橘皮精油/殼聚糖復合涂膜的制備及其對鮮切蘋果保鮮性能的研究

閆文婧，張安怡，譚樹良，何 其，何志妮

（南方醫科大學 公共衛生學院，廣州 510515）

0 引言

功能性生物高分子聚合物作為石油化工塑料的替代材料［1］，引起越來越多的關注。在不同的生物聚合物中，殼聚糖（CH）是甲殼素脫乙?；蟮玫降囊环N無毒、生物可降解的多糖，具有成膜性和抗菌性，被廣泛應用于食品保鮮涂層［2］。然而，由于分子間的強氫鍵作用，高分子質量的CH不溶于水，在一定程度上限制其廣泛應用。同時，大量研究需要涂層擁有更顯著的抗菌和抗氧化性能，就要求對CH 進行改性，提高其溶解度，同時改善其綜合性能。

殼聚糖具有陽離子特性［3］。一些易產生陰離子的酸性成分，可以作為CH 的添加物，改善其性能。一些具有弱酸性、抗菌和抗氧化活性的植物提取物，被廣泛應用于CH 復合材料的開發中，顯示出廣闊的應用前景［4］。

橘皮精油（TPEOs）是柑橘類水果的重要提取物，主要成分是檸檬烯，具有解熱、鎮痛、抗病毒、抑菌和抗氧化等多種生理功能［5］，受到廣泛關注［6］。

本文分別從3種不同種類的柑橘：椪柑（Citrus reticulata，CR）、苦橙（Citrus bigarradia，CB）和甜橙（Citrus sinensis，CS）中提取精油，作為CH 材料的功能性添加物，用于鮮切蘋果的保鮮。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

柑橘［CR，CB 和CS，重量（146±27）g］和蘋果［重量（239±33）g］購自當地市場，果實色澤飽滿，無明顯缺陷和腐爛；殼聚糖（脫乙酰度為75%～85%，CAS 9012-76-4），美國生命科學與高科技集團公司；所有其他試劑，中國生工生物技術有限公司。所有化學品都是分析級。

1.2 主要儀器設備

Clevenger 型蒸餾儀（北京科思佳有限公司）；6890-5975 型GC-MS 聯用儀（美國安捷倫科技公司）；Vector 33 型傅里葉紅外分析儀（德國布魯克公司）；Nova Nano 3700 型掃描電子顯微鏡（美國FEI 公司）；CR-300 型色度計（美國柯尼卡美能達公司）；293-230-30 型手持式數字千分尺（日本三豐公司）；UV-1800 型分光光度計（日本島津公司）；Brookfield-CT3 型質構分析儀（美國布魯克菲爾德公司）。

1.3 方法

1.3.1 TPEOs 提取和成分分析

柑橘橘皮在50 ℃的對流爐中干燥48 h，切碎，用蒸餾儀進行水蒸氣提取6 h，收集TPEOs。在硫酸氫鈉上干燥24 h，過濾，并于4 ℃儲存在棕色密封玻璃瓶中，直到測試。

采用QI 等［7］的方法，用聯用儀對TPEOs 的主要成分進行定量分析，系統采用HP-5 MS 熔融石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm 膜厚）。TPEOs 的主要成分使用Kovats 指數進行鑒定。

1.3.2 CH-TPEOs 薄膜的制備和微觀結構分析

參考NOSHIRVANI 等［8］的研究，取1 g CH完全溶解在100 mL 體積分數為1%的乙酸水溶液中，在60 ℃攪拌4 h。將混合溶液分成4 組，其中3 組分別加入3 種不同的TPEOs，在60 ℃攪拌3 h；隨后超聲波處理（200 W，40 kHz）30 min。將得到的溶液涂布在無機玻璃板上（36 cm×24 cm），在60 ℃干燥12 h，制備薄膜，4 種制得的薄膜分別記為CH-O，CH-CR，CH-CB 和CH-CS。

