MMP-9抑制劑對人口腔鱗狀細胞癌細胞系CAL27生物學行為影響機制的研究

王靜璇， 劉紅悅， 莊志征， 胡 燕， 楊英順

（1.保定市第一中心醫院口腔二科，保定 071000；2.衡水市第二人民醫院口腔二科，衡水 053099；3.河北大學附屬醫院口腔科，保定 071030）

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）的定義為具有不同分化程度的浸潤性上皮腫瘤，是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤[1]。目前在治療方面取得了技術進步，大多數早期OSCC 患者可通過手術、化學療法及放射療法治療，但隨著診斷延遲，其5 年生存率不足60%；此外，繼發性腫瘤每年3%～7%的形成率是其他惡性腫瘤所無法比擬的，并可能導致疾病復發[2-3]。據報道[4]，腫瘤轉移是癌癥患者死亡的主要原因，上皮間質轉化（EMT）和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）降解過程涉及腫瘤遷移和侵襲，已成為近年來腫瘤轉移研究的熱點，積極探索癌癥轉移過程中的關鍵調控分子并加以干預可能是OSCC 治療的潛力選擇?；|金屬蛋白酶（MMPs）在此過程中發揮積極作用，其還參與促生長信號釋放、抗細胞凋亡、控制血管生成和新血管形成等促進惡性腫瘤發展過程[5]，提示MMPs 可能是OSCC 治療的潛在靶點。BB-94 是一種廣譜MMP 抑制劑，其可抑制基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的活性。研究[6]發現，BB-94 的治療降低了食管鱗狀癌細胞的生長、遷移和EMT，但關于BB-94 對OSCC 的相關報道較少。PI3K/Akt 通路在調節細胞生長和代謝中起關鍵作用，研究[7]發現，該通路失活可抑制OSCC 細胞EMT。為探究BB-94 對OSCC 的干預作用及是否涉及PI3K/Akt 通路，本實驗以體外培養的人OSCC 細胞系CAL27 為研究載體，并探討BB-94 對CAL27 細胞惡性生物學行為的影響及可能的作用機制，以期為OSCC 發病機制及治療手段提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人OSCC 細胞系CAL27 購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 試劑和儀器 BB-94（APExBIO 公司，美國）；Matrigel 基質膠（BD 公司，美國）；明膠（Sigma 公司，美國）；AnnexinV-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)流式細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司，中國）；DMEM 培養液、胎牛血清（Gibco 公司，美國）；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、N-鈣黏蛋白（N-cad）、MMP-9、E-鈣黏蛋白（E-cad）、波形蛋白（Vim）抗體（Abcam 公司，美國）；全自動酶標儀（Bio-Rad 公司，美國）；實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）儀（賽默飛世爾科技有限公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 DMEM 完全培養液（含10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素、100 U/mL 青霉素）復蘇CAL27細胞，以1×105個/mL密度接種至培養瓶中，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度環境條件下的培養箱中培養，待細胞生長至80%左右時即進行傳代，傳代2～3 次。

1.2.2 明膠酶譜實驗檢測MMP-9 活性 利用不含胎牛血清的DMEM 條件培養液（200 μL）以每孔1×105個的細胞密度將CAL27 細胞接種至24 孔板，培養48 h 后，收集細胞上清液。7 μL 上清液與2×樣品緩沖液[pH 8.0、125 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、4%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）及0.05%溴酚藍]室溫孵育10 min，加樣至含1 mg/mL 明膠的10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electro-phoresis，SDS-PAGE）凝膠中，125 V 恒壓分離蛋白至示蹤染料到凝膠底部，孵育凝膠于復性緩沖液后置于顯影緩沖液中平衡，考馬斯亮藍R-250 染色30 min，后用10%乙酸和10%的異丙醇脫色。用凝膠成像分析系統進行掃描，以0 μg/mL BB-94 組細胞做對照，以條帶面積×平均吸光度值反映MMP-9 活性。

