兔泰澤病原體實時熒光PCR檢測方法的建立

董 浩 李 楠 許中衎 邢壯壯 王學文 劉銘赫 李林姣 范學政 馬麗穎

(1.中國食品藥品檢定研究院,北京 102629)(2. 中國獸醫藥品監察所,北京 100081)

泰澤病(Tyzzer’s disease)是由泰澤病原體(毛樣芽孢桿菌,Clostridiumpiliforme)感染引起的一種潛伏期長、發病迅速、致死率高的傳染病。1917年Tyzzer在日本舞蹈小鼠 (Japanese waltzing mice)身上首次發現了該病。該病原的宿主廣泛,目前已發現兔、大鼠、倉鼠、麝鼠、貓、犬、郊狼、馬及羅猴等多種動物可以被感染[1-3]。在我國,已有多篇關于兔、大鼠和小鼠感染泰澤病原體的報道[4-7]。值得注意的是,有文獻報道泰澤病原體具有感染人的可能性,從產前婦女和實驗動物飼養人員的血清樣本中均檢測到了泰澤病原體的陽性抗體[4,8]。

對于SPF級實驗兔來說,泰澤病原體也是其必須排除的病原之一。由于泰澤病原體不能在無細胞的體外培養基中進行培養,使得難以獲得該病原的純培養物,因此只能使用感染泰澤病原體動物組織樣品制備血清學實驗所需的抗原或抗體,這無疑會對血清學檢測方法的特異性造成一定的影響。同時,血清學檢測方法對窗口期或者隱性感染的動物進行檢測時,常會出現假陰性結果。除此之外,有研究者認為泰澤病原體與梭菌屬的細菌之間存在一定的交叉反應,因此建議ELISA、IFA這類檢測病原抗體的方法最好只用于泰澤病原體感染初步篩查,其確診還需要采用血清學以外的檢測方法進一步檢測、驗證[9]。

由于泰澤病原體主要以隱性感染的形式存在于易感動物體內,這無疑是對盡早發現和剔除感染動物帶來了一定的困難?？紤]到糞口途徑是泰澤病原體在動物之間自然傳播的主要方式,本研究擬以兔的糞球作為檢測樣本,建立一種實時熒光PCR檢測方法,應用于兔泰澤病原體的快速檢測。

1 材料和方法

1.1 樣品和菌種來源

布魯菌病S2疫苗株的基因組和35株魏氏梭菌臨床分離株均由國家動物布魯菌病參考實驗室惠贈。多殺巴氏桿菌(CVCC 1676)、鼠傷寒沙門菌(CVCC 2220)、金黃色葡萄球菌(CVCC 4098)、綠膿桿菌(CVCC 2000)和肺炎克雷伯菌(CVCC 4079)均購自中國獸醫微生物菌株保藏管理中心。70份家兔的糞球樣品采自某普通級兔飼養機構。

1.2 主要試劑與儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒(西安天隆科技有限公司);GoTag Probe qPCR Master Mix(Promega公司);質粒提取試劑盒(Omega公司);TE緩沖液(北京索萊寶科技有限公司);GeneRotex全自動旋轉式核酸提取儀(西安天隆科技有限公司);NanoDrop2000【賽默飛世爾科技(中國)有限公司】;Roche LightCycler480 II 實時熒光定量PCR儀(羅氏公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1前期文獻數據的驗證根據參考文獻[10]報道的泰澤病原體nested-PCR檢測方法,合成相應的引物序列(TZ-1、TZ-2、TZ-3和TZ-4)并進行了10份普通級實驗兔的糞球樣品的檢測。將PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,并使用Blast數據庫進行比對。

1.3.2引物探針的設計與合成:根據1.3.1的驗證實驗結果,針對泰澤病原體特異性的196 bp 16S rRNA序列,采用Primer-BLAST在線軟件設計了1對特異性引物(TZ-F和TZ-R)和1條TaqMan 探針(TZ-Probe),用于泰澤病原體的檢測。引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物和探針序列詳見表1。

表1 引物和探針列表Table 1 List of primers and probes

1.3.3質粒標準品的制備:根據參考文獻[10]中提供的泰澤病原體特異性的196 bp 16S rRNA序列,由武漢金開瑞生物工程有限公司合成了含有上述序列的質粒標準品(pUC-TZ196)。將含有pUC-TZ196陽性質粒的感受態細胞,培養至穩定期后,使用質粒提取試劑盒提取質粒pUC-TZ196。利用Nanodrop2000測定質粒的濃度,并按照公式拷貝數=(6.02×1023×濃度)/(堿基數×660)×10-9,換算質?？截悢?。使用TE緩沖液對質粒標準品進行適當稀釋。

