急性髓系白血病基因突變譜及其與首次誘導療效的關系

袁杰鋮，蔡曉虹，陳禹欣，4，5，穆亞飛，劉玲玲，陳濤，蒙裕歡，范喜杰，林俊維，沈茂婷，于世輝，4，5

（1.廣州醫科大學金域檢驗學院，廣東廣州 510182；2.廣州市金域轉化醫學研究院有限公司，廣東廣州 510320；3.中山大學血液病研究所中山大學附屬第三醫院血液科，廣東廣州 510630；4.廣州金域醫學檢驗中心有限公司臨床基因組檢測中心，廣東廣州 510320；5.廣州金域醫學檢驗集團股份有限公司，廣東廣州 510320）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一組異質性很高的造血系統腫瘤，在成人急性白血病中占比可達80%，是成人急性白血病最常見的亞類［1］。目前AML 的診斷標準是結合細胞形態學、免疫學、細胞遺傳學和分子生物學的世界衛生組織（WHO）診斷體系［2］。近年來對除急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）之外的其他AML 亞型患者，臨床誘導化療方案主要依賴于蒽環類藥物聯合阿糖胞苷方案（“3+7”方案）［3］。AML 臨床療效與多種因素包括年齡、基礎疾病、誘導方案等相關，不同AML 患者療效往往存在一定差異［4?5］，如接受了相同的誘導治療方案，60 歲以下AML 患者的完全緩解（CR）率（60%～80%）顯著高于60歲以上患者（40%～60%）［6?7］。

近年來隨著二代測序技術在血液腫瘤臨床治療中的廣泛應用，許多與AML 相關的基因突變也被不斷發現［8］。研究表明，基因突變與AML 首次誘導治療療效存在著顯著相關性，如NPM1突變與AML患者首次誘導治療取得完全緩解具有顯著正相關關系［9］。因此，探討基因突變對AML 臨床治療和管理具有重要意義。此外2022 版歐洲白血病網絡（ELN）指南首次將未取得CR 的AML 患者進一步分為部分緩解（PR）和未緩解（NR）［10］，誘導治療后獲得CR 的患者可以選擇進行鞏固治療或骨髓移植，而PR 或NR 患者可以選擇無交叉耐藥的新藥組成聯合化療方案或者骨髓移植等方案進行治療。本研究按AML 患者的首次誘導療效進行分組，并探討組間臨床特征的差異，以期為AML 的臨床治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2018 年1 月至2021 年12 月中山大學附屬第三醫院收治的AML 患者的臨床資料，所有患者均符合2016版WHO 造血和淋巴組織腫瘤分類診斷標準［2］。本研究經中山大學附屬第三醫院醫學倫理委員會批準（倫理審批號：中大附三醫倫［2022］02?018?01）。

1.2 AML相關檢測

1.2.1 形態學檢測 收集患者骨髓樣本，顯微鏡下使用瑞氏染色法觀察細胞形態，并計算200～500 個細胞中各類細胞所占的百分比。

1.2.2 免疫學檢測 使用Cytomics FC500 流式細胞儀（美國Beckman Coulter）進行骨髓樣本流式細胞術檢測，在單激光或雙激光條件下對多種不同的熒光色素進行熒光參數分析，最后使用FCS Express 軟件（美國De Novo Software）分析數據。

1.2.3 核型檢測 收集骨髓樣本進行細胞培養、制片后，使用G顯帶的方法進行染色體條帶分析，選擇染色體分散良好、顯帶清晰、染色良好的核型進行分析，計算染色體總數，觀察有無染色體的數量異?；蚪Y構畸變，并對染色體核型結果進行描述。

1.2.4 基因突變檢測 采用本實驗室血液及造血系統腫瘤175 相關基因靶向深度測序技術（175 genes deep target sequencing，175?Panel）進行患者基因突變檢測，并對檢測結果進行腫瘤體細胞突變的分子病理學協會（Association for Molecular Pathology，AMP）分級［11］，保留AMP 分級中具有強臨床意義的突變（TierⅠ）和潛在臨床意義的突變（TierⅡ）進行下一步的統計分析。

