Lmo7對MC3T3-E1細胞增殖、遷移及成骨分化影響的實驗研究

毛佳奕， 王佐林

（同濟大學口腔醫學院，同濟大學附屬口腔醫院口腔種植科，上海牙組織修復與再生工程技術研究中心，上海 200072）

Lmo7 是一類蛋白質編碼基因，其編碼的同名蛋白是一類存在于細胞核、細胞質、細胞膜中的多功能蛋白，隸屬于 PDZ-LIM 蛋白家族，廣泛分布在從蠕蟲到人類的動物界[1-2]?，F有研究[3-4]中，Lmo7被證實作為轉錄激活因子與emerin 結合并調控成肌細胞的分化，與心肌和骨骼肌的發育密切相關[5]。另一方面，Lmo7 被證實其定位于細胞間的黏附連接，是2 種F-肌動蛋白——afadin 和α-actinin 的結合蛋白[6]，這提示Lmo7 可能參與多種細胞生物學功能，包括形態發生、分化、增殖[7]和遷移。近年來，有學者[8]研究發現Lmo7 由轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導產生，并且通過負反饋調節TGF-β1 信號通路來限制血管纖維化反應?；赥GF-β1 在促進骨祖細胞增殖、早期分化過程中發揮了重要作用[9-10]，Lmo7 與成骨過程是否存在聯系，發揮了怎樣的功能，目前尚無文獻報道。

本研究采用小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（MC3T3-E1 cells），通過慢病毒介導的RNA 干擾技術敲低Lmo7 的表達，觀察其對細胞增殖、遷移和成骨分化的影響，初步探索Lmo7 在成骨過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑及儀器

MC3T3-E1 細胞（亞克隆 14；普諾賽公司，中國）；α-MEM 培養液（hyclone 公司，美國）；血清（BI公司，以色列）；胰蛋白酶（Gibco 公司，美國）；青鏈霉素雙抗（hyclone 公司；美國）；成骨誘導液（賽業公司，中國）；慢病毒載體（北京擎科生物科技有限公司，中國）；siRNA（北京擎科生物科技有限公司，中國）；逆轉錄試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；實時定量 PCR 試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，中國）；PCR 引物（北京擎科生物科技有限公司，中國）；Lmo7 抗體（Santa Cruz 公司，美國）；GAPDH 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；堿性磷酸酶（ALP）顯色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，中國）；熒光定量 PCR 儀（Roche 公司，瑞士）；Al 680 超靈敏多功能成像儀（GE 公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（蔡司公司，德國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 MC3T3-E1 細胞的成骨誘導培養 將MC3T3-E1 細胞加入10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的α-MEM 培養液中，在37 ℃、5%CO2的環境下培養至細胞匯合度為60%。再將其加入成骨誘導培養液中進行誘導分化，每2～3 天更換1 次培養液，分別在成骨誘導0、3、7、14 d 時收集細胞樣品以進行后續實驗。

1.2.2 慢病毒轉染構建穩定干擾Lmo7 的MC3T3-E1 細胞株 MC3T3-E1 細胞以2.5×105個/孔鋪板至6 孔板中，次日更換培養液為含10 μg/mL 聚凝胺（polybrene）的完全培養液，加入慢病毒pLVshLmo7-mCherry（干擾組）或pLV-mCherry（對照組）進行轉染，24 h 后更換為含10%胎牛血清的α-MEM 培養液，待細胞生長狀況恢復后加入10 μg/mL 嘌呤霉素篩選，得到穩定干擾Lmo7 表達的MC3T3-E1 細胞株。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測mRNA 表達水平 收集細胞樣本，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清 洗2 次，TRIzol提取總RNA 后，使用紫外分光光度計測定RNA 純度與濃度，調平后逆轉錄合成cDNA，進行RT-qPCR檢測，反應體系：正、反引物各0.5 μL，cDNA 模板1 μL，SYBR Green Master mix 5 μL，二次蒸餾水（ddH2O）補足至10 μL，每組樣本設3 個復孔。所使用的引物序列如表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.2.4 Western blotting 檢測蛋白表達水平 收集細胞樣品，用PBS 清洗2 次，使用RIPA 裂解液充分裂解細胞提取總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測定蛋白濃度，調平后上樣行10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），再轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜 上，5% 脫脂奶 粉封閉1 h，一抗 4 ℃下孵育過夜。隔天加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯的二抗室溫孵育1 h，放入超靈敏多功能成像儀，掃描成像。

