基于網絡藥理學和分子對接探討歸脾湯治療免疫性血小板減少癥作用機制

谷文琪，楊濛，2，翟文生，2，宋純東，2，吳靜靜，2，張蒙蒙，劉麗雅，2，李鵬飛，2，張秋月，2，段永悅，丁夢圓

1.河南中醫藥大學兒科醫學院，河南 鄭州 450046；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450003

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種自發性出血性疾病，以無明確原因導致的孤立性外周血血小板數量減少為主要特征，每年發病率約為1.1/10萬～5.8/10萬[1-2]，兒童發病率較高。ITP發病機制尚不清楚，研究表明可能與T細胞活化的相關基因或細胞因子相關的單核苷酸多態性（SNP）有關，該病特征表現與受損的T細胞和B細胞相關自身反應性抗體有關[3]。ITP臨床治療常用潑尼松、地塞米松等藥物，2021版指南建議對于0～2級出血患者選擇常規劑量短療程中效糖皮質激素[4]，但長期使用易導致“滿月臉”、高血壓及骨質疏松等不良反應，中藥可有效治療ITP且不良反應少[5]。

ITP屬中醫學“血癥”“葡萄疫”“虛勞”等范疇，命名為“紫癜病”[6]?！锻饪普凇て咸岩摺费裕骸捌咸岩?，其患多生小兒，感受四時不正之氣，郁于皮膚不散，結成小大青紫斑點，色若葡萄，發在遍體頭面，乃為腑癥；自無表里，邪毒傳胃，牙齦出血，久則虛人，斑漸方退?！敝赋鰞和疘TP多因外邪或邪毒內侵誘發，且病久則虛。因小兒獨特的生理病理特點，患兒病情易反復傷中，致脾氣虛弱，心氣不足，氣不攝血，多見氣不攝血型ITP，治法當益氣健脾，養血生血，方選歸脾湯以健脾養心、益氣攝血。該方原載于《濟生方》，后至《正體類要》補充當歸和遠志兩味藥，全方增至12味中藥?，F代研究發現，歸脾湯可以抑制NF-κB p65磷酸化和IDO表達，促進M2型巨噬細胞極化，從而獲得較好的臨床療效，還可降低脾臟中CD80和CD86表達，抑制B淋巴細胞活化，減少血小板自身抗體產生，進而保護血小板[7-8]。中藥復方具有多成分、多途徑、多靶點協同作用的特點[9]，本文基于網絡藥理學和分子對接的研究方法，探討歸脾湯治療ITP的作用機制，為其臨床應用及深入研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點獲取

運用TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、TCMIP（http://www.tcmip.cn/）、BATMAN（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數據庫篩選白術、人參、黃芪、當歸、甘草、茯苓、遠志、酸棗仁、木香、生姜、大棗、龍眼肉12味中藥活性成分，并通過收集文獻，補充數據庫中收錄活性成分較少的中藥，設定條件口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18%。通過TCMSP數據庫獲取活性成分作用靶點，并利用UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）進行標準化。

1.2 疾病靶點獲取

通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（https://omim.org/）數據庫檢索“immune thrombocytopenia”“idiopathic thrombocytopenic purpura”，合并結果去除重復項獲取ITP相關靶點。將活性成分作用靶點與疾病靶點上傳jvenn平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）生成韋恩圖，取交集即為歸脾湯治療ITP關鍵靶點。

1.3 “活性成分-靶點”網絡構建

利用Cytoscape3.8.2軟件構建歸脾湯“活性成分-靶點”網絡，并運用Analyze Network功能進行網絡特征分析，通過分析度值（Degree）、邊、緊密度（Closeness）等指標，篩選歸脾湯關鍵活性成分與作用靶點。

1.4 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡構建

通過Cytoscape3.8.2軟件將歸脾湯組方藥物活性成分、靶點及疾病可視化并進行網絡特征分析，篩選歸脾湯治療ITP的關鍵活性成分與關鍵靶點。

1.5 蛋白互相作用網絡構建

將作用靶點導入STRING平臺（hppts://srting-db.org/）構建蛋白相互作用（PPI）網絡，物種選定為“Homo sapiens”，中等置信度（medium confidence）設置0.400，其余條件保持默認設定，獲得PPI網絡。進一步將TSV數據結果導入Cytoscape3.8.2，使用CytoHubba插件，依據Degree值篩選前20位核心靶點。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析

將關鍵靶點輸入DAVID6.8數據庫（https://david.ncifcrf.gov）功能注釋欄，物種設定為人類，進行GO功能和KEGG通路富集分析。利用R語言將結果可視化。

1.7 分子對接驗證

選取歸脾湯“活性成分-靶點”與“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡中重復且Degree值前5位核心活性成分，與前5位核心靶點進行分子對接。首先利用TCMSP數據庫獲取活性成分mol2結構，PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）獲取核心靶點蛋白3D結構，然后通過PyMoL軟件對蛋白結構去配體，再使用AutoDock軟件去水、加氫，進行分子對接，最后選擇結合能與均方根偏差（RMSD）最佳的5組進行可視化。