1.2.3 細胞計數試劑盒-8(CCK-8)實驗檢測BB-94對CAL27 細胞存活率的影響 收集對數期細胞，利用含0（對照組）、0.125、0.25、0.5 及1.0 μg/mL BB-94（實驗組）的DMEM 條件培養液重懸，并以2×104個/mL 密度接種100 μL 細胞懸液于96 孔板中，每個濃度各5 個復孔。培養箱內培養48 h 后，棄去培養液加入含10 μL CCK-8 溶液的DMEM 完全培養液，繼續培養2 h。全自動酶標儀測定450 nm 處的吸光度值，細胞存活率（%）=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%，重復3 次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集對數期細胞，利用含0、0.125、0.25、0.5、1.0 μg/mL BB-94 的DMEM 條件培養液重懸，以1×105個/mL 的密度接種2 mL 細胞懸液于6 孔板中，每個濃度各5 個復孔。培養箱內培養48 h 后收集細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3 次，結合緩沖液重懸，5 μL Annexin V-FITC 溶液、5 μL PI 溶液避光染色15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，重復3 次。

1.2.5 傷口愈合實驗檢測細胞遷移能力 收集對數期細胞，DMEM 完全培養液重懸，以1×105個/mL 密度接種2 mL 細胞懸液于6 孔板中。待培養至匯合，10 μL 移液槍頭制造劃痕，PBS 洗滌細胞3 次后利用含0、0.125、0.25、0.5、1.0 μg/mL BB-94 的無血清DMEM 培養液培養48 h，在劃痕后0 h 和48 h 時拍照并利用Image J 軟件（Rawak Software 公司，德國）測量劃痕寬度，劃痕愈合率代表細胞遷移能力，劃痕愈合率=（0 h 劃痕寬度-48 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%，重復3 次。

1.2.6 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 以每孔1×105個細胞密度接種CAL27 細胞至Transwell 6孔板上室（涂布有matrigel 基質膠），加入1 mL 對應無血清培養液；于Transwell 6 孔板下室加入2 mL含10%胎牛血清的對應培養液，48 h后棄去培養液，4%多聚甲醛固定，PBS 洗滌后結晶紫染色10 min，PBS 洗滌3 次，鏡下觀察并計數侵襲細胞數量，重復3 次。

1.2.7 RT-qPCR 技術檢測PI3K、Akt mRNA 相對表達水平 細胞分組及培養同步驟1.2.3。TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，檢測其濃度及純度后逆轉錄為cDNA。制備RT-qPCR 反應體系，反應條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個循環，72 ℃ 60 s。以GAPDH 為內參，2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。用Primer Premier 5.0 軟件（Premier 公司，加拿大）設計引物，送至河北華大基因細胞科技有限公司合成。引物序列PI3K：正向引物5'-ACGCTTTCAAACGCTATCTCC-3'，反向引物5'-CTGATGAGGTATGCTAGG CGA-3'；Akt：正向引物5'-GAGGATCTTCATGGCGTAGTAG-3'，反向引物5'-TG ACCATGAACGAGTTTGAGTA-3'；β-actin：正向引物：5'-CAGGAGGCATTGCT GATGAT-3'，反向引物5'-GAAGGCTGGGGCTACTTT-3'。

1.2.8 Western blotting 檢測相關蛋白相對表達情況 細胞分組及培養同步驟1.2.3。PBS 洗滌2～3 次，收集細胞沉淀，裂解緩沖液振蕩裂解，4 ℃下12 000 r/min 離心10 min 后取上清液。測定細胞全蛋白濃度，12.5% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，蛋白轉移至PVDF 膜，1×TBST 洗膜3 次，每次10 min，0.05 g/mL 脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗（均1︰1 000 稀釋）于4 ℃下孵育過夜，洗膜，二抗（1︰8 000 稀釋）室溫孵育2 h，洗膜，增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）液與PVDF 膜反應1～2 min，化學發光凝膠成像系統曝光并拍照記錄。用Image J 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參β-actin 灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析