用液氮對所制備的薄膜進行低溫斷裂處理并噴金。使用掃描電子顯微鏡觀察薄膜的表面和截面微觀結構。

使用色度計測定薄膜的顏色參數。結果以L*（亮度）、a*（紅、綠）和b*（黃、藍）表示。

1.3.3 薄膜的抗氧化和抗菌活性

使用HE 等［9］的方法，通過2，2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH）和2，2-疊氮基（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）酸自由基（ABTS+）的清除能力測定CH-TPEOs 的抗氧化活性。將DPPH（0.1 mmol/L）溶解在甲醇中制備DPPH 溶液。將等體積的ABTS（2 mmol/L）和高硫酸鉀（2.45 mmol/L）混合制備ABTS+溶液。將0.2 g CH-TPEOs 均質于3.0 mL 甲醇中，離心作用取上清液，根據其在分光光度計517，734 nm 處吸光度計算抗氧化性。

使用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌，測定CH-TPEOs 膜的體外抗菌活性。制備每種測試微生物懸浮液（～100 CFU/mL），并在MH 固體培養基板上擴散。將CH-TPEOs 膜的圓盤（6 mm）放置在接種板上，在37 ℃培養24 h。

1.3.4 CH-TPEOs 涂層在鮮切蘋果表面的形成

蘋果去皮、去核，切成邊長約2 cm 的方塊，浸泡在200 mg/kg 的次氯酸鈉溶液中消毒2 min，后用蒸餾水清洗氯殘留。蘋果樣本分成5 組，其中，對照組在儲藏前不作涂膜處理。CH-O，CH-CR，CH-CB 和CH-CS 組分別用相應的CH 材料涂膜（約60 μm 厚度）。所有處理后的蘋果在（1±0.3）℃儲存16 d，每隔4 d 取樣評估蘋果的貯藏品質。

1.3.5 貯藏蘋果的感官特性

蘋果的感官評價由實驗室10 名訓練有素的工作人員（5 女5 男，年齡20～50 歲）完成。樣品隨機抽取，用5 分制（0 分代表拒絕，5 分代表非常新鮮）對蘋果的顏色、氣味、質地、味道和一般可接受度進行評分。

蘋果的硬度由配備有6 mm 圓柱形探針和Brookfield 分析軟件的質構分析儀測試。采用5 mm/s 的測試速度，5 g 的觸發載荷和2 次5 mm的壓縮，間隔時間為5 s。

蘋果的表面顏色根據上文中描述的方法進行測量。

1.3.6 貯藏蘋果的微生物分析

在整個儲藏過程中，蘋果的菌落總數（TBC）和厭氧菌落總數（TAC）采用HE 等［10］的方法進行測定。樣本提取物分別在含有10 g/L 氯化鈉的鐵瓊脂平板和平板計數瓊脂板上15 ℃培養3 d后，測定TBC 和TAC。

1.3.7 鮮切蘋果在儲藏期間的化學分析

根據ZHANG 等［11］的方法，對貯藏蘋果中的花青素含量進行測定。樣品用乙醇和質量分數為15%的鹽酸進行提取。用分光光度計在535 nm處測量的吸光度計算結果。

用IBRAHIM 等［12］的方法，測定貯藏蘋果中的葉綠素α，β和類胡蘿卜素的含量。樣品用丙酮處理。葉綠素α，β和類胡蘿卜素的含量分別用分光光度計上440，644，662 nm 的吸光度值計算。

1.4 統計分析

每個試驗使用不同的樣本至少重復3 次。數據以平均值±標準差（SD）表示。采用SPSS 17.0進行多重比較，采用Duncan 檢驗和單因素方差分析（ANOVA）。如果p＜0.05，則認為差異有統計學意義。

