基于動脈粥樣硬化家兔模型研究痹病藥膳方代謝組學與配方優化

楊彩艷,方曉燕,盧國康,黎飚,黃永毅,李小婷,莫楓川,農成威,李保生,王金花,

(1. 廣西壯族自治區中藥體內藥物化學數據庫建設與應用工程研究中心,廣西 百色 533000;2. 廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室,廣西 百色 533000;3. 廣西高校生態鋁工業基地環境與人群健康研究重點實驗室,廣西 百色 533000;4. 桂林醫學院,廣西 桂林 541001)

心腦血管疾病(cardiovascular and cerebrovascular diseases,CCD)主要病理基礎是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS),全球僅由冠狀動脈疾病(coronary artery disease,CAD)導致的致死率約為31%[1-2]。在中醫病名中沒有發現AS 病名,但其癥狀和中風、胸痹、眩暈等相似,屬于中醫痹病的范疇。痹病的病因病機主要因火旺、血虛、痰濁、氣滯、陰虛等導致,常采用清熱解毒、活血化瘀、益氣養血等治療。

痹病藥膳方由雞血藤(Spatholobus suberectus Dunn)、土茯苓(Smilax glabra Roxb)和豬腿骨組成,在壯族地區被廣泛用于防治癱瘓[3]。雞血藤為豆科密花豆屬密花豆的根、莖,因其具有養血活血、通經活絡等功效而在中醫臨床中被用于治療貧血病、月經病和動脈粥樣硬化性心腦血管疾病等,現代藥理學研究結果表明雞血藤乙醇提取物具有抗炎、神經保護、降血脂、改善血液流變學、補血和抗癌等藥效[4-8]。土茯苓屬于百合科菝葜屬土茯苓的根,具有解毒、除濕、通利關節藥效,常用于治療梅毒、重金屬中毒、肌張力增高、腎炎、心血管疾病、糖尿病血管并發癥等,現代藥理學研究表明它具有抗炎、抗氧化和抗心衰等藥效[9-12]。豬腿骨是一種食物并可用于提供營養從而增強人體的免疫力即中醫理論中的“補氣”。中藥黃芪(Astragalus membranaceus Fisch)為豆科黃芪屬植物膜莢黃芪的根,因其具有藥效好、價格低在被廣泛用于增強人體免疫力,現代藥理學研究表明黃芪具有提高心功能、促進血管生成、調節血糖、抗癌、增強免疫調節活性等藥效,其主要的藥效成分為黃酮類、三萜皂苷類和多糖[13-17]。

痹病藥膳方在壯族地區被用于防治類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化(AS)、痛風等痹病,但尚無其藥效、作用機制、組方優化、配伍規律等研究的報道。本文比較研究各配方家兔血清代謝組學,比較研究最優配方血清、心和肝的代謝組學,優化其配方和研究其代謝機制,為深入研發痹病藥膳方提供科學實驗基礎。

1 材料和方法

1.1試劑和動物 膽固醇(No.531F102,Solarbio),總膽固醇(TC)(No.201012;maccera biology Co.Lt-d.),低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)(No.200928;maccera biology Co.Ltd.),甘油三酯(TG)(No.201020;maccera biology Co.Ltd.),高密度脂蛋白(HDL-C)(No.200928;maccera biology Co.Ltd.),超氧化物歧化酶(SOD)(No.20010910228;Meikang biotechnology Co.Ltd),烏拉坦(氨基甲酸乙酯,HY1223-500g,上海恒遠生物科技有限公司),家兔(No.0008757,雌雄各半,4.5個月齡,體重2.00～2.50 kg,廣西田東兔業有限責任公司)。

1.2痹病藥膳方的制備 痹病藥膳方組成為25 g雞血藤、25 g 土茯苓和500 g豬腿骨[3]。配方1為75 g雞血藤,配方2為37.5 g雞血藤和37.5 g土茯苓,配方3為34.5 g雞血藤、34.5 g土茯苓和6 g黃芪;根據人-動物藥物劑量換算表將其換算成家兔的劑量都是3.5 g/(kg·d),血脂康的劑量是 0.36 g/(kg·d)[18]。藥材于2020年9月15日購自百色市正陽藥店,樣本(No.20200915) 存放于廣西壯族自治區中藥體內藥物化學數據庫建設與應用工程研究中心。血脂康膠囊(No.20201201)作為陽性藥物,購自北京北大維信生物科技有限公司。分別依次使用乙醇-水(90∶10、50∶50和5∶95,每種溶劑提取3次,每次提取72 h) 在室溫下浸提8 kg配方1、配方2和配方3的藥材,提取液減壓濃縮至 2 L。

