4-辛基衣康酸抑制脂多糖誘導的小鼠顱骨炎性骨吸收的效果研究

溫從鵬， 童無憂， 陳旭卓， 賴林鋒

（1.溫州市中心醫院口腔科，溫州 325000；2.浙江中醫藥大學，杭州 310000；3.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔外科，上海 200011）

骨代謝是一個動態的過程，通常由成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收共同調控[1]。骨穩態是維持骨骼完整性和正常功能的必要條件[2]。然而機體內的炎癥、氧化應激和激素等因素的共同影響，常導致破骨細胞的過度形成，引起骨吸收增強，尤其在口腔頜面部，可誘發包括類風濕性關節炎、種植體周圍炎和牙周炎等在內的各類骨溶解性疾病，嚴重損害患者的生理和心理健康[3-4]。目前對于骨溶解性疾病的治療，主要包括非甾體類抗炎藥、雌激素類藥物、雙膦酸鹽和各類單抗藥物等，然而這些藥物因副作用大、價格昂貴等，各自都存在臨床應用的局限性[5]。因此，近年來出現了一系列針對抑制破骨細胞及其炎癥反應的相關新型藥物研究，開發一種安全且高效的藥物治療方法勢在必行。

骨溶解通常伴發炎癥反應，其特征是大量浸潤的免疫細胞和破骨細胞[6]。在眾多的免疫細胞中，巨噬細胞為分泌炎癥因子的主要來源，在骨溶解過程中起到了關鍵作用。在核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）的刺激下，巨噬細胞可以分化為體內唯一具有骨吸收功能的細胞——破骨細胞。已有越來越多的證據[7-8]表明，包括腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 和誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在內的炎癥因子，可以在沒有RANKL 的情況下直接誘導破骨細胞分化。同時，TNF-α、IL-1β等炎癥因子與RANKL 具有較強的協同作用，亦可通過刺激RANKL 及其受體RANK 的表達，上調破骨細胞形成，促使炎性骨溶解的發生[9]。因此，鑒于炎癥因子和RANKL 之間的緊密聯系，在骨溶解微環境中，有必要對BMMs 介導的炎癥反應和破骨細胞介導的骨吸收進行聯合干預。

衣康酸（itaconate，ITA）是一種由巨噬細胞自身合成的小分子代謝物產物，在細胞的免疫調節中起到重要作用[10]。然而ITA 作為一種羧酸，極性較強且不易穿透細胞膜，在大多數情況下難以被實際應用。4-辛基衣康酸（4-OI）作為ITA 的衍生物，具有較強的細胞膜滲透性，因此是研究ITA 生物學功能的理想替代物[11]。近年來，已有廣泛研究[12-14]證實，ITA 可通過多種途徑發揮其抗炎作用：①ITA可通過上調轉錄因子ATF3 的表達，干擾IκB 的降解，進而抑制炎癥反應核心信號NF-κB 通路的激活；②ITA 可通過與泛素連接酶kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白1（kelch-like ECH-associated protein-1，KEAP1）發生反應，激活細胞內的抗氧化樞紐蛋白——核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor-2，Nrf 2）的釋放和入核，進而增加其下游抗炎及抗氧化產物的表達；③ITA 可通過激活Nrf 2，在轉錄水平直接抑制炎癥相關基因的表達；④ITA 可通過抑制三羧酸循環中的琥珀酸脫氫酶的活性，降低線粒體活性氧（ROS）的產生。此前研究[15-17]曾報道，4-OI 可有效激活Nrf 2 發揮抗炎、抗氧化的作用，在關節炎、腹膜炎、急性肺損傷及骨質疏松等疾病中都有較好的治療效果。然而目前尚不清楚4-OI 是否對炎性骨溶解具有相似的治療效果。本研究旨在探討4-OI 對脂多糖（LPS）誘導的小鼠顱骨溶解的治療效果。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑

4-OI（Selleck 公司，美國）；大腸埃希菌來源的LPS（InvivoGen 公司，美國）；重組小鼠巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）、重組小鼠RANKL（RD 公司，美國）；α-MEM培養液（HyClone 公司，美國）；胎牛血清（Avantor 公司，美國）；青霉素-鏈霉素（Gibco 公司，美國）；CCK-8 試劑盒、ROS 檢測試劑盒（DCFH-DA）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（上海碧云天生物技術有限公司，中國）；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑（TaKaRa 公司，日本）；iNOS 一抗、免疫熒光二抗（CST 公司，美國）。

