蘿卜硫素減輕子宮內膜異位癥大鼠模型的慢性機械性疼痛

康 樂 戴 虹 蘇婷婷

(同濟大學附屬楊浦醫院婦產科,上海 200000)

子宮內膜異位癥(endometriosis,EMs)是臨床常見的一種婦科疾病,是指本該生長在子宮內的內膜組織長到了宮腔以外,比如卵巢組織、輸卵管或盆腔等,這種情況會導致女性出現痛經、盆腔痛、不孕等現象,還會增加卵巢癌患病風險,給女性身心健康帶來很大困擾[1]。EMs的致病因素較為復雜,引發的疼痛臨床治療難度較大,如何能夠有效減輕或緩解EMs及疼痛,是目前眾多學者關注的一個熱點。蘿卜硫素是一種異硫氰酸鹽,研究發現,蘿卜硫素具有抗炎、抗氧化、調控細胞增殖/凋亡等作用,并且對于乳腺癌、前列腺癌等癌癥具有較好的防治效果[2]。有研究[3]發現,蘿卜硫素對EMs具有一定的保護作用,而且目前關于蘿卜硫素對EMs的保護機制研究較少。因此,本實驗通過建立大鼠EMs模型,研究蘿卜硫素是否能夠減輕EMs大鼠的機械性疼痛及可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:8～9周齡雌性SPF級SD大鼠90只,體質量(200±20)g,由常州卡文斯實驗動物有限公司提供,生產許可證號【SCXK(蘇)2016-0010】。所有大鼠均飼養在同濟大學附屬楊浦醫院動物房內,動物使用許可證號【SYXK(滬)2020-0002】,飼養環境:室溫20～26 ℃,濕度40%～70%、光照條件采用12 h/12 h晝夜間斷照明。研究已由機構動物護理和倫理委員會審核批準,倫理審批號:20230923,遵循《實驗動物的護理和使用指南》,并按實驗動物使用的“3R”原則給予人道的關懷。

1.1.2主要試劑與儀器:蘿卜硫素(YG10777)(上海韻泰信息科技有限公司);HMGB1抑制劑丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate,EP)(深圳海思安生物技術有限公司);TLR4抑制劑TAK-242(上海吉至生化科技有限公司);HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA試劑盒(SEKM-0145、SEKM-0034、SEKM-0007、SEKM-0010)(北京索萊寶科技有限公司);兔抗HMGB1(ab18256)、兔抗TLR4(ab13556)、兔抗MyD88(ab13556)、兔抗TPRV1(ab6166)、山羊抗兔IgG(ab150077)(Abcam公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)(碧云天生物工程有限公司)。Von Frey電子測痛儀(上海玉研儀器公司);低溫高速離心機(湖南凱達離心機廠);熒光化學發光成像系統(上海培清科技公司)。

1.2 方法

1.2.1EMs模型的構建:取正常大鼠,造模前連續5 d灌胃0.02 mg/kg己烯雌酚,使大鼠處于動情期。參照大鼠EMs[4]造模方法,大鼠采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉35 mg/kg麻醉后固定,對腹部皮膚進行脫毛并消毒,在尿道上端1～2 cm處,縱向切開皮膚及腹壁,暴露左側子宮,離卵巢1 cm處剪取2 cm子宮,斷端結扎。將所取子宮組織置于洛氏營養液中,剪取5 mm×5 mm內膜固定并縫合在腹壁上,之后使用0.9%氯化鈉溶液對移植部位進行沖洗,縫合切口。另設Sham組,取正常大鼠,與上述操作相同,但不進行內膜移植,僅在開腹后,在離卵巢1 cm處剪取2 cm子宮并對其斷端進行結扎。術后腹腔注射1.6×105U/kg青霉素以防感染。所有大鼠手術后正常喂養。子宮內膜組織異位后會因積液產生凸起,積液高度>1.5 mm,表示模型構建成功。建模后,每組隨機選擇3只大鼠于動情期再次開腹觀察移植物生長情況。飼養和造模過程中共有21只大鼠死亡,其中蘿卜硫素低劑量組的大鼠存活只數最少,為10只,故后續每組取10只大鼠進行指標檢測。