1.3樣本采集和藥效評價 高脂飼料自制,成分為膽固醇-豬油-蛋黃粉-基礎飼料(1∶8∶4∶87)[18]。48只家兔單籠飼養,適應1周后隨機分為正常組(CG)、模型組(MG)、血脂康組(PG)、配方1組(SG)、配方2組(DG)和配方3組(AG),每組都是雌雄各半。 實驗60 d,每周稱1次體重,正常組給予基礎飼料,其他組給予高脂飼料;此外,血脂康組、配方1組、配方2組和配方3組 分別口服給予血脂康、配方1～3,給藥60 d。

實驗結束后所有家兔禁食不禁水12 h,采集耳緣靜脈血液,檢測血漿 TC、LDL-C、TG、HDL-C和SOD含量(7600-020 全自動生化分析儀,Hitachi) 及測試血液流變學(SA9000 全自動錐板式血液流變分析儀)。所有家兔耳緣靜脈注射烏拉坦-水(25∶100,m/v;4 mL/kg) ,然后從頸靜脈收集血清、心和肝,用于代謝組學研究,采集主動脈弓樣本,用Motic BA210數碼生物顯微鏡和Motic BA600虛擬掃描切片系統分析病理切片分析。

1.4代謝組學分析 80 mg 心和肝樣本依次加入 200 μL H2O,勻漿、渦旋60 s,加入800 μL甲醇-乙腈(1∶1,v/v)、渦旋60 s和低溫超聲30 min 2次。 400 μL甲醇-乙腈(1∶1,v/v) 加入到100 μL心和肝的樣品及血清中,所有樣品渦旋60 s,并在-20 ℃放置1 h沉淀蛋白質,然后在14 000 r/min離心10 min,上清液使用0.22 μm濾膜過濾,并使用 UPLC-Q-TOF-MS(Agilent 1290 超高效液相色譜、Agilent,AB Triple TOF 6600 質量分析器、AB SCIEX)分析,Q-TOF-MS 配置電噴霧(ESI) ,UPLC 配置色譜柱(填料:Waters、ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm,柱規格2.1 mm×100 mm;填料:Waters、ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm,柱規格2.1 mm×100 mm)。色譜條件和質譜參數設置同參考文獻[18]。代謝組學研究由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

2 結果

2.1痹病藥膳方在AS家兔模型中的作用 實驗期間所有家兔的體重都是穩定增加的,不同組間體重差異不明顯。其它各組的 SOD值都比正常組低,30 d時差異無統計學意義,60 d時差異有統計學意義,其它各組間的差異無統計學意義,見表1。這表明因高脂誘導的氧化應激在30 d內不明顯,當實驗持續到60 d時導致家兔產生氧化應激障礙,配方1～3均沒有表現出明顯的抗氧化活性。

表1 家兔血液流變學和SOD數據 (n=8)

血清脂質數據結果,見表2。與正常組TG、TC、LDL-C和HDL-C相比,模型組值大且差異有統計學意義(P<0.01);血脂康組、配方1組、配方2組和配方3組的值高于正常組但低于模型組,與模型組之間的統計學差異顯著; 在血脂康組、配方1組、 配方2組和配方3組中,除HDL-C值外,其它血脂值從高到低的順序是 配方1組、配方2組、配方3組和血脂康組;配方3組血漿的 HDL-C 值要高于配方1組和配方2組但其它值卻比它們更低。這些結果表明家兔高脂飲食能導致高血脂疾病,血脂康、配方1～配方3均表現一定程度的預防藥效,藥效由強到弱的順序是:血脂康→配方3→配方2→配方1,使用少量黃芪代替同質量的雞血藤和土茯苓能增強抗AS免疫能力,黃芪在配方3中扮演佐藥和使藥的角色。

表2 主動脈弓和血脂數據 (n=8)