1.2 細胞培養

RAW 264.7 小鼠巨噬細胞系購買于中國科學院細胞庫。使用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素-鏈霉素的α-MEM 培養液，于37 ℃、5%的CO2恒溫培養箱內培養細胞系。當細胞匯合度達到80%～90%時，需進行傳代或種板。為了避免對細胞系造成刺激，常使用直接吹打或細胞刮收集細胞，而不使用胰蛋白酶。

使用全骨髓法提取小鼠原代骨髓來源巨噬細胞（BMMs）。簡而言之，從4～6 周齡C57/BL6 雄性小鼠的股骨和脛骨中收集骨髓細胞，重懸于含有30 ng/mL M-CSF 的完全α-MEM 培養液中，于37 ℃、5%的CO2恒溫培養箱培養原代細胞。培養液每2 d 換液1 次，當細胞匯合度達到80%～90%時，需使用含0.25%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰蛋白酶消化，隨后進行傳代或種板。

1.3 細胞毒性實驗

將RAW 264.7巨噬細胞和BMMs以8×103個/孔的密度種于96 孔板。待細胞貼壁后，加入不同濃度（6.25、12.5、25、50、100 μmmol/L）4-OI。繼續培 養RAW 264.7 巨噬細胞24 h 和48 h；而對于BMMs，則繼續培養48 h 和96 h。隨后向每個孔中加入10 μL的CCK-8 溶液。避光孵育2 h 后，于酶標儀上檢測450 nm 波長處的吸光度值。將空白對照組細胞活力設定為100%，以此為基準計算每組的細胞活力百分比。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）

將RAW 264.7 巨噬細胞以5×105個細胞/孔的密度種于6 孔板。待細胞貼壁后，分別加入100 ng/mL 的LPS 及不同 濃度的4-OI（12.5、50 μmmol/L）作用24 h。根據說明書，使用RNA提取試劑盒（Axygen 公司，美國）提取細胞中的總RNA。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit（TaKaRa公司，日本）進行逆轉錄（1 000 ng 總RNA 體系）。使用TB Green?Premix Ex TaqTMKit（TaKaRa 公司，日本）配制反應體系。隨后使用ABI7500 實時熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems 公司，美國）進行RT-qPCR。以β-actin 作為內參基因，用2-ΔΔCt來計算基因的相對表達量。引物序列見表1。

1.5 細胞免疫熒光

將RAW 264.7 細胞以5×104個細胞/孔的密度接種于共聚焦皿，待細胞貼壁后，分別加入100 ng/mL的LPS 及不同濃度（12.5、50 μmmol/L）4-OI 作 用24 h。隨后依次使用4%多聚甲醛固定、含0.5%Triton X-100 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）通透及免疫熒光封閉液封閉。使用免疫熒光一抗稀釋液稀釋一抗（iNOS 一抗使用比例為1∶100），4 ℃下過夜孵育。第2 天使用PBS 稀釋二抗（山羊抗兔熒光二抗，使用比例為1∶500），室溫搖床孵育1 h。使用5 μg/mL 的DAPI 避光孵育5 min。隨后于共聚焦顯微鏡下觀察（DAPI：405 nm激發光；iNOS：488 nm激發光）。拍攝完畢后，在Image J 軟件上對陽性細胞進行統計，算得各組的陽性細胞相對百分率（陽性細胞數/DAPI 數×100%）。

1.6 ROS 檢測

將RAW 264.7 細胞以5×104個細胞/孔的密度接種于共聚焦皿，待細胞貼壁后，分別加入100 ng/mL的LPS 及不同濃度（12.5、50 μmmol/L）4-OI 作用24 h。隨后使用ROS 檢測試劑盒（DCFH-DA）檢測細胞內ROS 水平。按照 1∶1 000 的比例用無血清培養液稀釋DCFH-DA 探針，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中避光孵育20 min，在共聚焦顯微鏡下觀察細胞熒光強度。拍攝完畢后，在Image J 軟件上對熒光強度進行統計，計算各組細胞的相對熒光強度（實驗組熒光強度/對照組熒光強度×100%）。