1.2.5 CCK-8 實驗 將處于對數生長期的MC3T3-E1 細胞用胰蛋白酶消化后制備成細胞懸液，以2 000 個/孔接種至96 孔板中，每組設5 個復孔。培養1～6 d，每孔加入100 μL 含10% CCK-8 溶液的完全培養液孵育2 h，再用酶標儀測定450 nm 波長處下每孔的吸光度值。

1.2.6 EdU 實驗 將MC3T3-E1 細胞以3 000 個/孔接種于96 孔板中，至次日細胞貼壁后，加入EdU培養液繼續孵育5 h。標記完成后用PBS 洗脫多余的EdU，4%多聚甲醛室溫固定30 min，用2 mg/mL甘氨酸與PBS 各清洗1 遍。加入滲透劑（含0.5%TritonX-100 的PBS）室溫通 透10 min，PBS 清 洗后每孔加入100 μL Apollo 反應液，室溫避光孵育30 min。滲透劑再次清洗2～3 次，使用Hoechst 溶液對DNA 染色，室溫避光孵育10 min，PBS 清洗3 次后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.7 細胞劃痕實驗 將MC3T3-E1細胞以1×105個/孔接種至12 孔板，待細胞生長至100%的匯合狀態后，盡量垂直于細胞皿底用無菌槍頭劃出一條直線，PBS 清洗去除漂浮細胞，加入無血清培養液，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，分別拍攝記錄0、12、24 h 時的細胞遷移情況。

1.2.8 Transwell 實驗 用無血清培養液重懸MC3T3-E1 細胞并調整細胞密度為5×105個/mL，取100 μL細胞懸液接種于Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含20%胎牛血清的α-MEM 培養液，置于37 ℃、5%CO2培養箱培養24 h 后取出，再使用4%多聚甲醛固定15 min 后，用PBS 清洗，結晶紫溶液染色10 min，用棉簽擦去上室未遷移細胞，PBS 清洗后在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.9 堿性磷酸酶(ALP)染色 收集成骨誘導7 d后的細胞，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗，ALP 染色液孵育3 h，PBS 清洗后拍照。

1.3 統計學分析

使用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差（）表示，組間差異采用單因素方差分析進行比較，P<0.05 表示差異有統計學意義。統計繪圖使用Graphpad Prism 8 軟件（Graphpad公司，美國）。

2 結果

2.1 Lmo7 基因在成骨誘導過程中表達上調

對MC3T3-E1 細胞成骨誘導0、3、7、14 d 后，收集細胞樣品提取總RNA和蛋白，RT-qPCR和Western blotting 結果顯示，與未進行成骨誘導的對照組相比，Lmo7 的表達水平在14 d 內持續上調（圖1）。

圖1 RT-qPCR 和Western blotting 檢測Lmo7 在成骨誘導過程中的表達Figure 1 RT-qPCR and Western blotting detection of Lmo7 expression during osteogenic induction

2.2 構建穩定干擾Lmo7 的MC3T3-E1 細胞株

通過慢病毒轉染，嘌呤霉素篩選后獲得穩定干擾Lmo7 的MC3T3-E1 細胞株及對照組MC3T3-E1細胞株，進行傳代培養，熒光顯微鏡下觀察到mCherry 紅色熒光標記。收集細胞樣品，對轉染后細胞中Lmo7 的mRNA 及蛋白表達水平進行檢測，RT-qPCR 及Western blotting 結果顯示（圖2A、B），與對照組相比，干擾組Lmo7 mRNA 的相對表達敲低約80%（P<0.01），蛋白水平的表達也顯著下調，熒光顯微鏡下觀察帶有紅色熒光標記的細胞與明場細胞基本重合，證明2 組穩轉株構建成功（圖2C）。

