內蒙古呼倫貝爾地區本土牛牛肉黃脂現象的相關基因和代謝組學研究

王 瀟，李 慧，蘇少鋒，趙 濛，田 菁，趙鴻雁，左蘭明，梁智杰，王金環，田如剛

（1.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；2.鄂托克旗農牧技術推廣中心，內蒙古 鄂托克旗 016199；3.赤峰市敖漢旗農牧局，內蒙古 敖漢旗 024300；4.赤峰市農牧技術推廣中心，內蒙古 赤峰 024031；5.赤峰市農牧局，內蒙古 赤峰 024050）

內蒙古呼倫貝爾草原地處我國北疆， 地域遼闊，是世界著名的天然牧場，也是世界四大草原之一。在草場上自然放牧的本土牛，為當地特有的蒙古牛品種， 牛肉具有皮下脂肪呈淺黃色至深黃色的特點，成為當地牧民餐桌上的美食，用其烹飪的“南屯牛排”，更是宴請賓客的佳肴［1］。 呼倫貝爾地區本土牛牛肉黃色脂肪現象的主要原因是放牧飼養時牛進食大量牧草， 牧草中含有豐富的類胡蘿卜素，特別是β-胡蘿卜素，這些有色物質在體內沉積，從而導致皮下脂肪著色［2-4］。 此外，肉牛體內類胡蘿卜素的沉積還受品種、屠宰季節、年齡等因素的影響［5-8］。

β-胡蘿卜素進入機體后， 以不同密度的脂蛋白作為載體，轉運到各組織器官中。 在肉牛體內，這類載體為高密度脂蛋白（HDL）。 由于具有相似的結構，β-胡蘿卜素家族與膽固醇可以共享這類載體，二者之間存在競爭關系，因此，β-胡蘿卜素代謝與體內脂代謝和與脂代謝相關的代謝過程之間存在密切聯系［9］。 在基因調控方面，已有研究證實肉牛體內β-胡蘿卜素的胞內降解主要由BCO2和BCMO1 酶控制［10-12］，調控基因BCO2 的多態性對β-胡蘿卜素代謝的影響最為顯著［13］， 此外，RDHE2 和PPAR 等基因也參與β-胡蘿卜素的代謝調控［14-15］。 這些調控基因的異常表達可導致β-胡蘿卜素代謝異常，進而導致大量β-胡蘿卜素沉積在肝臟和皮下脂肪等組織中［16-17］。

在機體內，β-胡蘿卜素除了可使脂肪組織黃染進而影響肉品質，還與抗氧化能力、免疫力和繁育性能有關［18］。另外，β-胡蘿卜素在大部分動物體內不能由自身合成，需要通過食物獲?。?9］，因此，對β-胡蘿卜素代謝調控機制的研究具有重要的科學意義。 目前，對肉牛體內β-胡蘿卜素代謝相關調控基因的研究主要圍繞安格斯牛、 利木贊牛等國外引進品種， 對我國本土肉牛品種的研究較少。 本文從β-胡蘿卜素的代謝調控機制入手，以內蒙古呼倫貝爾地區天然放牧的本土蒙古牛為研究對象，利用基因檢測方法，探究具有不同脂肪顏色的呼倫貝爾本土牛樣本中β-胡蘿卜素調控基因的SNP 差異，并結合非靶向代謝組學技術，進一步探明黃色脂肪和白色脂肪在代謝物上的差異，從而為定向調控肉牛脂肪顏色提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從內蒙古呼倫貝爾市某屠宰場隨機選取72頭本土牛（蒙古牛），每頭牛均采集皮下脂肪組織和肝臟組織樣本各0.5 g， 置于凍存管中后立即放入液氮速凍。每頭牛另取皮下脂肪組織5 g 放入冰盒內，用于脂肪顏色評分判定。