1.7 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色

將小鼠BMMs 以1×104個/孔的密度接種于96 孔板，待細胞貼壁后，分別加入50 ng/mL 的RANKL 及不同濃度（12.5、50 μmmol/L）4-OI，隔天換液，持續誘導5 d。待破骨細胞形成后，使用4%多聚甲醛室溫固定15 min，用PBS 漂洗2 次后，加入TRAP 染液，于37 ℃下染色1 h。隨后用PBS 漂洗2 次，于倒置顯微鏡下，每孔隨機選取5 個視野拍照。拍攝完畢后，將照片導入Image J 軟件中，統計各孔破骨細胞（細胞核≥3 個）的數量和面積。

1.8 LPS 誘導的小鼠顱骨溶解模型的建立

本研究中的動物實驗已獲得上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物倫理委員會批準（批準號：SH9H-2020-A1-1），并嚴格遵循實驗動物管理條例進行實驗。實驗動物為6 周齡C57BL/6 雄性小鼠[體質量約（20±2）g]，共 15 只，將實驗動物平均分為3 組：假手術組（PBS）、LPS 組（10 mg/kg LPS）、4-OI 治療組（10 mg/kg LPS+5 mg/kg 4-OI）。實驗動物由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院實驗動物中心提供，手術及取材均在實驗動物中心進行。

腹腔注射2%戊巴比妥以麻醉小鼠，使用脫毛膏脫除小鼠頭部毛發，切開皮膚，暴露顱骨，使用剝離子剝開骨膜，在人字縫中間植入浸泡過200 μg LPS 的明膠海綿（4 mm×4 mm×2 mm）。對于假手術組，則植入PBS 浸泡的明膠海綿（4 mm×4 mm×2 mm）；3 d 后待創口愈合，LPS 組于小鼠顱頂處局部注射200 μg 的LPS；4-OI 組則分別于小鼠顱頂處局部注射200 μg 的LPS，以及腹腔注射100 μg的4-OI，隔天注射，直到造模第14 天，對小鼠進行安樂死并取材。將取材后的顱骨于4%多聚甲醛中固定48 h，流水過夜后，保存于75%乙醇中。

1.9 Micro-CT 檢測

使用高分辨率micro-CT 掃描機（Scanco Medical AG 公司，瑞士）對樣本進行掃描（分辨率10 μm，掃描電壓70 kV，電流200 μA，曝光時間300 ms）。掃描后對標本進行三維重建和分析。

1.10 組織切片染色

將樣本置于10%的EDTA 溶液（pH=7.4）中，在室溫下脫鈣，每3 天更換1 次脫鈣液，連續脫鈣4 周。隨后將樣本進行脫水、浸蠟、包埋、切片，再分別進行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）、TRAP及組織免疫熒光染色處理。使用Image J 軟件對iNOS 陽性細胞百分比及TRAP 陽性細胞數量進行統計。

1.11 統計學分析

使用GraphPad Prism 8.0 軟件包進行統計學分析。正常分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示。使用獨立樣本t檢驗進行2 組間差異分析，使用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）進行多組間差異分析，組間差異比較采用Tukey 檢驗。P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 4-OI 對RAW 264.7 巨噬細胞及小鼠原代BMMs的細胞毒性檢測

如 圖1A 所 示，4-OI 含有典型的α、β-不 飽和羧酸結構，提示該化合物具有較活潑的化學性質。CCK-8 結果顯示，4-OI 在100 μmmol/L 的濃度范圍內不會影響RAW 264.7 巨噬細胞的細胞活性（圖1B）。對于小鼠原代BMMs，在48 h 培養后，100 μmmol/L 濃度范圍內的4-OI 無明顯細胞毒性，而培養96 h 后，100 μmmol/L 的4-OI 則表現出明顯的細胞毒性（圖1C）（P<0.001）。因此，我們選取對細胞無毒性的2 組（12.5、50 μmmol/L 4-OI）進行后續實驗。

2.2 4-OI 可有效抑制LPS 誘導的巨噬細胞促炎相關基因表達

RT-qPCR 結果（圖2A）顯示，在LPS 的刺激下，促炎相關基因如TNF-α、IL-1β、IL-6 和iNOS 的mRNA 表達量均顯著增加，提示炎癥反應體系構建成功。而對于12.5 μmmol/L 和50 μmmol/L 的4-OI 處理組，促炎相關基因的表達水平較LPS 組均顯著降低，且具有濃度依賴性。隨后，我們通過免疫熒光進一步觀察4-OI 對巨噬細胞炎癥的抑制效果。如圖2B 和圖2C 所示，在LPS 的刺激下，炎癥巨噬細胞表面標志物iNOS 的表達顯著升高，而在12.5 μmmol/L 和50 μmmol/L 的4-OI 處理下，iNOS表達均顯著下降（P<0.001）。以上結果均提示4-OI對LPS 誘導的巨噬細胞促炎相關基因的表達具有較為高效的抑制效果。