血液流變學的數據見表1。和正常組相比,除血漿黏度和全血高切指數外,模型組各項值升高且差異有統計學意義。大部分配方2組和配方3組的值都高于正常組,但低于模型組的值,配方2組和模型組相比,只有全血高切指數、60 d時全血黏度、30 d時血漿黏度和60 d時全血低切指數的統計學差異無統計學意義。配方3組與配方2組之間,只有全血黏度、60 d時血漿黏度、30 d時全血高切指數差異有統計學意義,且配方3組的高于配方2組的。以上結果表明家兔高脂飲食可以誘導高黏血癥,配方2和配方3都具有預防藥效,配方2藥效略優于配方3。

主動脈弓病理形態研究的結果見圖1,內膜厚度值、內膜、中膜厚度比值及粥樣斑塊面積結果見表2。正常組內膜的內皮細胞相對完整和排列整齊,內部彈力膜清晰;中膜平滑肌中細胞的排列和體積都是正常的,從內膜到中膜都沒有發現泡沫細胞和脂質沉積。和正常組相比,模型組內膜內皮細胞出現腫脹和變性,聚集有很多泡沫細胞,一些內彈力膜斷裂;平滑肌受損和排列渾濁,從內膜到中膜都發現脂質在細胞外沉積。血脂康組、配方1組、配方2組和配方3組發生了和模型組相似的病變但程度比模型組輕,其病變程度由重到輕的順序是配方1組、配方2組和配方3組、血脂康組且與內膜厚度值、內膜、中膜厚度比值及粥樣斑塊面積一致。這些結果表明血脂康的藥效最強,配方1的藥效最弱,配方2藥效弱于配方3。綜合抗氧化、降血脂、改善血液流變學和病理形態結果,配方3是抗AS的最優配方。

注:CG為正常組,MG為模型組,PG為血脂康組,SG為配方1組,DG為配方2組,AG為配方3組。圖1 主動脈弓病理形態研究結果 (10×)

2.2代謝組學

2.2.1模型可靠性和穩定性研究 為了闡明痹病藥膳方不同配方代謝輪廓差異,比較研究了各配方干預AS家兔血清代謝組學;為了更全面闡述痹病藥膳方代謝輪廓,比較研究了配方3干預AS家兔血清、心和肝代謝組學。質控(QC) 樣品UPLC-Q-TOF-MS總離子流圖保留時間的重疊性和色譜峰的響應強度都很好,表明整個實驗過程中儀器誤差引起的變化較小。使用XCMS軟件在正/負離子模式下分別從血清、心和肝中提取到的離子峰數目分別是11489/8516、16286/11321和16147/11150,正離子峰的數目均高于負離子峰,表明研究所有器官組織中正離子模式優于負離子模式。

使用UPLC-Q-TOF-MS數據建立主成分分析(PCA)模型識別正常組、模型組、配方1組、配方2組和配方3組 之間的總體差異(見圖2、圖3、表3)。所有 QC正負離子模式下的離子峰都緊密聚集,表明實驗具有良好的重復性。得分圖表明除了負離子模式下血清中的模型組和正常組、配方2組和模型組外,其它不同組間能很好的聚類。這個結果表明心、肝及正離子模式下血清中鑒別的代謝差異物都是可行的。此外,使用偏最小二乘判別分析(PLS-DA) 和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)識別不同組間的代謝差異物(見圖4～圖6,表3)。除心在正離子模式下其配方3組和模型組的值為0.473 cum外,其它的都大于0.50 cum;表明代謝模型穩定可靠,心在正離子模式下其配方3組和模型組之間模型的穩定性也較好。

注:左圖和右圖分別在正負離子模式下測試,兩種模式下R2X值分別是0.544和0.555;CT、MD、EJ、EY和EHY分別代表正常組、模型組、配方1組、配方2組和配方3組。圖2 血清質量控制樣本(QC)的主成分分析(PCA)得分圖

注:上下圖分別為正負離子模式。CG為正常組,MG為模型組。圖4 血清中模型組(藍色)和正常組(綠色)比較PCA(左圖)、PLS-DA(中間)和OPLS-DA(右邊)得分圖

注:上下圖分別為正負離子模式。CG為正常組,MG為模型組。圖6 肝中模型組(藍色)和正常組(綠色)比較PCA(左圖)、PLS-DA(中間)和OPLS-DA(右邊) 得分圖

