五指山小型豬近交系不同世代個體外周血紅細胞aGal表達水平測定研究*

馮書堂 李 莉 李國平 楊潔容 王太平

(北京蓋蘭德生物科技有限公司,北京 102206)

豬是人類異種器官移植理想供體,培育的五指山小型豬(Wuzhishan mini-pig,WZSP)近交系,較之普通豬具有四大應用優勢[1-3]。但由于豬細胞表面上主要存在以aGal 為主的三種不同的、引起異種移植發生超急性免疫排斥反應的抗原,以及幾乎所有豬品種基因組中含有PERV基因,是影響其在異種醫用材料、異種移植研究和應用的主要障礙之一[4-5]。據文獻報道[4],aGal基因存在所有品種豬基因組;西雙版納小型豬隨著近交系數的增高,其外周血小板aGal表達量逐步減少,這就意味著隨著近交繁育深入進行,有可能逐步延緩異種移植免疫排斥反應現象的發生。本研究擬以育成的WZSP近交系豬為材料[1,6-8],測定其不同近交世代個體和培育的近交系aGal/b4GalNT2雙敲基因豬(以下簡稱:雙敲基因豬)繁育的后代、外周血紅細胞aGal表達量及變化規律[9],以及對aGal/b4GalNT2基因敲除豬繁育后代純合子、雜合子分離結果的期待。為其異種醫用生物材料等產品研究和應用,以及產品標準化、規?；a提供科學依據。

目前,有關近交系豬紅細胞aGal表達水平測定研究未見報道。因此,本研究結果對異種醫用材料研究等有著重要的實用意義[4-5]。

1 材料和方法

1.1 材料

F19-28WZSP豬,共計55頭[1,6],雙敲基因修飾豬后代45頭[9],實驗組樣品共計100頭,并設對照組。實驗組1:近交系F27-28共計26頭;實驗組2:近交系F248頭;實驗組3:近交系F19-21共計21頭;實驗組4:近交系雙敲基因豬后代F1-3等待測定豬共計45頭;對照組:未加IB4-FITC的紅細胞。均由北京蓋蘭德生物技術有限公司提供,實驗動物生產許可證號【SCXK(京)2020-0006】。

1.2 方法

1.2.1利用股隱動脈[1]:進行無菌采集血液,每頭豬采血2～3 mL裝入抗凝管。管上標注對應號碼,注入血液之后馬上輕柔快速翻轉試管,保證血液不凝后放入保溫箱。

1.2.2實驗室紅細胞分離方法:1)將采集的豬血置于抗凝管中,混合均勻備用;2)取分層的抗凝血下層紅細胞1 mL,加入1 mL PBS重懸,然后將重懸后的紅細胞緩慢加入3 mL GE Ficoll-Paque Plus中,20 ℃,300 r/min離心30 min;3)離心后溶液產生分層,下層為紅細胞,將紅細胞小心轉移到新的15 mL離心管中,在離心管中加入10 mL PBS充分重懸紅細胞,500 r/min 10 min離心后棄上清;4)重復步驟3,2～3次,然后對收集的紅細胞進行計數;5)使用PBS稀釋DBA(凝集素)至推薦濃度,按照說明書推薦用量孵育30 min;6)使用PBS洗滌,洗滌條件500 r/min 10 min;7)使用BD Ariana III流式熒光分選儀、上機測試;8)檢測不同組合樣品1 000個PBMC中,表達aGal的抗原陽性細胞數量的百分比(%)。

1.3 統計學分析

實驗組與對照組之間的比較用t檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 aGal抗原陽性細胞數量及表達量測定

F27出現2頭aGal抗原陽性細胞數量的百分比極低個體,分別為16.2%和19.5%;組1與組3個體aGal抗原陽性細胞數量的平均值百分比差異有統計學意義(P<0.05)。

100頭WZSP近交系不同世代、待測定的雙敲基因修飾后代豬(含已測定GGTA1/b4GalNT2+hCD46+hCD55+hTBM五基因修飾純合子豬)和對照組的測定結果見表1,2和圖1,2。

圖1 實驗組與對照組外周血紅細胞aGal表達水平Fig.1 The expression level of peripheral red blood cells in the experimental group and the control group was plotted

表1 近交系小型豬不同世代實驗組與對照組aGal抗原陽性細胞測定結果Table 1 Determination of aGal expression level of peripheral red blood cells in pigs offspring of the Inbred mini-pig at the different generations

從圖1可知,隨著近交系代數提高,其個體紅細胞aGal表達量逐步減低。

從圖2可知,五基因修飾豬、雙敲基因純合子豬和近交系F20豬等部分實驗組與對照組紅細胞未發現aGal綠色的熒光反應,而實驗組F20的D16號豬檢測到其紅細胞aGal具有較強的綠色熒光表達效果。