1.2 試驗方法

1.2.1 脂肪顏色評分

參照歐洲部分國家采用的5 分制主觀評定方法完成脂肪顏色評分［5］。 由3 人組成脂肪顏色評分組，按照5 分制標準對皮下脂肪顏色進行評估，1 分為非常白，5 分為非常黃。 評定過程由3 人獨立完成， 以3 人評定結果的中位數為某份樣本的脂肪顏色評分， 據此完成72 份樣本的脂肪顏色評分。

1.2.2 肝臟組織基因組DNA 提取

取出液氮冷凍保存的72 份肝臟組織，每份組織樣本用電子天平稱取30～50 mg， 使用動物組織基因組DNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量。

1.2.3 基于PARMS 技術的SNP 差異檢測

利用武漢市景肽生物科技有限公司研發的五引物擴增受阻突變體系（penta-primer amplification refractory mutation system，PARMS），完成肝臟組織樣本中β-胡蘿卜素調控基因的單核苷酸多態性（SNP）差異檢測。 以提取的肝臟組織基因組DNA為模板，利用等位基因特異熒光擴增引物，進行等位基因特異性的PCR 檢測； 利用PARMS 的酶標儀進行熒光掃描； 對72 份肝臟組織樣本的BCO2 SNPW80X、BCMO1 SNP4、RDHE2 SNP2、ALDH8A1 SNP16 和PPARCG1A SNP12 基因進行SNP 基因型檢測。 5 個基因的SNP 特異性位點和擴增引物序列分別見表1 和表2。

表1 5 個基因的SNP 位點堿基變化情況

表2 5 個擴增基因的引物序列

1.2.4 BCO2 基因多態性的PCR 及測序驗證

由于BCO2 基因的多態性對β-胡蘿卜素代謝影響最為顯著， 故利用PCR 擴增及直接測序法，對基于PARMS 技術的BCO2 基因分型結果進行驗證。 選取不同脂肪顏色評分對應個體的肝臟組織共12 份，按照“1.2.2”項下方法進行肝臟組織基因組DNA 提取。 根據NCBI 的GenBank 數據庫公布的BCO2 基因序列設計引物， 引物信息見表3。 以提取的肝臟組織基因組DNA 為模板， 采用PCR 法擴增BCO2 基因，反應體系見表4。 反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min， 循環次數30 次；72 ℃最后延伸10 min。

表3 BCO2 基因PCR 擴增引物信息

表4 BCO2 基因PCR 擴增反應體系

將擴增得到的目的片段， 送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。 對測序結果中的序列和峰圖用DNAStar 和Chromas 軟件進行分析。

1.2.5 數據統計與相關性分析

利用SPSS 20.0 統計學軟件分析基因頻率及基因型頻率，并與脂肪顏色評分進行相關性分析。

1.2.6 脂肪樣本的非靶向代謝組學分析

根據脂肪顏色評分結果，分別選取白色（1～2分）、黃色（3～5 分）脂肪樣本各6 個，每份樣本稱取50 mg，利用有機試劑沉淀蛋白法進行代謝物提取， 提取后分別在正負離子模式下進行液相色譜串聯質譜聯用儀（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS） 掃描檢測。 利用主成分分析法（principal components analysis，PCA）對代謝物進行質控分析； 應用偏最小二乘回歸分析法（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）進一步分析白色脂肪組與黃色脂肪組之間的差異趨勢；采用單變量分析差異倍數法（fold-change）和t 檢驗方法， 結合人類代謝組數據庫（Human Metabolome Database，HMDB） 和差異表達基因代謝途徑分析 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 對差異代謝物進行功能注釋，并進行代謝通路富集。利用R 語言包ggplot2 繪制差異代謝物箱式圖。

2 結果與分析

2.1 脂肪樣本顏色評分與基因型關聯分析

2.1.1 脂肪樣本顏色評分情況

72 份皮下脂肪組織樣本顏色評分分布情況如圖1 所示。由圖1 可知，呼倫貝爾地區本土牛皮下脂肪顏色以白色為主，評分在1～2 分的樣本（n=50）占到69.45%；黃色脂肪樣本（評分3 分及以上，n=22）占比30.55%。