2 結果

2.1 藥物活性成分靶點預測結果

通過數據庫篩選和文獻[10]補充，共得活性成分黃芪20個、白術7個、人參22個、當歸2個、甘草92個、茯苓15個、酸棗仁9個、木香6個、生姜5個、大棗29個、遠志29個、龍眼肉3個，經刪除重復項后得到214個活性成分，進一步剔除無靶點的活性成分后保留175個。預測作用靶點3 369個，刪除重復項后保留491個作用靶點。

2.2 疾病靶點獲取及靶點篩選

通過GeneCards、TTD、OMIM數據庫檢索獲取ITP相關靶點4 193個，合并刪除重復項后共1 133個。進一步利用jvenn平臺獲得歸脾湯治療ITP潛在靶點110個。

2.3 歸脾湯“活性成分-靶點”網絡

歸脾湯“活性成分-靶點”網絡見圖1，共包括671個節點，3 628條邊，節點大小代表Degree大小，節點間連線代表相互作用。經網絡特征分析后得出節點較大的活性成分為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、異鼠李素（isorhamnetin）、刺芒柄花素（formononetin）、S-（2-羧乙基）-L-半胱氨酸（S-（2-carboxyethyl）-L-cysteine）、毛蕊異黃酮（calycosin）、常春藤皂苷元（hederagenin）、原阿片堿（fumarine），這些活性成分Degree值較大，連接線較多，可能在歸脾湯治療ITP中起到關鍵作用；Degree值前5位靶點為PTGS2、HSP90AA1、AR、ESR1、PTGS1，可能是歸脾湯治療ITP的關鍵靶點。

圖1 歸脾湯“活性成分-靶點”網絡

2.4 歸脾湯“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡

歸脾湯治療ITP“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡見圖2，共有298個節點，1 164條邊，節點大小代表Degree值大小，節點間連線則代表相互作用，經網絡特征分析，Degree值較大的靶點是PTGS2、HSP90AA1、NOS2、PPARG、F10、MAPK14、ADRB2、DPP4、F2、F7，靶點與活性成分、疾病之間連線較多，可能為歸脾湯治療ITP的關鍵靶點。

圖2 歸脾湯“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡

2.5 蛋白互相作用網絡及核心靶點篩選

PPI網絡共有109個節點，2 209條相互作用線，平均節點度40.05，聚類系數0.723。通過CytoHubba插件依據Degree算法篩選，圖中顏色深淺和節點大小代表Degree值，節點越大、顏色越深Degree值越大，結果表明TNF、IL6、AKT1、IL1B、TP53等20個靶點Degree值較大，為核心靶點，核心靶點PPI網絡見圖3。

圖3 歸脾湯治療ITP核心靶點PPI網絡

2.6 GO功能與KEGG通路富集分析結果

利用DAVID6.8數據庫進行GO功能與KEGG富集分析，設定P＜0.05為顯著富集，富集結果顯示，GO富集共507條，其中生物過程（BP）398條，主要為對藥物的反應、凋亡過程的負調節、炎癥反應、RNA聚合酶Ⅱ對轉錄進行正調控、細胞對脂多糖的反應等；細胞組分（CC）44條，主要集中在細胞外間隙、胞外區、胞漿、細胞表面、質膜外側；分子功能（MF）65條，主要為蛋白質結合、酶結合、相同的蛋白結合、蛋白質異源二聚活性、轉錄因子結合等，見圖4。

KEGG通路109條，主要涉及癌癥（Pathways in cancer）、乙型肝炎（Hepatitis B）、T細胞受體（T cell receptor）、TNF信號通路、恰加斯?。–hagas disease）、前列腺癌（Prostate cancer）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、百日咳（Pertussis）、Toll樣受體（Toll-like receptor）、弓形體?。═oxoplasmosis）、膀胱癌（Bladder cancer）、結核?。═uberculosis）、NOD樣受體（NOD-like receptor）、HIF-1信號通路、破骨細胞分化（Osteoclast differentiation）、丙型肝炎（Hepatitis C）、慢性骨髓性白血?。–hronic myeloid leukemia）、甲流（Influenza A）信號通路。KEGG富集結果前20條通路見圖5。氣泡越大提示基因數量越多，顏色越接近紅色代表P值越小，說明富集結果越顯著。核心靶點TNF、IL6、AKT1、IL1B、MMP9、CASP3、MAPK3、JUN、PTGS2均被富集在TNF信號通路上。

圖5 歸脾湯治療ITP靶點KEGG富集分析

2.7 分子對接結果

選取Degree值錢5位核心活性成分（槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、刺芒柄花素、異鼠李素）與Degree值排名前5位的核心靶點（TNF、IL6、IL1B、IL10、IFNG）按照“1.7”項中方法進行分子對接。若配體與受體結合能≤-5.0 kcal/mol說明結合活性較好，若配體與受體結合能≤-7.0 kcal/mol說明具有強烈的結合活性，結合能越低分子間結合越穩固[11]。結果顯示，8組強烈結合活性，17組結合活性較好，見表1。運用PyMoL計算配體與受體RMSD，RMSD為受體與配體之間結構差異，用于評價分子對接是否成功，當RMSD＜2.0時認為對接結果較好，用于衡量結構穩定程度。選擇5組最優構象利用PyMoL軟件進行可視化，見圖6。

