激活適應性免疫系統的主要機制尚不清楚，還必須需要進一步的研究。

總之，本研究顯示SCLC 本身可以表達AMPAR抗原，但其表達的意義尚不清楚，抗AMPAR 抗體在SCLC患者中的致病機制仍不完全了解，還需要進一步進行研究。