表3 多元統計分析R2X、R2Y和Q2值

2.2.2代謝差異物研究 正常組和模型組之間的差異代謝物(variable metabolites,VM,P<0.05)被定義為疾病代謝差異物(diseases metabolite,DM);既是疾病代謝差異物也是模型組和藥物組間的代謝差異物,且配方對模型組的調控方向和模型組與正常組的相反,被定義為藥效代謝差異物(pharmacodynamic metabolite,PM)。血清、心和肝中識別的DM如表4和圖7所示;從血清、心和肝中鑒定的PM見表5、表6和圖8。

注:圓角矩形結點的為器官或組織,橢圓形結點為靶點;藍色結點為所有藥物在所有組織或器官中沒有實現回調;橙色邊線的為下調,無色邊線的為上調,紫色邊線的為不同器官組織中調節方向不一樣。圖7 藥效代謝差異物-器官/組織-藥物相關關系網絡

注:圓角矩形結點的為器官或組織,橢圓形結點為藥效代謝差異物(PM);桃紅色結點為三種藥物共有的PM(除7不是變方1的),橙色結點為只是變方2的PM(除45也是雞血藤的),綠色結點為變方2在部分器官或組織中的PM。深紅色結點有銀色邊線的為雞血藤與痹病藥膳方變方1共有的PM,深紅色節點有綠色邊線的為雞血藤與痹病藥膳方變方2共有的PM。桃紅色結點中,綠色邊線的在心中不是PM,黃色邊線的在肝中不是PM,紫色邊線的只在血清中為PM,銀色邊線的為對應器官中的PM;橙色結點中,綠色邊線的只在肝中為PM,紫色邊線的在血清和肝中是PM,銀色邊線在對應器官中均為PM;綠色結點中,紅色邊線的在心中不是PM,桃紅色邊線的只在心中是PM,紫色邊線的在血清中不是PM,銀色邊線的在肝中不是PM;深紅色結點中,綠色邊線的為雞血藤與變方2共有的PM,銀色邊線的為雞血藤與變方1共有的PM。圖8 藥效代謝差異物-器官/組織-藥物相關關系網絡

表4 VM名稱及序號

表5 配方1和配方2在血清中PM結果

表6 配方3在不同組織器官中PM結果

從血清中鑒定出39個DM,分別鑒定出29、26和33個配方1、2和3的PM。 在血清中,當一半雞血藤被同樣質量的土茯苓代替時即為配方1變為配方2時,3個PM(VM 7、19、和45)消失;一些PM倍數變化(fold changes,FC)值如肌苷(VM 29,配方1組/模型組=16.39554381,配方2組/模型組=1.163027468)、三乙醇胺(30,配方1組/模型組=12.68455178,配方2組/模型組=7.942100461)和5-羥-β-吲哚乙醇(34,配方1組/模型組=1.677599136,配方2組/模型組=2.781925834)等存在明顯差異,說明配方1和2的回調程度即藥效程度明顯不同。血清中,當配方2變成配方3時,2個PM(VM 23和40)消失,還識別出11個PM(VM 7、9、17、18、19、31、42、44 、45、47和48,同時發現PM(VM 12,2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇;VM 29,肌苷)FC值也發生改變。血清中,配方3有8個特有的PM;配方1和3有26個共同的PM,配方1和3有24個共同的PM,3個藥物有24個共有的PM(圖5、表5和表6)。這些結果表明方劑配方發生變化尤其是配方2變成配方3時,血清中發揮藥效的代謝差異物發生了明顯變化,表明代謝機制也發生了明顯的變化。