圖2 慢病毒轉染MC3T3-E1 細胞后Lmo7 的表達Figure 2 Expression of Lmo7 after lentivirus transfection to MC3T3-E1 cells

2.3 干擾Lmo7 對MC3T3-E1 細胞增殖能力的影響

如圖3 所示，第2 天時干擾組細胞的吸光度值顯著高于對照組，2 組間的差異在第3、4 天時更加明顯，并一直維持到第6 天，表明干擾組細胞的增殖活性得到了促進。EdU 實驗也驗證了這一結論，熒光顯微鏡下觀察到相同的細胞接種數和孵育時間下，干擾組細胞被EdU 標記的數量要多于對照組，計算2 組的陽性率，其差異具有統計學意義（P<0.05）。

圖3 慢病毒轉染后MC3T3-E1 細胞的增殖情況Figure 3 Proliferation of MC3T3-E1 cells after lentivirus transfection

2.4 干擾Lmo7 對MC3T3-E1 細胞遷移能力的影響

如圖4 所示，劃痕實驗顯示在12、24 h 時，干擾組遷移到劃痕區域的細胞明顯少于對照組，用Image J 軟件（美國國家衛生研究院，美國）測量2 組細胞劃痕面積，并統計愈合率，結果顯示干擾組的細胞遷移能力較低，且差異具有統計學意義（P<0.01）。進一步通過Transwell 實驗驗證上述結論，培養24 h 后的結晶紫染色情況可以看出，干擾組遷移到下室的細胞數量更少。

圖4 慢病毒轉染后MC3T3-E1 細胞的遷移情況Figure 4 Migration of MC3T3-E1 cells after lentivirus transfection

2.5 干擾Lmo7 對MC3T3-E1 細胞成骨分化能力的影響

對慢病毒轉染并篩選后的穩轉細胞株進行成骨誘導，第7 天時，RT-qPCR 檢測了2 組細胞中成骨相關基因Runt 相關轉錄因子2（Runx2）、Osterix、ALP、骨鈣素（OCN）的相對表達水平。結果如圖5A—D 所示，干擾組Runx2、Osterix、ALP、OCN 基因的mRNA 相對表達量均低于對照組，差異具有統計學意義（P<0.01）。ALP 染色結果（圖5E、F）顯示，干擾組著色較淺且著色細胞數量少，光學顯微鏡下可見干擾組著色細胞數量較少且著色較淺。

圖5 慢病毒轉染后MC3T3-E1 細胞的成骨分化情況Figure 5 Osteogensis of MC3T3-E1 cells after lentivirus transfection

3 討論

Lmo7 隸屬于PDZ-LIM 蛋白家族，是一類在進化上具有高度保守性的蛋白，主要包含了鈣調蛋白同源性（calmodulin homology，CH）結構域、LIM 結構域和 PDZ 結構域[11-12]。作為常見的蛋白質-蛋白質相互作用結構域，LIM 結構域可以結合高度多樣性的蛋白，包括信號分子、細胞骨架及轉錄因子，能夠支持包括肌動蛋白組裝、整合素依賴性黏附及信號傳遞在內的細胞功能，并使該家族有機會參與許多生物學功能，包括在骨形成中的表達。LIM 礦化蛋白1（LIM mineralization protein-1，LMP-1）被認為是骨形成的細胞內調節劑，其關鍵機制是通過上調骨形態生成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）和穩定BMP/Smad 信號通路來增強成骨作用[13-14]。并且在牙周膜干細胞中，LMP-1 作為TGF-β1 的下游靶基因，是前成骨細胞增殖和分化中的關鍵早期信號[15]。在動物模型中，LIMK1-/-小鼠表現出與成骨細胞和破骨細胞功能缺陷相關的骨質減少表型[16]。鑒于這些蛋白與Lmo7 同屬PDZ-LIM 家族并擁有相同的結構域，我們猜測在其功能上可能具有類似之處。本課題組在前期研究中發現，Lmo7在小鼠上頜竇早期成骨前后有表達差異，但其功能仍需進一步驗證。