2 結果和討論

2.1 TPEOs 中的成分分析

水蒸餾后得到3 種TPEOs，分別標識為CR-T，CB-T，CS-T。如表1 所示，精油中主要鑒定成分分別占總成分的92.02%，96.82%，95.02%，其中檸檬烯和γ-松油烯占總成分80%以上。

表1 TPEOs 中的主要效應組成Tab.1 Composition of main effects in the TPEOs

2.2 制備薄膜的微觀結構分析

CH-O，CH-CR，CH-CB，CH-CS 的膜厚分別為（69±8），（71±5），（67±3），（70±7）μm，說明精油的添加沒有顯著影響薄膜的厚度［26］。同時，如圖1 所示，不同膜之間沒有顯著的外觀差異。

圖1 CH-O，CH-CR，CH-CB，CH-CS 膜表面輪廓的SEM 圖Fig.1 SEM images of the surface contours of CH-O，CH-CR，CH-CB and CH-CS films

2.3 制備膜的抗氧化和抗菌活性

DPPH 和ABTS+都是評估樣品抗氧化活性的常用方法［27］，雖然基于相同原理，但結果通常有差異，其原因可歸因于側鏈中雙鍵通過共振穩定了DPPH 自由基的立體結構。

表2 揭示不同CH 膜的抗氧化活性。含有CS 精油的CH 膜具有更高的抗氧化性。這可能是由于CS 精油中萜類和烯類化合物含有雙鍵，可通過加成-OH 形成二級基團，由此清除體系中的大部分-OH，從而達到抗氧化的目的。

表2 CH-O，CH-CR，CH-CB，CH-CS 膜的抗氧化和抗菌活性Tab.2 Antioxidant activity and antibacterial activity of CH-O，CH-CR，CH-CB and CH-CS films

TPEOs 的另一個值得注意的活性是抗菌能力。表2 同時顯示對不同微生物種類的抑菌能力。在薄膜中加入TPEOs 后，其抗菌能力顯著增加（p＜0.05），CH-CR 膜對不同微生物均具有最強的抗菌能力。這可能是由于CR-T 中的某些成分可以作用于微生物外膜上的蛋白質顆粒，抑制其功能，特別是葡萄糖等小親水分子的被動轉運功能，從而實現抗菌的目的。

2.4 CH-TPEOs 涂層的鮮切蘋果的感官特性

感官特性可以簡單而有效地評估保鮮食品材料的總體新鮮度。在貯藏開始時，蘋果新鮮，顏色淺，組織牢固，氣味清新。儲藏過程中，蘋果逐漸腐敗，外觀變暗，質地變軟，氣味變淡。如圖3所示，所有樣品的初始感官評分都接近5 分。經過12 d的貯藏，對照組的各種感官評分降低至2 分左右，而CH-O 涂層樣品的數值保持在3 分左右。CHTPEOs 涂層樣品仍然在4 分左右，表明CH-TPEOs涂層可以明顯延緩蘋果樣品感官品質下降。

圖3 CH-TPEOs 涂層保存的鮮切蘋果樣品的感官評價Fig.3 Sensory evaluation of fresh-cut apple samples preserved with CH-TPEOs coating

圖4 顯示蘋果樣品的硬度變化。在整個貯藏期間，對照樣品的硬度從15.5 g 下降到8.5 g，而涂有CH-TPEOs 的樣品仍然保持在13～14 g。氣候性水果收獲后軟化主要可歸因于細胞壁的酶水解［28］，CH-TPEOs 涂層提供了一個弱酸性環境，可能會降低酶水解的活性。

圖4 CH-TPEOs 涂層保存的鮮切蘋果樣品的硬度Fig.4 Hardness of fresh-cut apple samples preserved with CH-TPEOs coating

褐變是影響鮮切蘋果銷售的主要外部質量問題［29］。在貯藏期間，對照組出現明顯的褐變，而涂膜組沒有觀察到明顯的變化。如圖5 所示，在整個貯藏過程中，所有樣品的a*和b*值都呈現持續上升的趨勢，而L*值的變化趨勢持續下降，這些變化在涂膜樣本中得到明顯抑制。