利用SPSS 26.0 軟件進行數據統計學處理，多計量資料比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用LSD-t檢驗，計量結果均以平均數±標準差（x±s）表示。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BB-94 對CAL27 細胞MMP-9 相對活性的影響

不同濃度BB-94 作用下的CAL27 細胞MMP-9相對活性比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。CAL27 細胞MMP-9 相對活性均隨BB-94 作用濃度增大而降低（P<0.05）。詳見圖1、表1。

表1 CAL27 細胞MMP-9 相對活性比較（）Table 1 Comparison of MMP-9 relative activity of CAL27 cells()

表1 CAL27 細胞MMP-9 相對活性比較（）Table 1 Comparison of MMP-9 relative activity of CAL27 cells()

①表示P<0.05，與0 μg/mL 組比較；②表示P<0.05，與0.125 μg/mL組比較；③表示P<0.05，與0.25 μg/mL 組比較；④表示P<0.05，與0.5 μg/mL 組比較。

圖1 各濃度BB-94 作用下的CAL27 細胞MMP-9 明膠酶譜Figure 1 MMP-9 gelatinase spectrum of CAL27 cells at different concentrations of BB-94

2.2 BB-94 對CAL27 細胞增殖的抑制情況

不同濃度BB-94 作用下CAL27 細胞存活率比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。CAL27 細胞存活率隨BB-94 濃度增大而降低（P<0.05）。詳見表2。

表2 不同濃度BB-94 培養下CAL27 細胞存活率比較（）Table 2 Comparison of survival rates of cal27 cells cultured with different concentrations of BB-94 ()

表2 不同濃度BB-94 培養下CAL27 細胞存活率比較（）Table 2 Comparison of survival rates of cal27 cells cultured with different concentrations of BB-94 ()

①表示P<0.05，與0 μg/mL 組比較；②表示P<0.05，與0.125 μg/mL組比較；③表示P<0.05，與0.25 μg/mL 組比較；④表示P<0.05，與0.5 μg/mL 組比較。

2.3 BB-94 對CAL27 細胞凋亡的影響

不同濃度BB-94作用下CAL27細胞凋亡率比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。CAL27 細胞凋亡率隨BB-94 濃度增大而升高（P<0.05）。詳見圖2、表3。

表3 不同濃度BB-94 培養下CAL27 細胞凋亡率比較（）Table 3 Comparison of apoptosis rates of CAL27 cells cultured with different concentrations of BB-94 (()

表3 不同濃度BB-94 培養下CAL27 細胞凋亡率比較（）Table 3 Comparison of apoptosis rates of CAL27 cells cultured with different concentrations of BB-94 (()

①表示P<0.05，與0 μg/mL 組比較；②表示P<0.05，與0.125 μg/mL組比較；③表示P<0.05，與0.25 μg/mL 組比較；④表示P<0.05，與0.5 μg/mL 組比較。

圖2 流式細胞儀檢測各濃度BB-94 作用下CAL27 細胞的凋亡情況Figure 2 Apoptosis of CAL27 cells at different concentrations of BB-94 detected by flow cytometry

2.4 BB-94 對CAL27 細胞遷移能力的影響

不同濃度BB-94 作用下CAL27 細胞劃痕愈合率比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。CAL27細胞劃痕愈合率隨BB-94 作用濃度增大而降低（P<0.05）。詳見圖3、表4。

表4 不同濃度BB-94 培養下CAL27 細胞劃痕愈合率比較（）Table 4 Comparison of wound healing rates of CAL27 cells cultured with different concentrations of BB-94 (()

表4 不同濃度BB-94 培養下CAL27 細胞劃痕愈合率比較（）Table 4 Comparison of wound healing rates of CAL27 cells cultured with different concentrations of BB-94 (()

