強骨通痹膠囊對大鼠骨關節炎炎癥因子的影響及作用機制*

李 浩, 何承建, 張天臣

湖北中醫藥大學第一臨床學院,武漢 430074

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是由于局部退化和環境改變等因素引起的一種骨關節退行性病變[1]。目前西藥治療OA具有起效快和延緩關節軟骨破壞等優勢,但具有較多的不良反應[2]。手術治療的方法雖然能夠矯正關節畸形并恢復關節功能,但因為其較高的醫療費用和感染等風險并沒有得到廣泛的普及[3]。而目前中醫藥治療OA則有經濟簡便、不良反應少和療效顯著等優勢[4]。已有研究顯示,多種健骨方可以顯著緩解OA的癥狀并緩解軟骨損傷[5]。其中組方為骨碎補、牛膝、獨活、續斷、川芎和白芍的強骨通痹膠囊則是治療方法之一。但目前強骨通痹膠囊的組方對骨關節炎的治療機理尚不清楚。

OA和其他炎癥相似,受到Toll樣受體4(Toll-like receptors 4,TLR4)和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)調控[6],而其受累的關節中也存在多種炎性因子的過度表達,這些炎癥因子在OA發生及發展的過程中發揮著至關重要的作用[7]。其中,白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)和白介素6(interleukin-6,IL-6)是關鍵的炎性因子[7]。

許多中藥都被發現具有影響促炎癥因子表達的作用[8-10],本文猜測,強骨通痹膠囊能夠通過調節促炎癥因子進而對OA起到治療作用?；诖?本研究構建大鼠骨關節炎模型,使用強骨通痹膠囊進行治療,探討強骨通痹膠囊對大鼠骨關節炎炎癥因子的影響和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康的雄性4～6周齡SPF級SD大鼠42只,實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2018-0104,于溫度22～26 ℃,相對濕度50%～60%的飼養條件下進行飼養,人工光照明暗各12 h。在本次實驗過程中,按照《實驗動物管理條例》等相關文件標準進行飼養與處置。

1.2 試劑

戊巴比妥鈉(貨號P3761,Sigma公司);葡萄糖胺(貨號G1514,Sigma公司);生理鹽水(貨號YM-S2134,上海遠慕生物科技公司);Trizol(貨號15596026,Ambion公司);中性樹脂(貨號為213,上海國藥公司);甲苯胺藍染色液(貨號G1032,Servicebio公司);DAB濃縮型試劑盒,封閉山羊血清(貨號分別為DA1010,SL038,Solarbio公司);蘇木精,20× Tris-EDTA修復液pH 9.0(貨號分別為G1004,G1203,Servicebio公司);IL-1β酶聯免疫試劑盒,TNF-α酶聯免疫試劑盒,IL-6酶聯免疫試劑盒,TLR4蛋白一抗(貨號分別為RA20020,RA20035,RA20607,PAB33926,Bioswamp公司);大鼠磷酸化核因子(p-NF-κB)蛋白一抗(貨號為Ab32360,Abcam公司);MaxVisionTMHRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit(貨號KIT-5020,邁新公司)。

1.3 儀器

熒光定量PCR儀(型號CFX-Connect 96,Bio-Rad公司);正置顯微鏡(型號V116295,尼康公司);正置顯微鏡(型號JZYQ,皆準公司);石蠟切片機(型號API-365,艾普公司);攤片烤片機,生物組織包埋機-冷凍機(型號分別為TK7218,HS-B,恒松公司);生物組織包埋機(型號KH-BL1,孝感闊海公司);自動組織脫水機(型號ZT-12 P2,亞光病理公司);全自動化學發光分析儀(型號FST-I-05,普力菲爾公司)

1.4 大鼠骨性關節炎模型的構建

根據前交叉韌帶切除模型中類似骨關節炎早期或中期的特點,進行模型構建[11]。采用抽簽法將42只SD大鼠隨機分為2組,對照組6只,造模組36只。用戊巴比妥鈉對SD大鼠腹腔麻醉后,經膝關節內側縱向切口,切斷前交叉韌帶,避開關節軟骨面,逐層縫合關閉創口。術后每天向每只大鼠手術部位注射丁胺卡那霉素,連續3 d,籠內自由活動。術后6周大鼠膝骨性關節炎模型建立。使用HE染色觀察大鼠膝關節軟骨組織形態進行模型鑒定。

1.5 動物分組和藥物干預

按抽簽法取造模成功的大鼠18只,隨機分為模型組、強骨通痹膠囊組、葡萄糖胺組,每組6只。對照組和模型組每天灌胃生理鹽水,強骨通痹膠囊組用強骨通痹膠囊水溶液(7.2 mg每公斤體重)灌胃,葡萄糖胺組作為陽性對照組,用葡萄糖胺水溶液(90 mg每公斤體重)灌胃。每天給藥1次,連續給藥12周后,經戊巴比妥鈉麻醉處死,取軟骨組織。