1.3 誘導治療方案

初診AML 患者采用以下方案進行首次誘導治療：IA±D［去甲柔紅霉素（IDA）+阿糖胞苷（Ara?c）±地西他濱）、CAG±D［Ara?c+阿克拉霉素（Acla）+粒系集落刺激因子（G?CSF）±地西他濱］、DA±D［柔紅霉素（DNR）+Ara?c±地西他濱］、維甲酸±三氧化二坤/IA（APL 治療方案）及其他方案，包括MA±D［米托蒽醌+Ara?c±地西他濱］、TA±D［吡柔比星+Ara?c±地西他濱］、HA［高三尖杉酯堿（HHT）+Ara?c］、單用低劑量Ara?c±D、單用去甲基化劑阿扎胞苷或地西他濱等。本研究將IA±D、DA±D、MA±D 等蒽環類聯合阿糖胞苷藥物定義為高強度治療方案，將CAG±D、單用去甲基化劑或地西他濱等定義為低強度化療方案。

1.4 誘導療效評估

AML 患者首次誘導療效評估依據歐洲白血病網絡（ELN）指南（2022年版）［10］，CR定義為治療后骨髓原始細胞＜5%、無髓外疾病、中性粒細胞計數≥1.0×109/L、血小板計數≥100×109/L；PR 定義為治療后骨髓原始細胞比例降至5%～25%，或治療后相比于初診時原始細胞比例降低50%及以上；NR 定義為療效可評估但不符合CR、PR標準。

1.5 統計學處理

采用R 軟件（版本4.1.0）及RStudio 軟件進行統計分析。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗。數據整理使用R 軟件包“tableone”，變異分析使用R 軟件包“maftools”，使用“oncoplot”函數分析AML 患者基因突變譜，使用“somaticInteractions”函數分析基因間共存與互斥關系。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料

共收集AML 患者140 例，其中男68 例、女72例；年齡16～87歲，中位年齡47歲。140例AML患者的一般資料見表1。AML 伴重現性遺傳學異常98例（70.0%），其中AML 伴NPM1亞型患者最多（28例，20.0%）；AML 非特指型42 例（30.0%），以急性原始單核細胞和單核細胞白血病較為常見（17 例，12.1%）。

表1 140例AML患者的一般資料

2.2 基因突變譜及共存互斥分析

采用二代測序（next?generation sequencing，NGS）共檢出451個基因突變位點，分布在60個基因上，其中突變頻率最高的突變基因分別為CEBPA（20.0%），NPM1（20.0%）和WT1（15.0%）。見圖1。由于AML的遺傳復雜性及不穩定性，AML患者往往同時發生幾個突變且突變基因之間存在廣泛共存及互斥情況。突變基因共存與互斥分析顯示，102例（72.9%）患者存在兩種及兩種以上的突變基因，NPM1與DNMT3A、TET2、IDH2存在顯著的共存關系，常共同發生基因突變，此外RUNX1與BCOR、CSF3R也存在顯著的共存關系。見圖2。

圖1 140例AML患者基因突變譜

圖2 基因間共存與互斥關系圖

2.3 首次誘導療效影響因素分析

本研究對140 例AML 中非APL 亞型患者82 例進行下一步首次誘導療效評估，其中54 例（65.9%）獲得CR，19 例（22.9%）獲得PR，9 例（11.0%）獲得NR?；颊呤状握T導療效的影響因素分析顯示，患者初診時血小板數目（P＜0.05）和TET2突變頻率（P＜0.001）組間差異顯著，NR 組PLT 值高于CR 組和PR組，NR組TET2突變頻率顯著高于CR組。見表2。

