采食高淀粉高油日糧奶牛的泌乳性能、乳成分變化及乳腺差異表達基因篩選

吳 柯，韓印如，李 斌，劉肅然，賈 坤，畢研亮，劉德武，郭勇慶

(1 華南農業大學 動物科學學院,廣東 廣州 510642；2 華南農業大學 獸醫學院,廣東 廣州 510642；3 中國農業科學院 飼料研究所,北京 100081)

近年來，我國奶業發展迅速，奶牛養殖業和乳品加工業逐漸成為國民經濟中重要支柱產業之一[1]。乳脂作為牛奶營養的重要物質之一，是衡量牛奶品質優劣的重要指標，其含量直接影響原奶品質和售價。然而，現行生鮮乳國家標準中要求的乳脂率僅為3.1%，我國原奶乳脂率的整體水平為3.69%，遠低于歐盟(4.04%)、澳大利亞(4.11%)和新西蘭(4.78%) 等乳業發達國家生鮮乳中的乳脂率[2]。乳脂率受遺傳、飼糧、泌乳階段等多種因素影響，其中受飼糧組成影響最大。乳脂降低綜合征(Milk fat depression，MFD)是指日糧因素造成奶牛乳脂率或乳脂產量明顯降低，而對產奶量和乳蛋白產量影響較小的一種現象[3]。我國優質粗飼料資源短缺，為了使奶牛充分發揮產奶性能，生產中不得不飼喂高淀粉高油飼糧來滿足奶牛能量需要，造成乳脂合成抑制多發[4]。過去的研究通常采用單獨的高精料或高油飼糧來誘導奶牛產生MFD，而給奶牛同時飼喂高精料高油飼糧的研究相對較少。

日糧組成會影響反芻動物乳腺中乳脂肪和乳蛋白的合成。研究表明，在日糧誘導奶牛發生MFD 過程中參與脂質合成的關鍵酶下調，啟動子中有一個受固醇反應元件SREBP1調節[5]，表明SREBP1在調節牛乳腺上皮細胞脂肪酸合成的信號通路中具有重要作用。RNA 測序技術(RNAseq) 已成為基因表達和轉錄組分析的重要手段，Cui 等[6]以荷斯坦奶牛乳蛋白和乳脂肪含量作為差異性狀，對奶牛的乳腺上皮細胞進行轉錄組測序，推測出了調控乳中蛋白和脂肪含量的關鍵基因。因此，利用RNA-seq 技術闡明牛乳腺轉錄組對于確定影響奶牛乳成分性狀的候選基因至關重要[7]。

本研究旨在探究同時飼喂高淀粉高油日糧對奶牛生產性能和乳成分的影響，并結合乳腺組織的轉錄組表達情況，篩選出參與脂質調控的候選基因，為進一步闡述MFD 的分子機制和科學配制日糧提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和飼養管理

選取來自廣東某奶牛場的8 頭頭胎荷斯坦奶牛為試驗動物，其泌乳日齡(215±34) d，體質量(575±23) kg。全混合日糧(Total mixed ration,TMR)飼喂，每天飼喂時間為07:00 和17:00，擠奶時間為06:30 和16:30，自由采食和飲水，保證剩料量(w)5%～10%。試驗期間，每頭奶牛單獨拴系飼養于欄舍內，地面鋪有橡膠墊和細沙，每日清糞2 次。

1.2 試驗設計

試驗開始前預飼10 d，奶牛均飼喂低淀粉低油飼糧。試驗期將8 頭奶牛隨機分為對照組和處理組(每組4 頭)，采用2×2 反轉試驗設計，進行兩期試驗，每期23 d(誘導期16 d，恢復期7 d)，兩期間對照組和處理組對調。誘導期時，對照組奶牛飼喂低淀粉低油日糧，精粗比(m:m) 50:50，處理組奶牛在對照組日糧基礎上添加了266 g/kg(干物質基礎)細粉碎玉米(過1.2～1.5 mm 篩) 和46 g/kg(干物質基礎)的大豆油，精粗比(m:m) 62:38；恢復期，兩組奶牛均飼喂低淀粉低油飼糧。誘導組奶牛在每期試驗的前4 d 進行飼糧過渡。飼糧組成和營養成分見表1。

表1 試驗飼糧組成和營養水平(干物質基礎)1)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis)

1.3 樣品采集

1.3.1 飼料樣品采集和測定 飼養過程中每天記錄每頭牛的TMR 飼喂量和剩料量，測定第1、4、7、10、13、16、19 和22 天的干物質采食量(Dry matterintake,DMI)。于每期的第13～15 天采集飼料原料和TMR，65 ℃烘干后粉碎，過18 目篩后，參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[8]中的方法測定干物質(Dry matter,DM)、有機物(Organic matter,OM)、粗蛋白質(Crude protein,CP)、粗脂肪(Ether extract,EE)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)含量，采用比色法測定淀粉含量[9]。