1.6 HE染色觀察大鼠關節炎軟骨組織形態

使用蘇木精-伊紅(HE)染色法對OA大鼠進行模型鑒定。取模型大鼠膝關節于10%中性甲醛中固定48 h后放入脫鈣液中脫鈣,5～7 d更換一次脫鈣液,45 d后查看骨組織脫鈣情況,若骨能用刀切割成片時,說明脫鈣已完成,否則需放入脫鈣液中繼續脫鈣。脫鈣結束的骨組織用自來水沖洗24 h后常規步驟脫水浸蠟包埋,切片厚度為3 μm,水浴展片后將切片貼附于載玻片上,然后將切片放入展片器展片,貼平粘緊后烤片。根據HE染色法對組織切片進行染色,顯微鏡下拍照,Leica Application Suite系統采集樣本相關部位圖片。

1.7 甲苯胺藍染色觀察大鼠關節炎軟骨組織形態

同1.6中方法獲取膝關節切片,以甲苯胺藍染色法對組織切片進行染色,通過顯微鏡拍照,Leica Application Suite圖像系統采集樣本相關部位圖片。

1.8 qRT-PCR法檢測大鼠關節炎軟骨組織中TLR4、NF-κB的mRNA水平

取大鼠關節炎軟骨組織100 mg于放有1 mL Trizol的勻漿管中,勻漿機勻漿20 s后放于冰上裂解細胞,抽提總RNA進行反轉錄。再按照SYBR GREEN PCR Kit說明書進行qRT-PCR。引物序列見表1。以GAPDH作為內參,用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

表1 引物序列信息

1.9 免疫組化法檢測關節炎軟骨組織中TLR4、p-NF-κB水平

同1.6獲取膝關節切片,二甲苯中脫蠟,水化抗原修復后進行阻斷,用10%山羊血清進行封閉,先后孵育一抗(TLR4、p-NF-κB)、二抗(maxvision),經DAB和蘇木精染色后,脫水、透明、封片并通過顯微鏡拍照,Leica Application Suite圖像系統采集樣本相關部位,蘇木精染細胞核為藍色,DAB陽性為棕黃色。

1.10 ELISA檢測大鼠關節炎軟骨組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平

根據IL-1β酶聯免疫試劑盒,TNF-α酶聯免疫試劑盒以及IL-6酶聯免疫試劑盒的說明書,對各組大鼠關節炎軟骨組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平進行檢測。

1.11 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示,組間均數比較采用t檢驗,多組間均數比較使用單因素方差分析,以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 OA大鼠模型鑒定

術后6周可觀察到對照組大鼠自主活動和行走正常,模型組大鼠均可正常行走、活動,但自主活動明顯較少。取大鼠關節軟骨組織進行HE染色,結果(圖1)顯示,與對照組相比,模型組膝關節可見大量炎性細胞浸潤,滑膜組織明顯增厚,表明OA模型建立成功。

圖1 大鼠膝關節軟骨組織(HE染色,×200)

2.2 軟骨組織的甲苯胺藍染色結果

圖2顯示,與對照組相比,模型組軟骨組織中的硫酸軟骨素明顯減少,呈現明顯的軟骨素流失狀態,而強骨通痹膠囊組的硫酸軟骨素雖然沒有達到對照組的水平,但相比模型組有一定程度的增加。葡萄糖胺組的硫酸軟骨素比起模型組則增加明顯。

圖中黃色箭頭指向區域表示硫酸軟骨素被甲苯胺藍異染呈紫紅色

2.3 軟骨組織中NF-κB、TLR4 mRNA表達水平比較

各組軟骨組織中的NF-κB和TLR4的表達水平均有顯著差異(P<0.05)。和對照組相比,模型組的NF-κB、TLR4 mRNA表達水平都明顯上升(均P<0.05);而強骨通痹膠囊組和葡萄糖胺組的NF-κB和TLR4的表達水平比起模型組則明顯下降(均P<0.05),但都明顯高于對照組(均P<0.05)(表2)。

表2 軟骨組織中NF-κB和TLR4 mRNA表達水平比較

2.4 軟骨組織的免疫組化染色結果

圖3和表3顯示,對照組的NF-κB和TLR4的免疫組化染色幾乎呈陰性,而模型組染色明顯(均P<0.05);強骨通痹膠囊組和葡萄糖胺組的NF-κB和TLR4的免疫組化染色強度比起模型組有明顯減弱(均P<0.05)。

圖3 各組的TLR4、NF-κB免疫組化染色結果(×200)