圖2 4-OI 對LPS 誘導的巨噬細胞炎癥的影響Figure 2 The effect of 4-OI on LPS-induced inflammation of macrophage

2.3 4-OI 可有效降低炎癥巨噬細胞內的ROS 水平

如圖3A 所示，經100 ng/mL 的LPS 誘導后，RAW 264.7 巨噬細胞內的ROS 水平顯著上升。而在不同濃度4-OI 的作用下，細胞內ROS 水平均顯著下降（P<0.01），且高濃度（50 μmmol/L）的4-OI較低濃度（12.5 μmmol/L）降低得更為明顯（圖3B）。

圖3 4-OI 對LPS 誘導的炎癥巨噬細胞內ROS 水平的影響Figure 3 The effect of 4-OI on ROS level in inflammatory macrophages

2.4 4-OI 可有效抑制RANKL 誘導的破骨細胞分化

圖4A 中TRAP 染色結果顯示，經50 ng/mL 的RANKL 刺激5 d 后，可見大量TRAP 陽性的多核破骨細胞形成，而不同濃度4-OI 處理組中，TRAP 陽性細胞的數量（圖4B）及面積占比（圖4C）則顯著減少（P<0.01），提示4-OI 具有較為理想的破骨分化抑制效果。

圖4 4-OI 對RANKL 誘導的破骨分化的影響Figure 4 The effect of 4-OI on RANKL-induced osteoclastogenesis

2.5 4-OI 可有效抑制LPS 誘導的小鼠顱骨溶解

Micro-CT 掃描的重建結果顯示，LPS 組的顱骨表面出現了廣泛性的骨溶解，具體表現為深而大的骨吸收坑。相比之下，4-OI 治療組中的小鼠骨溶解范圍明顯局限，骨吸收坑較LPS 組淺而?。▓D5A）。Micro-CT 定量分析結果顯示，4-OI 治療組的骨體積分數（bone volume/tissue volume，BV/TV）與LPS組相比，得到顯著改善（圖5B，P<0.05）。同時，經4-OI 治療后，顱骨表面骨溶解的孔隙率明顯降低（圖5C，P<0.05），與LPS 組相比，孔隙率降低超過35%，提示4-OI 具有明顯的骨溶解抑制效果。

圖5 Micro-CT 檢測4-OI 對LPS 誘導的小鼠顱骨溶解的治療效果Figure 5 Micro-CT detection of the effect of LPS-induced murine calvarial osteolysis treated by 4-OI

如圖6A 所示，HE 和TRAP 染色均顯示，LPS組的小鼠顱骨具有廣泛的溶骨性破壞，提示模型構建成功。HE 染色可見LPS 組內炎癥細胞的浸潤及組織缺損程度較假手術組明顯增加，而4-OI 治療組有效抑制了炎癥浸潤及組織破壞的水平。組織免疫熒光染色亦顯示，LPS 組內iNOS 陽性細胞百分比較假手術組顯著增加，而4-OI 治療組內iNOS 陽性細胞百分比顯著降低（圖6B，P<0.01）。TRAP染色結果可見LPS 組中骨小梁的邊緣存在大量TRAP 陽性的破骨細胞，而在4-OI 組中，TRAP 陽性破骨細胞的數量則顯著降低（圖6C，P<0.001），提示4-OI 對炎性骨溶解病變中的破骨細胞具有較好的抑制效果。

圖6 組織學檢測4-OI 對LPS 誘導的小鼠顱骨溶解的治療效果Figure 6 Histology detection of the effect of LPS-induced murine calvarial osteolysis treated by 4-OI

3 討論

一般而言，骨溶解與炎癥反應關系密切。炎癥反應和骨吸收的過度激活可引發包括骨關節炎、類風濕性關節炎、骨質疏松、牙周炎和種植體周圍炎等一系列骨溶解性疾病。然而，目前臨床上應用的藥物存在骨壞死、腎毒性及易過敏等副作用。因此有必要開發一種可預防和治療炎性骨溶解的新型藥物。作為細胞內的一種免疫代謝產物，衣康酸具有α，β-不飽和羧酸結構，可通過邁克爾加成反應烷基化內源性蛋白中的半胱氨酸殘基，發揮其生物學作用[10]。在此，本研究探究衣康酸衍生物4-OI 對炎性骨溶解的治療效果，以期進一步擴大衣康酸及其衍生物在生物醫學領域的應用范圍。