1.2.2分組及給藥:將造模成功的大鼠隨機分為5組,每組10只,包括:EMs組、蘿卜硫素低、高劑量組、HMGB1抑制劑組(EP組)、TLR4抑制劑組(TAK-242組)。Sham組大鼠同樣為10只。將蘿卜硫素使用0.9% 氯化鈉溶液進行稀釋,每日通過灌胃方式給藥:蘿卜硫素低、高劑量組大鼠分別給予5 mg/kg和15 mg/kg蘿卜硫素;Sham組和EMs組每日灌胃相同體積0.9% 氯化鈉溶液;EP組和TAK-242組每隔一日分別腹腔注射40 mg/kg的EP溶液和3 mg/kg的TAK-242溶液。各組均給藥14 d。

1.2.3機械痛閾的測量:將大鼠放置在塑料固定箱(466 mm×300 mm×215 mm)中,固定箱除底部為金屬鐵架外,其余皆為透明塑料板。待放入30 min適應環境后開始測定。通過電子測痛儀來檢測,將探針從底部沿金屬欄邊緣刺向大鼠后爪腳掌正中勻速施加壓力,大鼠出現縮爪、逃跑或尖叫時記錄此時壓力值。此壓力值即為機械痛閾值(paw withdrawal threshold,PWT)。每只大鼠重復測定3次,每次測量時間間隔30 s,取平均值。

1.2.4ELISA檢測大鼠血清HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10水平:將大鼠從頸動脈取血4 mL,4 ℃靜置1 h,以3500 r/min低溫離心10 min,將分離的血清分裝到EP管中,-80 ℃冷凍保存。測定時取出血清,快速解凍,分別按照HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA試劑盒說明書嚴格操作,檢測血清中HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10的含量。

1.2.5Western blot法檢測大鼠異位子宮內膜組織HMGB1、TLR4、MyD88和TPRV1蛋白水平:頸椎脫臼法處死大鼠,剝離異位子宮內膜組織,-80 ℃冷凍保存。待進行實驗檢測時,取出,快速解凍。在液氮中研磨,使用RIPA試劑盒提取總蛋白,根據BCA試劑盒測定蛋白的濃度,計算上樣量。SDS-PAGE凝膠電泳后,半干轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;5%脫脂奶粉封閉1 h;分別加入一抗兔抗HMGB1、兔抗TLR4、兔抗MyD88、兔抗TPRV1、兔抗β-actin(1∶500),4 ℃孵育過夜;加入二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h。經化學發光法進行檢測,Tanon軟件拍攝圖像并進行半定量分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠PWT

與Sham組相比,EMs組大鼠PWT明顯降低(P<0.05)。與EMs組相比,蘿卜硫素低、高劑量組、EP組和TAK-242組大鼠PWT明顯升高(P<0.05)。蘿卜硫素高劑量組作用效果強于蘿卜硫素低劑量組、EP組和TAK-242組。蘿卜硫素低劑量組作用效果則弱于EP組和TAK-242組(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠PWT比較Table 1 Comparison of PWT in each n=10)

2.2 各組大鼠血清HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10水平

與Sham組相比,EMs組大鼠HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10水平明顯升高(P<0.05)。與EMs組相比,蘿卜硫素低、高劑量組、EP組和TAK-242組大鼠HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10水平明顯降低(P<0.05)。蘿卜硫素高劑量作用效果強于蘿卜硫素低劑量組、EP組和TAK-242組。蘿卜硫素低劑量組效果弱于EP組和TAK-242組,見表2。

表2 各組大鼠血清HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10水平Table 2 Serum levels of HMGB1, TNF-α, IL-6 and IL-10 in each n=10)

2.3 各組大鼠異位子宮內膜組織HMGB1、TLR4、MyD88和TPRV1蛋白表達情況

與Sham組相比,EMs組大鼠HMGB1、TLR4、MyD88和TPRV1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與EMs組相比,蘿卜硫素低、高劑量組、EP組和TAK-242組大鼠HMGB1、TLR4、MyD88和TPRV1蛋白表達明顯降低(P<0.05)。蘿卜硫素高劑量組作用效果強于蘿卜硫素低劑量組、EP組和TAK-242組,蘿卜硫素低劑量組效果弱于EP和TAK-242組。見圖1,表3。

注:A.Sham組;B.EMs組;C.蘿卜硫素低劑量組;D.蘿卜硫素高劑量組;E.EP組;F.TAK-242組。Note:A. Sham group; B. EMs group; C. sulforaphane low-dose group;D. sulforaphane high-dose group; E. EP group; F. TAK - 242 group.