本實驗中，在成骨誘導0、3、7、14 d 的MC3T3-E1 細胞中檢測了Lmo7 的表達變化，發現Lmo7 的mRNA 與蛋白表達水平均隨著誘導時間的增加而持續上調，提示Lmo7 可能參與體外培養細胞的成骨分化過程。為了進一步研究Lmo7 在成骨細胞分化過程中的具體作用，本實驗運用慢病毒介導的基因轉導技術檢測Lmo7 表達水平變化后對細胞分化及生物學行為的影響。該技術是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）為基礎的基因載體，可以將shRNA 整合到細胞的基因組內，實現體內轉錄siRNA，從而可以長期穩定干擾RNA 表達，獲得高質量的穩轉株[17]。相較于使用siRNA 轉染細胞，慢病毒載體能夠整合較長外源性目的基因片段，更適合Lmo7 這樣的長片段基因。

成骨是一個復雜且有序的生理過程，從位于骨髓和骨膜中的間充質干細胞局部增殖開始，在每個階段表達不同的標志基因。其中，前成骨細胞向成骨細胞進一步分化需要表達 Runx2、Osterix，成熟的成骨細胞表達Ⅰ型膠原蛋白（collagenⅠ，ColⅠ）、OCN 及礦化過程中的關鍵酶ALP[18]。因此，我們選擇了Runx2、Osterix、ALP、OCN 這幾個成骨相關基因作為觀察Lmo7 對細胞成骨分化影響的指標。成骨誘導7 d 時，RT-qPCR 結果顯示，小鼠前成骨細胞低表達Lmo7 時，成骨相關基因Runx2、Osterix、ALP、OCN 的mRNA 表達水平明顯低于對照組（P<0.01）。與此同時，ALP 染色結果顯示，敲低Lmo7 的細胞著色較淺，即Lmo7 的低表達抑制了ALP 活性。Runx2是最重要的成骨主開關，它通過激活骨表型基因來促進多能間充質干細胞向前成骨細胞分化，也是成骨過程中最早發揮功能的轉錄激活因子[19]?，F有文獻[20]證實，Runx2 是TGF-β1 和BMP-2 的共同靶點，TGF-β1 可以通過Smad 非依賴途徑MAPK 通路正向調控Runx2 的表達和功能，以促進間充質干細胞的分化。通過Xie 等[8]的研究可知，Lmo7 是TGF-β1 的下游靶基因，因此我們猜測Lmo7 可能在TGF-β1 調控成骨的過程中發揮了一定的作用。

Lmo7 被證實通過其LIM 結構域與激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）、轉錄因子亞基 c-FOS 和c-JUN 相互作用，并促進它們的泛素化和降解[8]。其中，c-FOS 和c-JUN 是由原癌基因編碼的蛋白，其具有正向調控細胞增殖的作用[21-22]。這可能解釋了該研究中，敲低Lmo7 后，細胞增殖能力得到促進的情況。此外，在本實驗中，細胞劃痕實驗與Transwell 實驗均顯示，敲低Lmo7 后，細胞遷移能力受到抑制，這與現有文獻的結論一致。有研究[23-24]發現，Lmo7 能夠協同Rho 或直接通過降低G-肌動蛋白/F-肌動蛋白比率來調節肌動蛋白動力學，在胰腺癌、乳腺癌細胞中，Lmo7 的敲低均減弱了細胞的遷移能力。

綜上所述，本實驗探討了Lmo7 對MC3T3-E1細胞增殖、遷移及成骨分化的影響，初步證明體外敲低Lmo7 能正向調控細胞的增殖活性，同時抑制細胞的遷移和成骨分化的能力。本實驗為研究Lmo7 在成骨領域的作用提供了新的見解，其機制有待進一步探討。