1.3.2 奶樣采集和測定 測定每期第1、4、7、10、13、16、19 和22 天的產奶量，并采集奶樣。將每天采集的早晚奶樣按照1:1 體積比均勻混合后4 ℃保存，利用多功能乳成分分析儀(LactoStar 3560;FUNKE GERBER，Germany)測定乳脂、乳蛋白、乳糖和非脂固形物含量。

1.3.3 乳腺組織采集與測定 于飼養期第17 天由經過培訓的專業獸醫人員對奶牛進行乳腺組織的活體采樣，其中每期每個處理組隨機采集乳腺樣本2 個(共8 個)。采集乳腺組織時，選擇奶牛乳房后區上四分之一中點處為采樣部位。皮下注射體積分數為1%的鹽酸普魯卡因(每頭注射20～30 mL)進行麻醉。麻醉起效后，使用12 號活檢針移除適量乳腺組織，用生理鹽水洗去血液，放入凍存管，存于液氮中待測。觀察傷口不再出血時(活檢后約5 min)將其縫合。轉錄組測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，測序文庫使用NEBNext?Ultra?Directional RNA Library Prep Kit for Illumina?(NEB，USA)生成，高通量測序平臺為Illumina HiSeq 4 000(Illumina，USA)。

1.4 數據統計分析

采用Excel(2016)進行所有數據的基本處理。奶牛的DMI、產奶量和乳成分結果折線圖采用GraphPad Prism 7 繪制；各指標采用SAS version 9.4 的MIXED 程序進行統計分析，使用t檢驗比較差異顯著性，根據以下模型進行分析：Yijkl=μ+Si+Tj+Nk(Si) +Pl+εijkl，其中Yijkl為試驗牛在不同處理下的因變量值，μ為總體均值，Si為次序i的隨機效應(i=1、2)，Tj為日糧j處理效應(j=1、2)，Nk為嵌套次序的試驗牛k的隨機效應(k=1～8)，Pl為采樣時期效應(l=1、2)，εijkl為隨機誤差。使用Kenward-Rogers語句校正自由度。剔除學生化殘差(Studentized residuals) 超過±3 的數據點。采用的軟件方法為GOseq 的GO 分析，使用KOBAS(2.0)和KEGG 數據庫對差異表達基因進行通路顯著性富集分析，確定差異基因的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑?；谄栠d相關系數對奶牛的平均泌乳性能與部分乳腺差異表達基因進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 高淀粉高油日糧對奶牛DMI、產奶量及乳成分變化的影響

由于飼糧對奶牛的影響是漸進的過程，因此本試驗進行了分階段采樣，以觀察飼養期間奶牛相應指標的變化情況(圖1)。由圖1a 可以看出，處理組DMI 在誘導期呈波動性變化，整體低于對照組，其中第13、16 天顯著低于對照組(P＜0.05)，恢復期逐漸回升。圖1b 表明，試驗初期處理組產奶量略高于對照組，第4 天后處理組逐漸下降，其中第13、16 天顯著低于對照組(P＜0.05)，恢復期有所回升。乳成分方面，與對照組相比，飼喂處理組飼糧7 d 后乳脂率和乳脂產量整體呈降低趨勢，且第10、13、16 和19 天顯著降低(P＜0.05)(圖1c、1d)；乳蛋白、乳糖和非脂固形物的含量先升高后降低(圖1e、1g、1i)，而產量先降低后回升(圖1f、1h、1j)，其中第13、16、19 天差異顯著(P＜0.05)。

2.2 高淀粉高油日糧對奶牛乳腺組織轉錄組的影響

2.2.1 RNA 抽提結果與質量檢測 共提取了泌乳奶牛8 個乳腺組織RNA 以供建庫使用。乳腺處理組和對照組每組各取4 個樣本，通過Nanodrop 和Agilent 2 100 檢測總RNA 的質量濃度、純度和完整性，結果表明，乳腺樣本R N A 完整值(R N A integrity number，RIN)≥6.8，質量濃度、純度和完整性較好，檢測結果為A 級，達到測序樣品質量要求，可用于后續轉錄組測序。