1.3.4實時熒光PCR反應條件的優化:用矩陣法進行實時熒光PCR擴增,篩選引物和探針的搭配濃度,以獲得最佳的擴增效果。

1.3.5實時熒光PCR特異性實驗:分別以SPF級實驗兔必須排除的多殺巴氏桿菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯菌等滅活細菌核酸以及布魯菌病S2疫苗株的基因組為模板進行實時熒光PCR 檢測,并設置1個pUC-TZ196質粒標準品陽性對照和1個空白對照(水)。

由于泰澤病原體的196 bp 16S rRNA序列在Blast數據庫中比對顯示該序列與部分梭菌屬的細菌同源性較高,因此使用建立的實時熒光PCR方法對35株魏氏梭菌臨床分離株進行了檢測,并設置1個pUC-TZ196質粒標準品陽性對照和1個空白對照(水)。

1.3.6實時熒光PCR標準曲線的繪制:將合成的pUC-TZ196質粒標準品,使用TE緩沖液進行10倍梯度稀釋,模板濃度為3.2×107,3.2×106,3.2×105,3.2×104和3.2×103copies/μL的質粒標準品,進行實時熒光PCR檢測,用Roche LightCycler480 II 實時熒光定量PCR儀配套軟件繪制標準曲線。

1.3.7實時熒光PCR敏感性實驗:將合成的pUC-TZ196質粒標準品使用TE緩沖液進行梯度稀釋,模板為濃度3.2×106、3.2×105、3.2×104、3.2×103、3.2×102、3.2×101和3.2×100copies/μL的質粒標準品,進行實時熒光PCR擴增。在確定可以獲得S型標準曲線的最低模板濃度后,再使用TE緩沖液以2的倍數進行梯度稀釋,每個稀釋度做6個重復,進行實時熒光PCR檢測,以6個重復樣品均可以獲得S型特異性擴增曲線的最低質粒標準品濃度作為實時熒光PCR方法的最低檢測限。

1.3.8重復性實驗:分別采用濃度為3.2×106和3.2×104copies/μL的質粒標準品進行實時熒光PCR實驗,每個濃度的模板分別進行了批內重復3次和批間重復3次實驗,以評估建立方法的重復性。

1.3.9臨床樣品檢測:采用建立的實時熒光PCR法,對70份普通級實驗兔的糞球樣品進行檢測。同時,已報道的泰澤病原體nested-PCR檢測方法對上述樣品進行檢測。

2 結果

2.1 前期文獻數據的驗證

采用已報道的泰澤病原體nested-PCR檢測方法對10份普通級實驗兔的糞球樣品的檢測。結果顯示,10份糞球樣品的nested-PCR產物中4份擴增出196 bp的目的片段。切取2份比較清晰的目的條帶膠塊,送到生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果通過Blast數據庫比對顯示與毛樣芽孢桿菌(Clostridiumpiliforme)的同源性最高,由于只使用正向引物進行測序,所以最高的一致性為95.71%(圖1)。上述結果說明,擴增獲得196 bp產物為泰澤病原體的核酸。

圖1 套式PCR產物測序的Blast比對結果Fig.1 Blast results of sequencing of nested-PCR product

2.2 實時熒光PCR反應條件的優化結果

通過體系優化,實時熒光PCR的最佳反應體系為20 μL:GoTaq? Probe qPCR Master Mix 10 μL,10 μmol/L 的上、下游引物各 0.9 μL,10 μmol/L 的探針0.6 μL,DNA 模板 2 μL,加入無核酸酶的水補齊 20 μL。反應程序確定為:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,52 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,45個循環。每個循環第2步,72 ℃ 20 s,收集FAM熒光信號。

2.3 標準曲線的建立

提取pUC-TZ196質粒標準品,換算拷貝數后進行10倍倍比稀釋后作為模板,采用優化好反應條件的實時熒光PCR進行擴增。實驗結果顯示,在使用3.2×107～3.2×103copies/μL的質粒標準品作為模板時,泰澤病原體實時熒光PCR的擴增效率Efficiency為1.908,斜率Slope為-3.565(圖2)。

注:1～5: 3.2×107,3.2×106,3.2×105,3.2×104 和3.2×103 copies/μL的質粒標準品的擴增曲線。Note:1-5:the amplification curves of 3.2×107,3.2×106,3.2×105,3.2×104 and 3.2×103 copies/μL plasmid standard.