圖1 不同脂肪樣本顏色評分分布圖

2.1.2 脂肪顏色與基因型關聯分析

本研究選取目前已在其他品種肉牛中報道的β-胡蘿卜素代謝過程相關通路中5 個關鍵基因的SNP 位點為研究對象， 開展脂肪顏色與基因型關聯分析（見表5）。 從關聯分析表（見表6）可以看出，5 個基因對脂肪顏色均無顯著（P>0.05）影響，ALDH8A1 SNP2 多態性單一，均為AA 型，因此，未進一步進行關聯分析。

表5（續） 脂肪樣本顏色評分與基因型對照表

表5 脂肪樣本顏色評分與基因型對照表

表6 脂肪顏色與基因型關聯分析表

2.2 基因多態性分析

2.2.1 基因型頻率分析

在檢測的5 個基因中，ALDH8A1 SNP2 位點只有AA 基因型；BCO2 SNPW80X 位點包括GG和AG 2 種基因型；BCMO1 SNP4 位點包括AA、AC 和CC 3 種基因型；PPARCG1A SNP12 位點包括CC、CT 和TT 3 種基因型；RDHE2 SNP2 位點包括CC 和TT 2 種基因型（見表7）。

表7 5 個基因SNP 位點不同基因型頻率

2.2.2 基因頻率分析

各基因頻率統計結果見表8。 由表8 可知，ALDH8A1 SNP2 位點上，A 等位基因為優勢基因，未檢測到其他基因的存在；BCO2 SNPW80X 位點上，G 等位基因為優勢基因；BCMO1 SNP4 位點上，A 等位基因為優勢基因；PPARCG1A SNP12 位點上，C 等位基因為優勢基因；RDHE2 SNP2 位點上，C 等位基因為優勢基因。

表8 5 個基因SNP 位點不同基因頻率

2.2.3 BCO2 基因多態性的驗證

經過PCR 擴增和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可得到特異性目的片段。為進一步驗證PARMS 技術基因分型結果， 采用直接測序法對BCO2 SNPW80X 位點進行了驗證。直接測序驗證結果與基于PARMS 技術的SNP 基因分型結果完全一致（見圖2）。

圖2 BCO2 基因直接測序峰圖

2.3 非靶向代謝組學檢測

2.3.1 建?？煽啃苑治?/p>

取等量制備好的白色脂肪和黃色脂肪組織樣本，混合制成質控樣本并進行PCA 分析，結果表明，質控樣本有很好的聚集性，說明檢測結果可信（見圖3）。

圖3 黃色脂肪和白色脂肪組織樣本主成分分析圖

從PLS-DA 分析圖（見圖4A）中可以看出，2組樣品之間均有比較明顯的分離趨勢， 與白色脂肪組相比，黃色脂肪組內的聚集度更高。 從PLSDA 置換檢驗圖中可見Q2＜0（見圖4B），說明模型不存在過擬合的情況，差異代謝物分析準確，建?？煽?。

圖4 黃色脂肪組與白色脂肪組比較的PLS-DA 分析圖

2.3.2 差異代謝物分析

對黃色脂肪組和白色脂肪組樣本（各6 個）的5 780 個正電荷代謝物和6 582 個負電荷代謝物進行組間差異分析， 結果表明， 與白色脂肪組相比，黃色脂肪組總共有235 個代謝物出現差異，其中，表達量上調的代謝物有163 個，表達量下調的代謝物有72 個（見圖5）。

圖5 黃色脂肪組與白色脂肪組比對后的差異代謝物數量

將不同物質在質譜儀中進行碎裂， 利用碎片信息生成二級譜圖， 與公共數據庫的標準品二級譜圖進行匹配，并對匹配結果評分，最終得到代謝物的二級鑒定結果。 黃色脂肪組與白色脂肪組相比，得到5 個顯著（P<0.05）差異的代謝物，其中，有1 個代謝物下調，4 個代謝物上調（見圖6）。 對這些代謝物進行注釋、分類和富集，可富集到4 個大類的7 個通路中（見表9）。