圖2 部分實驗組與對照組測定熒光反應檢測圖Fig.2 Detection chart of fluorescence reaction between some experimental groups and control groups

2.2 近交系各世代紅細胞aGal免疫熒光檢測

組1:近交系F27-2826頭紅細胞aGal免疫熒光反應百分率平均值為56.17%。其中低于50% 6頭,占23.08%;50%～60% 8頭,占30.77%;高于60% 的12頭,占46.15%;其最低值16.2%,最高值86.2%。

組2:近交系F248頭紅細胞aGal細胞免疫熒光反應百分率平均值65.39%,其中低于50% 2頭,占25%;50%～60% 2頭,占25%;高于60% 4頭,占50%,其最低值35.5%,最高值99.2%。

組3:F19-2121頭紅細胞aGal細胞免疫熒光反應百分率平均值為82.15%,其中低于50% 2頭,占9.1%;50%～60% 6頭,占28.57%;高于60% 13頭,占61.91%;最低值38.8%、最高值89.4%。組1(56.17%)與組3(82.15%)的平均值差異有統計學意義(P<0.05)。

組4:其中8頭GGTA1/b4GalNT2雙敲基因豬繁育后代和1頭已知為GGTA1/b4GalNT2+hCD46+hCD55+hTBM五基因修飾純合子豬的紅細胞aGal免疫熒光反應測定值為0.01%,其余aGal/b4GalNT2雙敲基因豬繁育后代中,有2頭測定值分別為0.02%、0.03%,有4頭aGal免疫熒光反應數值高達52.67%～76.40%,其余28頭測定平均值為31.03%(9.0%～49.2%)。

組5:對照組未加IB4-FITC的紅細胞aGal免疫熒光反應測定值為0.01%。

3 討論

實驗組近交系各世代、雙敲基因后代豬與對照組外周血紅細胞aGal表達測定數據分析比較列為表1,2和圖1,2。由圖、表分析可以得出,近交系F27-28與F24個體紅細胞aGal免疫熒光反應百分比,每代降低3.07%;F24與F20相比個體紅細胞aGal免疫熒光反應百分比,每代降低了4.19%。尤其是F27已出現2頭個體紅細胞aGal免疫熒光反應百分比極低的個體(6.20%,19.50%)。表明,隨近交系代數推進,其紅細胞aGal細胞免疫熒光反應強度數值呈逐步下降趨勢。其下降的比例略有差異(3.07%對4.19%),可能與采取實驗樣本數量不等有關。提示近交系豬從F19到F28隨近交系數提高,其個體紅細胞aGal免疫熒光反應呈現逐步下降趨勢。尤其研究中發現:近交系F27中,同窩1對種豬紅細胞aGal免疫熒光反應表達量極低,為今后培育近交系aGal低表達量的新品系奠定基礎,也為培育新品系和應用提供科學依據。

由表2結果發現:雙敲基因修飾豬后代3619、3018、3607 三頭母豬和3608、3604、3608、3318、3020 五頭公豬,共計8頭豬與對照組紅細胞aGal免疫熒光反應測定結果均為0.1%,與對照組取得一致性的結果,未發生aGal免疫熒光反應。因此,可視為aGal/b4GalNT2基因敲除純合子個體;但有4頭測定值分別為0.02%、0.03%的可視為近似aGal/b4GalNT2基因敲除純合子個體;而有4頭aGal免疫熒光反應數值高達52.67%～76.40%的個體,可視為配種后分離出來的非基因敲除豬個體;其中28頭aGal免疫熒光反應平均數值為31.03%(9.0%～49.2%),可推測為雙敲基因豬繁育的雜合子后代,其紅細胞aGal免疫熒光反應比值均低于50%。上述研究結果證實的GGTA1/b4GalNT2基因敲除純合子個體,可為其生物輔料產品提供一定的科學依據[9]。

表2 雙敲基因豬實驗組與對照組aGal抗原陽性紅細胞測定結果Table 2 Determination of aGal expression level of peripheral red blood cells in pigs offspring of the knock gene heterozygous pigs

不同豬品種、同一豬品種不同個體以及同一個體、不同器官或細胞aGal的表達量不同;同一個體血細胞的aGal表達量血小板>粒細胞>單一核細胞>紅細胞,血小板的aGal表達量是粒細胞的3倍,但不同豬個體相同血細胞的aGal表達量趨勢之間無顯著性差異[4]。因此,本研究首次利用aGal表達量最低的紅細胞進行測定,取得的研究結果同樣具有一定的參考價值。

近交系豬具有特異的分子遺傳基礎[10-15],有關小型豬近交系豬紅細胞aGal表達水平測定研究尚未見報道,本研究測定數量有限,隨近交系推進其個體aGal表達量,逐步降低機制有待深入研究。