圖5 CH-TPEOs 涂層保存的鮮切蘋果樣品的表面顏色Fig.5 Surface color of fresh-cut apple samples preserved by CH-TPEOs coating

2.5 CH-TPEOs 涂層的鮮切蘋果的微生物特性和化學特性

圖6 顯示貯藏過程中蘋果的TBC 和TAC 持續增加的趨勢。

圖6 CH-TPEOs 涂層保存的鮮切蘋果樣品的微生物計數Fig.6 Microbial counts of fresh-cut apple samples preserved by CH-TPEOs coating

涂層減少了樣品中的微生物數量。最初各組樣品的TBC 和TAC 分別為2.9，2.1 log CFU/g。在整個貯藏過程中，對照組樣品的TBC 和TAC 分別增加到7.6，5.4 log CFU/g，而CH-O 樣品的相應數值分別增加到6.2，4.3 log CFU/g。同時，CHTPEOs 涂層組的TBC 仍保持在4.2～4.5 log CFU/g，TAC 仍保持在2.9～3.3 log CFU/g。TPEOs 對CH涂膜抗菌性增強的機制可以用Lewis 酸堿理論來描述。TPEOs 包括萜類化合物和多分子烯烴，因此TPEOs 在水中的溶解可以產生大量的H+作為電子受體，可以導致CH 中的正電荷密度增加，增強聚陽離子對帶負電的菌體細胞膜的破壞，提高抗菌活性。

貯藏過程中，蘋果化學性質的變化如圖7所示。

圖7 CH-TPEOs 涂層保存的鮮切蘋果樣品的化學性質Fig.7 Chemical properties of fresh-cut apple samples preserved by CH-TPEOs coating

如圖7（a）所示，初始花青素為199 mg/kg。在貯藏過程中，所有樣品中的花青素呈現先增加后下降的趨勢，是由于細胞破裂后，細胞中的花青素釋放出來，然后逐漸分解。這一過程在一定程度上被TPEOs 所抑制。

如圖7（b）所示，所有樣品中的類胡蘿卜素初始含量為4.7 mg/g，在儲存期間含量呈下降趨勢。涂有CH-TPEOs 的蘋果與對照組相比，下降幅度明顯降低，是由于TPEOs 涂層可以抑制儲藏期間胡蘿卜素的分解。

圖7（c）（d）揭示了樣品中葉綠素α，β的上升趨勢。對照組的葉綠素α（1.6～4.0 mg/g）和葉綠素β（3.0～13.7 mg/g）最高，CH-O 樣品緊隨其后，其葉綠素α在儲藏期間增加到3.4 mg/g，葉綠素β增加到10.8 mg/g。CH-TPEOs 樣品的葉綠素含量最低，葉綠素α，β分別增加到2.7，7.9 mg/g。

3 結語

通過橘皮精油改善殼聚糖的性能，用于保鮮鮮切蘋果。結果顯示，TPEOs 的引入沒有使殼聚糖薄膜的微觀圖像發生明顯的變化，但明顯改變了膜的顏色參數，同時顯著提升了膜的抗氧化和抗菌活性。CH-TPEOs 作為保鮮涂層顯著抑制鮮切蘋果的感官劣變，降低鮮切蘋果樣品中的微生物數量，使TBC 從7.6 log CFU/g 降至4.2～4.5 log CFU/g，使TAC 從5.4 log CFU/g 降至2.9～3.3 log CFU/g，并抑制花青素、胡蘿卜素和葉綠素在貯藏過程中的變化。研究表明，CH-TPEOs 薄膜作為抗氧化劑和抗菌劑涂層在儲藏鮮切食品方面具有廣闊的發展潛力，為新型可食用包裝材料開發提供借鑒，有著良好的應用前景。