圖6 黃色脂肪組與白色脂肪組之間二級差異代謝物箱式圖

表9 黃色脂肪組與白色脂肪組比較差異代謝物富集情況

3 討論

肉牛皮下脂肪著色主要是由于體內類胡蘿卜素沉積所致，其中，β-胡蘿卜素為沉積最主要的一類， 體內有多種酶參與β-胡蘿卜素的代謝調控。BCMO1 和BCO2 基因編碼的酶可通過對稱裂解和非對稱裂解，將β-胡蘿卜素轉化為全反式視黃醛和視黃酸，視黃醛和視黃酸可以轉化為VA。 而RDHE2 基因編碼的酶能夠調節視黃醇和視黃醛的轉化， 從而調節體內β-胡蘿卜素的代謝［14］。PPAR 家族基因具有脂肪特異性，在脂肪代謝調節中起到重要作用， 可作為BCMO1 基因的轉錄因子，從而調控靶基因BCMO1 的功能活性［11，15］。

由β-胡蘿卜素沉積導致黃染的皮下脂肪組織與未發生黃染的白色脂肪組織相比， 有多種代謝物發生變化， 表明代謝物的差異也可對脂肪顏色造成影響。

3.1 調控基因SNP 差異與肉牛黃脂的關系

已有研究證明，BCMO1 和BCO2 等基因的SNP 差異，可能會導致牛體內β-胡蘿卜素的代謝差異。 Bertolini 等［20］通過對印度娟姍牛、荷斯坦牛和水牛的研究確定，發生在BCO2、BCMO1 基因部分SNP 位點的基因型差異可導致β-胡蘿卜素代謝異常，進而影響所產牛奶的顏色。徐磊等［21］以西門塔爾牛為研究對象，發現BCO2 基因BV1 位點與脂肪顏色呈顯著關聯性。 此外，在人體內，BCMO1基因R267S 和A379V 位點的SNP 差異也會導致類胡蘿卜素的代謝出現異常［22］。 PPARγ 的基因型差異對魯西黃牛、秦川牛的脂肪生長均有影響［23］。脂肪的快速沉積會稀釋體內的β-胡蘿卜素，從而影響脂肪顏色。在本研究中，β-胡蘿卜素代謝途徑中選定的基因特異位點與脂肪顏色無明顯相關性，表明肉牛體內β-胡蘿卜素的代謝調節基因受到品種差異、基因分布、人為選擇和基因漂移等多種遺傳學因素的綜合影響， 單獨進行相關調控基因SNP 差異研究和基因型頻率檢測， 并不能夠完全揭示黃脂現象的機制。

3.2 代謝物與肉牛黃脂的關系

3.2.1 cAMP 信號途徑差異與肉牛黃脂的關系

機體內cAMP 信號途徑可由G 蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor，GPCR）介導。 已有研究發現β-胡蘿卜素能夠通過調控cAMP、PMKA等G 蛋白調控的信號途徑顯著抑制細胞外信號調節激酶（ERK1/2）的增殖和磷酸化［24］。在本研究中，黃色脂肪組與白色脂肪組相比，cAMP 信號途徑中的3-羥基辛酸乙酯發生顯著下調； 在通路上，該代謝物與PPARγ 基因的表達相關，PPARγ 家族基因不僅可以刺激脂肪酸的β 氧化從而導致脂肪酸的降解，在脂肪細胞分化中起到重要作用，而且其編碼的PPARγ 蛋白還可以特異性地結合到BCMO1 基因的啟動子區域， 正向調節BCMO1 基因的轉錄，進而影響機體內β-胡蘿卜素代謝［11］。