表3 各組免疫組化染色的平均吸光度

2.5 軟骨組織中IL-1β、TNF-α、IL-6濃度比較

和對照組相比,模型組的IL-1β、TNF-α、IL-6濃度都明顯上升(均P<0.05);而強骨通痹膠囊組和葡萄糖胺組的IL-1β、TNF-α、IL-6濃度比起模型組則明顯下降(均P<0.05),但都明顯高于對照組(均P<0.05)(表4)。

表4 軟骨組織中IL-1β、TNF-α、IL-6濃度比較

3 討論

OA屬于中醫學的骨痹、痹證、筋痹等范疇[12]。骨碎補氣味苦、性溫,歸屬于肝、腎經,具有補腎強骨、療傷止痛的功效;獨活則能夠祛濕散寒,除痹活絡止痛;而牛膝則能夠強筋健骨固肝腎,這幾種藥材對于OA均有一定的治療效果[13-15]。本次實驗結果顯示,和對照組相比,軟骨組織炎癥模型的硫酸軟骨素明顯減少,但經過強骨通痹膠囊和葡萄糖胺分別處理后,硫酸軟骨素明顯增多,說明強骨通痹膠囊的藥效和葡萄糖胺相似,能夠讓軟骨組織的硫酸軟骨素增加,對OA有一定的治療效果,與之前報道的中藥方對關節炎的治療效果[16]一致。

TLRs被認為是先天免疫和缺血誘導性炎癥的主要因素,是組織損害的關鍵傳感器。氧化應激會通過提高NF-κB mRNA的活性增強TLR-8介導的中性粒細胞的炎癥反應[17]。氧化應激會先提高NF-κB的活性并激活其信號通路,使MyD88激活并介導TLR4胞內信號通路,最終產生促炎因子[6]。OA的發生發展與TLR4/NF-κB通路的激活關系密切,該通路的激活顯著促進軟骨細胞的凋亡和炎癥反應[18]。當炎癥因子進入細胞時,TLR4促進MyD88,進而促進NF-κB磷酸化,進一步激活炎癥因子的表達[19]。本次研究發現,模型組的TLR4和NF-κB mRNA的表達水平都顯著高于對照組;但在經過強骨通痹膠囊和葡萄糖胺分別處理后,TLR4和NF-κB mRNA的表達水平相較于模型組均有顯著下降;免疫組化結果與之類似,模型組的TLR4和NF-κB染色明顯強于對照組,但強骨通痹膠囊組和葡萄糖胺組的染色則都弱于模型組,表明強骨通痹膠囊和葡萄糖胺的功效相似,能夠抑制TLR4和NF-κB的表達。

除此之外,OA的病癥和與炎癥相關mRNA調控的細胞因子也密切相關。根據細胞因子在軟骨細胞代謝中所發揮的作用可將其分為分解性因子和合成性因子,兩種因子之間維持著一種平衡,當這種平衡被打破就會導致骨關節的軟骨基質被降解、破壞,從而形成骨性關節炎[20]。研究表明,TLRs被激活后,可通過MyD88活化IL-1受體相關激酶、TGF-β活化激酶,進而激發IκB激酶級聯反應,激活核轉錄因子,從而啟動與炎癥免疫有關的IL-1β、TNF-α等基因的表達,產生大量IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子[21]。IL-1β和TNF-α是軟骨損傷病變位置分泌的主要細胞因子,主要促進降解軟骨基質的蛋白酶的合成與釋放,參與了軟骨損傷過程[22]。TNF-α還可參與腸道微生物紊亂造成TLR4升高的過程[23]。IL-6是一種由單核吞噬細胞分泌的具有多重生物活性的細胞因子,不但能夠刺激關節滑膜內的B淋巴細胞,激活自身免疫引導,導致滑膜內發生炎性反應,還能夠促進軟骨基質降解破壞和抑制軟骨細胞修復合成[24]。且IL-6可被TLR4的下行信號MyD88調控[19]。本次研究發現,和對照組相比,模型組的IL-1β、TNF-α、IL-6濃度明顯上升;而強骨通痹膠囊組和葡萄糖胺組的IL-1β、TNF-α、IL-6濃度比起模型組則明顯下降,表明強骨通痹膠囊和葡萄糖胺的藥效相似,均能夠抑制其中炎癥因子的表達,和早前報道[25]的中藥方對細胞因子的抑制效果相一致。

綜上所述,強骨通痹膠囊能夠通過抑制TLR4和NF-κB的表達,從而抑制炎癥因子的產生,達到治療骨關節炎的效果。提示了強骨通痹膠囊有作為治療骨關節炎的藥物的潛力,且其對于炎癥因子誘發的疾病有一定的治療效果。