表3 各組大鼠異位子宮內膜組織HMGB1、TLR4、MyD88和TRPV1蛋白表達水平Table 3 Protein expression levels of HMGB1, TLR4, MyD88 and TRPV1 in ectopic endometrial tissues of rats in each n=10)

3 討論

目前對于EMs的發病機制尚未明確,認為可能存在的原因主要有遺傳因素、激素分泌失調、炎性反應、氧化應激、免疫失衡等。治療EMs的方式包括手術和口服藥物兩種,然而手術容易復發,口服避孕藥和孕激素會產生較多副作用。因此,尋找副作用小,且對EMs治療效果顯著的藥物是我們應對EMs的一種有效方法。研究表明,EMs病灶中出現較為嚴重的炎性反應和氧化應激反應、多條信號通路被激活,彼此作用,促進周圍神經纖維激活,引起內異癥疼痛的發生和發展[5]。

HMGB1是一種具有多種生物學功能的細胞因子,能夠幫助維護細胞的正常生理功能,然而它也能誘導炎性反應的發生,促進其他細胞因子的釋放,加劇炎性反應的持續時間和程度,同時其也是TLR4的重要內源性配體。TNF-α和IL-6是兩種重要的炎性因子,當機體出現炎性反應時,TNF-α和IL-6的分泌量會明顯增加,且二者具有較強的致炎性,能夠激活信號通路,導致更多炎性介質的分泌,引起組織損傷,加重炎性反應。另外,IL-6還可誘導細胞分泌IL-10,IL-10是機體具有免疫和抗炎功效的細胞因子,當機體出現較強的炎性反應時,為了消除炎性反應,維持機體平衡,TH2細胞會分泌大量的IL-10來抑炎,同時,IL-10又能刺激IL-4和IL-13等抗炎因子的產生,共同發揮調節作用[6]。本研究結果顯示,當大鼠出現EMs時,體內HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10的水平會明顯升高;而蘿卜硫素能夠明顯抑制HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10的升高。這提示,蘿卜硫素能夠通過減少TNF-α等炎性因子產生,來抑制炎性反應。蘿卜硫素作用后IL-10水平降低,可能是因為蘿卜硫素發揮了抗炎效果,促進炎性反應降低,引起IL-10分泌量減少。

上面提到,HMGB1在釋放到胞外后,能夠與TLR4受體特異性結合,從而激活下游信號通道,導致炎性介質的大量產生,促進炎癥的發生與發展。HMGB1-TLR4通路被激活后,在進一步進行信號傳導時,包括了兩種傳導途徑,一種是MyD88依賴性信號途徑,一種是MyD88非依賴性途徑,兩條途徑雖然不一致,但最終都會導致下游NF-κB的激活,引起大量包括TNF-α、IL-6在內的炎性介質的產生[7-9]。本研究結果顯示,大鼠出現EMs時,HMGB1、TLR4和MyD88蛋白表達會明顯增加,而蘿卜硫素和EP、TAK-242均能夠降低HMGB1、TLR4和MyD88的蛋白表達。這顯示,蘿卜硫素可能是通過抑制HMGB1-TLR4-MyD88信號通路的激活,減少多種炎性介質的產生與釋放,抑制炎性反應的發展,從而減輕對組織的損傷和周圍神經纖維的激活。

TRPV1是一種膜通道性受體,在痛覺傳遞的過程中發揮重要作用。有研究發現,EMs大鼠內膜組織中TRPV1蛋白表達會明顯升高,大鼠PWT降低[10]。本研究結果顯示,大鼠出現EMs時,TRPV1蛋白表達升高,PWT降低;而蘿卜硫素和EP、TAK-242能夠明顯降低大鼠TRPV1蛋白表達,提高大鼠PWT。結果顯示,蘿卜硫素可能是通過抑制HMGB1-TLR4-MyD88信號通路,減少TRPV1的激活,來阻斷疼痛信號向神經纖維的傳遞,減輕MEs導致的疼痛。

綜上所述,蘿卜硫素對大鼠EMs導致的機械性疼痛具有減輕作用,作用機制很可能是抑制了HMGB1-TLR4-MyD88信號通路激活,減少炎性因子及TRPV1的表達。