3.2.2 不飽和脂肪酸生物合成途徑與肉牛黃脂的關系

本研究中的代謝組學分析結果表明， 黃色脂肪組與白色脂肪組相比， 不飽和脂肪酸的表達量顯著上升，此 結果與 木其爾［1］和Knight 等［25］的研究結果一致。 不飽和脂肪酸能夠促進乳糜微粒的形成，從而促進β-胡蘿卜素的轉運［26］。此外，β-胡蘿卜素的抗氧化作用也能保護機體內的不飽和脂肪酸被氧化，故筆者推測機體內β-胡蘿卜素與脂代謝中不飽和脂肪酸的調控之間存在密切聯系。研究表明，在肉雞日糧中添加β-胡蘿卜素和VK，可提高ω-3 多不飽和脂肪酸的穩定性， 如二十碳五烯酸［27］。在本研究中，黃色脂肪組與白色脂肪組相比，二十碳五烯酸表達量顯著升高，這一結果與文獻報道的結果一致。 BCMO1 基因表達量不僅與β-胡蘿卜素代謝有關， 還與機體內甘油三酯的代謝密切相關［28-29］，其表達量的下降在導致β-胡蘿卜素沉積進而形成黃脂的同時， 也會造成甘油三酯的堆積，故BCMO1 基因與脂肪形成存在密切關系，相關機制需要進一步探明。

3.2.3 初級膽汁酸合成和膽汁分泌途徑與肉牛黃脂的關系

膽汁分泌和膽汁酸合成在脂肪代謝和β-胡蘿卜素吸收過程中起到重要作用［30］。在機體內，膽汁可使脂肪和β-胡蘿卜素在十二指腸中一起乳化形成乳糜微粒， 這些乳糜微粒由不同類型的脂蛋白運輸。 在牛體內，高達80%的β-胡蘿卜素由HDL 運輸， 且由于與膽固醇具有相似的類異戊二烯結構，二者可以通過同類受體完成轉運［9］。 脂肪酸還參與膽固醇的調節， 而膽固醇在機體內轉運時， 可能存在與β-胡蘿卜素競爭HDL 載體的機制［31］。 在機體內，VA 和膽汁酸之間存在穩態，VA可促進膽汁酸的合成［32］，BCMO1 和PPAR 基因可分別通過調節VA 和膽汁酸的合成維持穩態的平衡［33］。在本研究中，黃色脂肪組與白色脂肪組相比，位于初級膽汁酸生物合成和膽汁分泌途徑上的代謝物甘氨膽酸均出現顯著高表達， 高濃度的甘氨膽酸可正向調節膽汁酸受體 （FXR） 的表達，而FXR 可抑制維甲酸受體 （RXR） 的表達［34］，與PPARγ 類似，RXR 也可特異性地結合到BCMO1 基因的啟動子區域，正向調節BCMO1 基因的轉錄［11］。

3.2.4 甘油磷脂和膽堿代謝差異與黃脂的關系

在機體內，細胞膜的主要成分為磷脂，不飽和脂肪酸可作為骨架， 對細胞膜的雙層結構起到支撐作用。 β-胡蘿卜素的抗氧化特性在使不飽和脂肪酸受到保護的同時， 還可以參與磷脂雙層膜的保護［35］，對膜的流動性和穩定性起到維護作用［36］。在本研究中，黃色脂肪組與白色脂肪組相比，在甘油磷脂和膽堿代謝途徑出現差異， 差異物磷脂酰膽堿為磷酸甘油酯的一種。已有研究證實，增加磷酸甘油酯的供給，可使細胞膜形態改變，機體內的β-胡蘿卜素更容易被轉運至細胞內， 進而導致細胞內β-胡蘿卜素含量增加［37］。

4 結論

呼倫貝爾地區本土牛牛肉黃色脂肪組織樣本與白色脂肪組織樣本相比， 有多個代謝物存在差異，涉及的信號通路與脂肪形成、體內β-胡蘿卜素轉運和β-胡蘿卜素跨膜運輸之間存在密切關系，且與BCO2、BCMO1、PPARCG1A 等β-胡蘿卜素代謝相關基因直接或間接相關。 后續可對相關分子調控機制開展進一步研究，可為含β-胡蘿卜素飼料的制備和定向調節肉牛脂肪顏色提供理論基礎。