從心和肝中分別鑒定出56和97個DM,33和41個配方3的PM。從血清、心和肝中都鑒定到6個 DM(VM 3、5、14、29、41和48);其中VM 29為血清、心和肝中共有的PM,VM 48只在心中為PM,VM 5為肝和血清中共有的PM,VM 41只為血清中的PM,VM 3和14為心和血清中共有DM。從心和肝中鑒定到16個有的DM(VM 49、54、56、57、59、63、65、66、74、75、78、79、83、89、91和95);VM 54、57、65和66只在肝中為PM,VM 49和91只在心中為PM,VM 74、75、78和79在心和肝中都是PM。從心和血清中鑒定到共有DM 10個(VM 1、7、9、15、18、27、31、32、35和47),VM 15、18和32只在血清中為PM,VM 47只在心中為PM,VM 1、7、9、27、31和35在心和血清中都是PM。從肝和血清中鑒定到共有DM 11個(VM 2、8、11、16、17、25、26、28、38、44和45),VM 16、26和44只在血清中為PM,VM 17只在肝中為PM,VM 2、11、25、38和45在肝和血清中都是PM。血清、心和肝中分別鑒定到18、31和71個特有的DM,其中分別有12、15和24個為PM。以上結果表明不同器官、組織中DM及其配方3在不同組織器官中PM存在巨大差異,即使是從不同組織或器官中都鑒定到的許多DM如VM 3、29、57和58等被調節的方向也不一致(見表6灰色背景),表明疾病的病理機制、藥物在不同組織、器官中代謝機制存在巨大區別。

2.2.3代謝通路研究 應用MetaboAnalyst 5.0進行代謝通路分析和通路富集分析闡明關鍵代謝通路(見表4、圖6和圖7)。結果表明血清中組氨酸(histidine)、糖鞘脂(glycosphingolipid)和精氨酸(arginine)代謝通路對3個配方都是極為重要的代謝通路;丙氨酸、天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽代謝(alanine,aspartate and glutamate metabolism),精氨酸和脯氨酸代謝(arginine and proline metabolism),精氨酸生物合成(arginine biosynthesis)以及組氨酸代謝(histidine metabolism)是配方3在心中發揮藥效的重要代謝通路;精氨酸生物合成,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸鹽代謝(D-glutamine and D-glutamate metabolism),谷胱甘肽代謝(glutathione metabolism)以及丙氨酸、天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽代謝是配方3在肝中發揮藥效的重要代謝通路。以上結果表明3個配方在血清中發揮藥效所涉及的代謝通路差異不大,配方3在不同組織器官中代謝通路差異比較大。

圖9 雞血藤、痹病藥膳方變方1和痹病藥膳方變方2在血清中的代謝通路

圖10 痹病藥膳方變方2在心(左圖)和肝(右圖)中的代謝通路

3 討論

LDL-C是導致AS的關鍵因素,降低其水平是降低AS發生和大多數心血管疾病死亡因素的重要途徑;LDL-C與HDL-C的比值代表致動脈粥樣化蛋白和保護性脂蛋白平衡關系,是用來預測心血管疾病發生的重要指標[19-21]。正常組、模型組、血脂康組、配方1組、配方2組和配方3組的LDL-C與HDL-C比值在30 d時分別為 0.61、1.44、1.03、1.57、1.24和1.00,60 d時分別是0.86、1.63、1.07、1.71、1.37和1.24;除配方1組外,這些結果基本與主動脈弓病理研究結果一致。這表明3個配方都能有效預防心血管疾病發生,配方3要優于配方2。

在3個配方血清代謝組學研究中,配方1和2的PM差異不大,配方3與二者的PM差異比較大。表明在配方3中,黃芪的量雖然小,但所起的藥效卻是非常重要的。此外,在優化痹病藥膳方配方優化過程中一些PM消失,一些PM即使還在,但其FC值也發生了變化;表明當方劑的配方發生變化時其代謝輪廓也發生重要變化,合理組成讓痹病藥膳方產生了更多的選擇性和專一性。

血液中代謝物的含量通常受多個蛋白支配,換而言之,當某個蛋白質表達出現異常時,其它組織或器官中的蛋白質會自動彌補其功能;因此,其它器官尤其是病理改變器官的代謝組學更值得進行研究。與血清代謝組學相比,從心和肝中鑒別了更多的PM,因此心和肝的病理形態差異以及蛋白質和基因表達差異值得深入研究。一些VM在不同組織器官中差異很大甚至方向相反,這與成分在體內代謝相關,因此其代謝規律值得深入研究。

本研究雖然通過不同配方對AS家兔預防藥效來優化方劑配方,但配方有限。本研究雖然比較了3個配方在血清中PM和代謝通路差異,配方3在心和肝中PM和代謝通路差異,但這些藥效代謝差異物之間哪些是關鍵的以及相互如何相互影響并不清楚。因此痹病藥膳方配方優化和作用機制仍需深入研究。