2.4 特異性實驗

分別以SPF級實驗兔必須排除的多殺巴氏桿菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯菌等滅活細菌核酸以及布魯菌病S2疫苗株和35株魏氏梭菌臨床分離株的基因組為模板進行實時熒光PCR 檢測,同時以ddH2O為陰性對照,進行實時熒光PCR擴增。實驗結果顯示,只有pUC-TZ196質粒標準品陽性對照可以產生S型擴增曲線,其他細菌均未出現明顯擴增(圖3)。這說明該方法的特異性良好。

圖3 實時熒光PCR的特異性實驗Fig.3 Specificity test for the real-time PCR

2.5 敏感性實驗

為了測試實時熒光PCR的最低檢測限,將pUC-TZ196質粒標準品陽性對照分別進行10倍倍比稀釋后作為模板,采用優化好的實時熒光PCR進行擴增。實驗結果顯示,3.2×101copies/μL質粒標準品擴增可以獲得S型擴增曲線,而3.2×100copies/μL質粒標準品無S型擴增曲線產生。進一步將3.2×101copies/μL質粒標準品使用TE緩沖液進行2倍倍比稀釋,每個濃度做6次重復使用,結果表明當質粒標準品稀釋至8 copies/μL時,6個重復樣品均可以獲得S型擴增曲線,當稀釋至4 copies/μL時,僅1個重復樣品可以獲得S型擴增曲線,說明建立的實時熒光PCR方法的最低檢測限為8 copies/μL。

2.6 重復性實驗

為了測試實時熒光PCR的重復性,分別采用濃度為3.2×106,3.2×104copies/μL的兩種質粒標準品進行了批內重復和批間重復實驗。結果如表2所示,批內和批間的變異系數均小于3%。這說明建立的實時熒光PCR具有良好的重復性。

表2 實時熒光PCR的批內和批間重復實驗Table 2 In-batch and inter-batch replications of real-time PCR

2.7 臨床樣品檢測

利用建立的實時熒光PCR對采自某家兔飼養機構的70份糞球樣品進行檢測。結果表明,70份家兔糞球樣品,實時熒光檢出59陽性,套式PCR檢測出55份陽性,實時熒光PCR比套式PCR多檢出了4份陽性樣品,兩種方法的符合率為94.29%。

3 討論

由于無法進行泰澤病原體的體外純培養,所以在NCBI數據庫中依然沒有該病原的基因組全序列,這無疑是給泰澤病原體的分子生物學檢測方法的建立帶來了困難。2003年,我國的研究者們曾經報道了泰澤病原體的基因組DNA提取方法,但是未見后續基因組學方面的研究數據[11]。目前,在泰澤病原體的分子檢測方法中,主要是以其16S rRNA中的特異性196 bp序列作為檢測靶標[12-13]。

通過對該196 bp序列的blast比對分析,發現其與某些梭菌屬的細菌以及金黃色葡萄球菌具有較高的同源性,因此本研究中使用了35株魏氏梭菌臨床分離株和金黃色葡萄球菌對建立的實時熒光PCR方法進行了特異性的檢測,結果發現該方法特異性良好,不與上述菌株發生交叉反應。

與參考文獻[10]建立的套式PCR相比,本研究中建立實時熒光PCR檢測方法極大的簡化了實驗操作的流程,不僅減少了一次加樣過程,還省去了電泳的操作流程,使得檢測環節從約4 h縮短至僅1 h,節省了大量的人力和時間。與參考文獻[12]建立的反向斑點雜交方法相比,實時熒光PCR方法在操作簡便性和檢測的高通量性方面也是具有較大的優勢,更利于在各種檢測實驗室中進行推廣。

從本研究中檢測的70份臨床樣品的陽性比例來看,在該兔的飼養群中,泰澤病原體感染比較嚴重。根據與該兔飼養機構的飼養人員溝通,該兔群近期未發生腹瀉和突然死亡病例,這也說明在兔中泰澤病原體也是可以長期隱性感染而不發病的。

綜上所述,本研究建立了一種可以用于兔泰澤病原體檢測的實時熒光PCR方法,其有比較理想的敏感性、特異性和重復性,對于臨床樣品檢測效果也明顯優于已報道的套式PCR方法。因此,該方法可用于兔的泰澤病原體的核酸檢測,對提升我國兔泰澤病原體檢測能力具有較大意義。