①表示P<0.05，與0 μg/mL 組比較；②表示P<0.05，與0.125 μg/mL組比較；③表示P<0.05，與0.25 μg/mL 組比較；④表示P<0.05，與0.5 μg/mL 組比較。

圖3 各濃度BB-94 作用下CAL27 細胞遷移情況(×20)Figure 3 Migration of CAL27 cells at various concentrations of BB-94 (×20)

2.5 BB-94 對CAL27 細胞侵襲能力的影響

不同濃度BB-94 作用下CAL27 侵襲細胞數比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。CAL27 侵襲細胞數隨BB-94 作用濃度增大而減少（P<0.05）。詳見圖4、表5。

表5 不同濃度BB-94 培養下CAL27 侵襲細胞數比較（）Table 5 Comparison of CAL27 invasive cells cultured with different concentrations of BB-94 (()

表5 不同濃度BB-94 培養下CAL27 侵襲細胞數比較（）Table 5 Comparison of CAL27 invasive cells cultured with different concentrations of BB-94 (()

①表示P<0.05，與0 μg/mL 組比較；②表示P<0.05，與0.125 μg/mL組比較；③表示P<0.05，與0.25 μg/mL 組比較；④表示P<0.05，與0.5 μg/mL 組比較。

圖4 各濃度BB-94 作用下CAL27 細胞侵襲情況（×200）Figure 4 Invasion of CAL27 cells at various concentrations of BB-94 (×200)

2.6 BB-94 對CAL27 細胞PI3K、Akt mRNA 表達的影響

不同濃度BB-94 作用下CAL27 細胞PI3K、Akt mRNA 相對表達水平比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。CAL27 細胞PI3K、Akt mRNA 相對表達水平均隨BB-94 作用濃度增大而降低（P<0.05）。詳見表6。

表6 CAL27 細胞PI3K、Akt mRNA 相對表達水平比較（）Table 6 Comparison of relative expression levels of PI3K and Akt mRNA in CAL27 cells ()

表6 CAL27 細胞PI3K、Akt mRNA 相對表達水平比較（）Table 6 Comparison of relative expression levels of PI3K and Akt mRNA in CAL27 cells ()

①表示P<0.05，與0 μg/mL 組比較；②表示P<0.05，與0.125 μg/mL組比較；③表示P<0.05，與0.25 μg/mL 組比較；④表示P<0.05，與0.5 μg/mL 組比較。

2.7 BB-94 對CAL27 細胞中相關蛋白表達的影響

不同濃度BB-94 作用下CAL27 細胞中PI3K、p-Akt、Vim、N-cad、MMP-9 及E-cad 蛋白相 對表達水平比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。CAL27細胞中PI3K、p-Akt、Vim、N-cad 及MMP-9 蛋白相對表達水平隨BB-94 作用濃度增大而降低，E-cad蛋白相對表達水平隨BB-94 作用濃度增大而升高。詳見圖5、表7。

表7 CAL27 細胞PI3K 等蛋白相對表達水平比較（）Table 7 Comparison of relative expression levels of PI3K and other proteins in CAL27 cells (())

表7 CAL27 細胞PI3K 等蛋白相對表達水平比較（）Table 7 Comparison of relative expression levels of PI3K and other proteins in CAL27 cells (())

①表示P<0.05，與0 μg/mL 組比較；②表示P<0.05，與0.125 μg/mL 組比較；③表示P<0.05，與0.25 μg/mL 組比較；④表示P<0.05，與0.5 μg/mL組比較。

圖5 各濃度BB-94 作用下CAL27 細胞相關蛋白Western blotting 條帶圖Figure 5 Western blotting banding of CAL27 cell related proteins at various concentrations of BB-94