在本研究中，我們首先對4-OI 的細胞毒性進行了檢測。使用不同濃度的4-OI 分別處理RAW 264.7 巨噬細胞和小鼠原代BMMs，并分別于24、48 h 和48、96 h 進行CCK-8 檢測。結果顯示4-OI對RAW 264.7 巨噬細胞和小鼠原代BMMs 的安全濃度 分別為100 μmmol/L 和50 μmmol/L，因此我們選取了對細胞無毒性的2 組濃度（12.5、50 μmmol/L）進行后續實驗。在確定了4-OI 的細胞安全濃度后，我們進一步探究了4-OI 對LPS 誘導的巨噬細胞炎癥反應的抑制效果。首先，使用100 ng/mL 的LPS 刺激RAW 264.7 巨噬細胞24 h，與此同時加入濃度為12.5 μmmol/L 和50 μmmol/L 的4-OI 進行處理。結果顯示，4-OI 可以在不影響細胞活性的情況下，有效地抑制LPS 誘導的巨噬細胞炎癥反應，以濃度依賴性的方式降低TNF-α、IL-1β、IL-6 和iNOS 的轉錄表達水平，同時有效抑制iNOS的蛋白表達水平。巨噬細胞在炎癥因子的作用下可發生呼吸爆發，導致線粒體氧耗量迅速增加，產生大量的ROS，進而導致氧化應激的發生，氧化應激進一步促進炎癥因子的產生，引發炎癥-氧化應激-炎癥的惡性循環[18-19]。在本研究中，我們發現在50 μmmol/L 4-OI 作用下的炎癥巨噬細胞中，DCFHDA 熒光強度與未加LPS 刺激的對照巨噬細胞相當，提示此時4-OI 對ROS 具有強效的抑制作用，具體可能通過降低線粒體ROS 產生、抑制炎癥因子表達和增加抗氧化產物生成而實現。隨后，我們進一步對4-OI 對破骨細胞分化的作用效果進行探究。TRAP 染色結果顯示，4-OI 可以有效抑制破骨細胞的分化，降低破骨細胞數量及面積。以上結果均提示，4-OI 具備良好的體外抗炎、抗氧化和抗破骨細胞分化功能。

為了進一步探究4-OI 的體內治療效果，我們構建了LPS 誘導的小鼠炎性骨溶解模型。在造模后第3 天，于治療組小鼠腹腔注射4-OI，隔天注射，并于造模后第14 天取材。LPS 即內毒素，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組成部分，可作為一種有效的炎癥誘導劑，在體內模擬炎性骨溶解的發生[20]。LPS可通過激活巨噬細胞表面的Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4），進而誘導NF-κB 通路和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）通路的激活，產生持續的炎癥反應[21]。Micro-CT 結果顯示，4-OI 可有效改善LPS 所誘導的顱骨溶解，BV/TV 及孔隙率指標較LPS 組相比，均有顯著改善。與Micro-CT 結果相似，組織學切片染色及定量分析亦表明，4-OI 可有效地抑制LPS 誘導的骨溶解進展，骨溶解處周圍炎癥浸潤和組織缺損程度明顯降低，同時iNOS 陽性細胞百分比顯著下降，提示4-OI具有理想的體內炎癥骨溶解治療效果。

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究尚未對4-OI 抑制巨噬細胞炎癥及破骨細胞分化進行更深一步的機制研究。其次，4-OI 能否通過口服用藥的方式有效抑制炎性骨溶解疾病的進展，亦是下一步需要探究的一個重要問題。最后，4-OI是否可能會影響成骨細胞行為，也需要在后續的研究中進一步探討。

綜上所述，本研究證實衣康酸的衍生物4-OI 在體外可以有效地降低炎癥巨噬細胞內促炎因子的表達，降低細胞內ROS 水平，抑制RANKL 誘導的破骨細胞分化，在體內亦可以有效地緩解LPS 誘導的小鼠炎性顱骨溶解，對于口腔頜面部骨溶解相關疾病的治療具有極大的應用前景。