表2 不同首次誘導療效組AML患者的臨床特征

2.4 TET2 突變降低NPM1 突變AML 患者首次誘導療效

既往研究表明NPM1突變AML 患者首次誘導療效較好［2，9］，但本研究首次誘導療效影響因素分析中并未發現NPM1突變存在顯著組間差異，提示存在可能影響NPM1突變患者首次誘導療效的其他因素。本研究基因共存互斥分析結果顯示TET2突變與NPM1突變存在共存關系，且TET2突變頻率在首次誘導療效影響因素分析中組間差異顯著，提示TET2突變潛在影響NPM1突變AML 患者首次誘導療 效。通過對 比NPM1共突變 組（NPM1與DNMT3A、NPM1與TET2、NPM1與IDH2）之間的首次誘導療效，結果顯示NPM1伴TET2突變患者的誘導完全緩解率最低，不伴TET2突變時NPM1突變患者的誘導完全緩解率有一定的提升，見圖3。

圖3 82例非APL亞型AML患者的首次誘導反應率比較

3 討論

采用本實驗室175?Panel 的NGS 技術檢測AML患者的基因突變，分析140 例AML 患者基因突變譜顯示，CEBPA（20.0%）、NPM1（20.0%）與WT1（15.0%）是最常發生突變的基因。從整體上看，本研究中AML 基因突變譜與既往中國人群或其他地區人群相關研究結果基本一致［12?14］。另外，本研究還揭示了基因之間存在的一些共存與互斥的關系，本研究結果與既往研究結果相比亦大致相同［15］，但是部分基因顯示出了不同的共存情況。本研究中RUNX1與CSF3R基因存在較顯著的共現關系，這一對基因的共存關系在嚴重先天性中性粒細胞減少癥的研究中較常見［16?17］，而在AML 相關研究中尚未見報道，這一對基因共存關系的發現可能對AML 致病機制的研究有一定的參考價值。

AML 患者首次誘導療效受年齡、誘導方案、初診時白細胞數目、核型危險度和基因突變等多種因素影響，其中基因突變對患者首次誘導療效的影響具有重要作用。NPM1是一種腫瘤抑制因子，具有核糖體蛋白的組裝和運輸、中心體控制復制、調控腫瘤抑制因子等多種功能。多項研究表明，伴NPM1突變的AML 患者對誘導治療具有較好的反應［2，9，18］，提示NPM1突變是AML 患者誘導治療后獲得完全緩解的有利因素。TET2是一種與DNA 去甲基化功能相關的腫瘤抑制因子［19］，TET2突變導致功能喪失，與克隆擴增有關，被認為是白血病發生的早期事件［20］。目前，TET2突變與AML 誘導療效的相關性仍存在爭議，有研究認為TET2突變不會對AML 患者誘導治療的反應和長期生存產生顯著影響［21?22］。然而另有研究表明，TET2突變的AML患者誘導完全緩解率顯著降低［23?24］。

本研究發現TET2基因在NR 組的突變頻率最高，且顯著高于CR 組，提示TET2突變顯著降低了AML 患者首次誘導完全緩解率。另外，本研究并未發現NPM1突變患者存在顯著組間差異，與以往研究結果不一致［9，18］。有研究表明，基因間的相互作用可能影響AML 患者的治療效果［25］。通過對比NPM1與DNMT3A、NPM1與TET2、NPM1與IDH2三組共突變組的首次誘導緩解率，NPM1伴TET2突變患者的誘導CR 率最低，僅當不伴TET2突變時NPM1突變患者首次誘導CR 率升高。該結果顯示一個基因對AML 患者首次誘導療效的影響會由于另一個基因的共同突變而發生改變，由單基因突變解釋的患者首次誘導療效可能存在局限性，提示我們需要多基因組合來評估患者誘導療效及長期預后，值得進一步研究。

總之，本研究分析AML 患者整體基因突變譜，顯示CEBPA、NPM1的突變率較高，同一患者可發生多種基因突變，這些基于中國人群遺傳背景下的AML基因變異研究發現對中國人群AML的發生、功能研究及臨床應用具有重要意義。此外，本研究還分析了基因之間的共存與互斥關系，發現RUNX1與CSF3R在AML 患者中存在顯著的共存關系，有助于在分子水平上揭示AML 的發病機制。最后，本研究發現NPM1突變亞型的AML 患者在同時伴有TET2突變時，會降低患者的首次誘導CR 率，提示基因之間的共存關系會影響AML 患者的首次誘導療效，為多基因聯合評估患者預后提供了參考。