3 討論

惡性腫瘤的特征之一是具有內在的ECM 降解活性，ECM 是腫瘤轉移的重要組織屏障，其基底膜屏障被破壞將支持侵襲發生[8]。MMPs 為鋅依賴性內切蛋白酶家族，可參與ECM 中各種蛋白質的組織重塑和降解過程，為膠原蛋白降解中的主要ECM酶[9]，其失調可導致癌癥標志的關鍵信號通路失衡，維持增殖信號轉導，逃避生長抑制因子和細胞死亡抗性，從而實現復制永生，因而被視為潛在的抗癌藥物靶標[10]。

MMP-9 是由旁分泌癌細胞分泌的明膠酶，與另一種明膠酶MMP-2 不同，MMP-9 是可誘導的，且在正常成人組織中檢測不到其活性，它的表達被視為腫瘤侵襲的主要先決條件[11]。有研究[12]發現，MMP-9 表達存在于所有OSCC 病例中，且實質中MMP-9 的染色強度強于腫瘤基質。在OSCC 中，MMP-9 可通過破壞基底膜促進腫瘤進展并實現轉移，其過表達被證明在OSCC 中具有預后價值[13]。BB-94 為廣譜MMPs 抑制劑，可顯著抑制MMP-9 活性及表達[14]。研究[15]發現，BB-94 可降低肝腫瘤動物模型射頻消融后的腫瘤生長并抑制其侵襲性，可通過下調MMP-9 表達抑制胰腺癌細胞的增殖和遷移[16]。本研究結果顯示，BB-94 可顯著抑制OSCC細胞系CAL27 細胞中MMP-9 活性，抑制CAL27 細胞增殖并促進其凋亡，并可降低CAL27 細胞傷口愈合及遷移能力，提示BB-94 可能通過下調MMP-9活性降低癌細胞對ECM 穿透能力及屏障降解損傷作用，進而抑制OSCC 癌細胞的惡性生物學行為。

EMT 是癌癥發展和轉移第一階段的關鍵機制，可啟動和維持涉及一系列關鍵轉錄因子、MMPs 及下游途徑的有序激活，從而利于改變細胞間黏附和ECM 重塑，并最終導致ECM 內的侵入性遷移[17]。EMT 特征是細胞的上皮特性喪失，如黏附和上皮標志物E-cad 的表達，而獲得間充質特性，如增加細胞運動和間充質標志物N-cad 和Vim 的上調[18]。MMP-9 通過其對E-cad 的蛋白水解作用和伴隨的Vim 和N-cad 喪失而作為EMT 誘導劑[10]。本研究結果顯示，BB-94 可顯著抑制CAL27 細胞中Vim 及N-cad 蛋白表達，上調E-cad 蛋白相對表達水平，提示BB-94 可能通過抑制MMP-9 表達抑制CAL27 細胞的EMT 轉化。研究[19]發現，抗EMT 特性與抑制MMP-9 相關信號通路激活有關。PI3K/Akt 通路被認為是參與肺癌細胞轉移和EMT 關鍵機制之一，與腎細胞癌細胞增殖和轉移有關，另可調節人咽部鱗狀細胞癌細胞凋亡，據報道抑制該信號通路可減輕OSCC 的發展[20]。Liu 等[21]的研究結果顯示，腫瘤相關巨噬細胞分泌的MMP-9 通過PI3K/Akt 通路促進胃癌轉移；Jiang 等[22]研究表明，PI3K/Akt 通路可激活EMT 并促進OSCC 進展。本研究結果顯示，BB-94 可顯著降低PI3K、Akt mRNA 相對表達水平，并下調PI3K 及p-Akt 蛋白表達，提示BB-94 可能通過下調MMP-9 表達抑制PI3K/Akt 信號通路激活，減緩EMT 進展，進而發揮一系列抗CAL27 細胞惡性生物學行為作用。

綜上所述，BB-94 可抑制人OSCC 細胞系CAL27細胞的惡性生物學行為，其作用機制可能與下調MMP-9 表達，進而抑制PI3K/Akt 信號通路激活的EMT 進展有關。