表1 核心活性成分與核心靶點分子對接成果

圖6 歸脾湯有效成分與靶點蛋白分子對接模式

3 討論

本研究基于網絡藥理學分析，發現歸脾湯具有較多活性成分，其中槲皮素具有免疫調節、抗病毒、降糖、降脂作用[12]，山柰酚可誘導細胞凋亡、抗炎，豆甾醇可調節免疫、控制炎癥，異鼠李素可抑制炎癥反應、抗氧化及抑制血小板凝聚[13]，毛蕊異黃酮具有抗氧化及抗炎活性，原阿片堿可改善微血管循環、抗血小板凝集[14]，刺芒花柄素具有抗腫瘤、抗炎作用[15]。以上成分可能是歸脾湯治療ITP的關鍵成分。

PPI網絡顯示，PTGS2、HSP90AA1、PPARG等度值排名靠前，為歸脾湯治療ITP的主要靶點。相關研究表明，PPAR-γ可調控T細胞、巨噬細胞和與免疫調節相關細胞的活化、增生及炎癥反應等，是炎癥應激反應的重要靶點[16]；PTGS2可介導花生四烯酸代謝產生前列腺素E2，刺激產生基質金屬蛋白酶，抑制T細胞凋亡，在炎癥反應中發揮作用[17]。HSP90AA1具有免疫應答及減少炎癥細胞因子分泌作用[18]。研究表明，歸脾湯可能通過增加調節性T細胞數量和提高TGF-β1表達，進一步對T細胞、B細胞增殖活化起到抑制作用，最終使模型小鼠血小板計數升高[19]。本研究發現，歸脾湯治療ITP可能是通過槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇和刺芒柄花素等成分作用于PPARG、HSP90AA1、PTGS2等主要靶點發揮免疫、抗炎、提升血小板計數作用。

相關研究報道，氣不攝血型ITP出血與TNF-α、IL-8（CXCL8）、IL-17A炎癥因子高表達，IL-10抑炎相關因子低表達有關，促炎與抑炎表達失衡加劇血管損傷有關[20]，且ITP發病機制涉及Th1細胞分泌IFN-γ（IFNG）、IL-2和TNF-α促進細胞免疫，Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等誘導體液免疫[21]。本研究結果顯示，TNF、IL6、IL1B、IL8、IL10、IL4、PTGS2、IFNG、IL2等核心靶點在ITP發生中發揮重要作用，推測歸脾湯可能通過調控TNF、IL8高表達和IL10低表達，以減輕血管損傷、減少出血癥狀；還通過調控IL6、IFNG、PTGS2、IL1B等核心靶點控制ITP，發揮抗炎、調節免疫作用。

GO富集結果顯示，靶點主要參與炎癥反應等生物過程，蛋白質結合、酶結合等分子功能。KEGG通路富集顯示，主要富集在TNF、HIF-1、Toll樣受體、NOD樣受體、T細胞受體、破骨細胞分化信號通路，王藝超等[22]運用高通量基因芯片技術對ITP患者及正常人的脾巨噬細胞進行基因表達分析，其中差異表達基因信號通路涉及Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路，而且Toll、NOD樣受體信號通路均涉及對炎癥因子、免疫的調節。TNF作為一種關鍵的細胞因子，可誘導細胞凋亡、存活及免疫，故TNF信號通路也與炎癥相關[23]。其中TNF信號通路除富集到9個核心靶點外，MAPK14、PIK3CG、NFKBIA、CXCL10、NFKB1、VCAM1、IKBKB、MAPK8等關鍵靶點也被富集于該通路，因此猜測TNF信號通路可能為主要作用通路。通過KEGG數據庫整合結果發現，TNF、IL6、AKT1、CXCL8、IL4、IL10、IL1B、JUN、EGFR、MAPK3、IFNG、STAT3等核心靶點還作用于T細胞受體、HIF-1、Toll及NOD樣受體信號通路。由此可見，這些通路是歸脾湯治療ITP的關鍵通路，涉及免疫、炎癥、細胞凋亡、信號傳導等。呼吸道病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、幽門螺桿菌、人類微小病毒B19、水痘-帶狀皰疹病毒感染等均可誘發免疫失耐受[24]，故推測KEGG富集的疾病通路與ITP發病誘因及病因可能存在一定聯系，歸脾湯通過這些通路控制ITP發病，發揮治療作用。

本文運用網絡藥理學和分子對接技術，發現歸脾湯治療ITP具有“多成分、多靶點、多通路”的作用特點，歸脾湯主要通過槲皮素、山柰酚、異鼠李素、刺芒柄花素、β-谷甾醇、粗毛甘草素F等活性成分，作用于IL6、TNF、IL1B、IL10、IFNG、CXCL8、MAPK3、IL4、IL2等核心靶點，通過TNF、HIF-1、Toll樣受體、T細胞受體、NOD樣受體等信號通路治療ITP。本研究屬理論探討，仍需實驗進一步驗證。