2.2.2 測序數據總體分析 在本研究中，8 個乳腺測序文庫共計得到477.47 M Raw reads，每個樣品的Raw reads 總數均達47 M 以上，每個樣品保留下來的Clean reads 最少約占總數的97.33%。每個乳腺組織樣的Clean bases 總數均大于7.76 G，檢測堿基含量分布發現，GC 含量為49.3%～52.23%，Q20≥97.14%，Q30≥92.24%，說明測序質量較高，可進行后續分析。

2.2.3 差異表達分析 通過Cuffdiff 同種組織各組間差異表達基因進行篩選，發現乳腺組織共篩選出235 個顯著差異表達的mRNA，其中上調表達的有64 個，下調表達的有171 個。篩選條件為P＜0.05，|log2(Fold change)|＞1（Fold change 表示差異倍數），乳腺組織差異基因火山圖如圖2所示。

對乳腺235 個差異表達基因的表達量做FPKM(Fragments per kb per million reads) 層次聚類(Hierarchical clustering)分析后得到差異基因聚類圖，FPKM 指每百萬fragments 中來自某一基因每千堿基長度的fragments 數目，同時考慮了測序深度和基因長度對fragments 計數的影響。如圖3 所示，可以看出飼糧處理后乳腺組間差異基因的聚類明顯分開，8 個樣本聚成2 個類別，對照組樣本和處理組樣本分別聚為一類，說明這些聚集基因可能具有相似的功能注釋或處于相同的代謝通路，各組組內樣本之間也有明顯的差異。

圖3 乳腺組織差異表達基因熱圖Fig.3 Heat map of differentially expressed genes in mammary gland tissue

2.2.4 測序結果的qPCR 驗證 對差異表達mRNA 進行熒光定量PCR，以驗證測序結果的準確性。選取乳腺中參與脂質調控的關鍵基因包括FASN(脂肪酸合成酶)、SREBF1(固醇調節元件結合轉錄因子)，另外又隨機選取4 個基因在乳腺中進行驗證，包括SCGB1D、PLA2G16、RNASE1和BICDL1。如圖4 所示，實時熒光定量PCR 結果與測序結本基本一致，說明測序結果可靠性較高。

圖4 乳腺組織部分差異表達mRNA 熒光定量PCR 驗證Fig.4 Fluorescence quantitative PCR validation of partial differentially expressed mRNA in mammary gland tissue

2.2.5 mRNA 功能富集分析 GO 分析結果表明，篩選出的乳腺差異表達基因顯著富集到609 個GO條目(P＜0.05)，其中包含454 個生物學過程條目、111 個分子功能條目和44 個細胞成分條目。圖5為乳腺差異mRNA 顯著富集的前30 個GO 條目。對差異表達基因進一步富集分析發現，上調基因主要與炎癥反應、氨基酸代謝和有機氮化合物代謝等過程有關。下調基因主要與脂質代謝、脂質生物合成、脂肪細胞分化、信號調節以及細胞的增殖、分化、發育等過程有關。

圖5 乳腺差異mRNA 顯著富集的前30 個GO 條目Fig.5 The first 30 GO terms with significant enrichment of differential mRNAs in mammary glands

對差異表達基因進行KEGG 通路分析(圖6)發現，共有20 個基因之間有互作關系，而乳腺上調差異基因顯著富集到6 條通路上(P＜0.05)，包括核糖體、亞油酸代謝和花生四烯酸代謝等；下調差異基因顯著富集到14 條通路上(P＜0.05)，包括軸突導向、鈣信號通路、原發性免疫缺陷、NF-κB 信號通路、泛酸和CoA 生物合成以及用于IgA 生成的腸道免疫網絡等。

圖6 乳腺差異表達基因KEGG 富集圖Fig.6 KEGG enrichment map of differentially expressed genes in mammary glands

篩選出的差異顯著基因中，FCGR1A、SAA3、NLRC4和CATHL5參與炎癥反應和免疫反應；CD40LG和CCL21參與NF-κB 信號非經典通路；FASN、SREBF1、MLXIPL、HTR2B、ETNK2、FGFR4和VDR參與脂質生物合成過程；CCL21、CYP1A2、LRAT和TYRP1參與脂質代謝過程調節；SREBF1、VDR和FGFR4參與調節類固醇代謝過程；AGAP2、NEURL1、IGFBP5、FASN和VDR參與乳腺發育過程；HTR2B、ETNK2和SREBF1參與甘油脂合成過程。

2.2.6 奶牛泌乳性能與差異基因表達的相關分析 本研究選取了差異顯著性TOP 10 的基因，并根據功能富集分析篩選了與氨基酸代謝、脂質代謝、炎癥反應等過程相關的差異表達基因，將乳腺中篩選出的差異基因分別與奶牛的平均泌乳性能數據做了相關性分析，由表2 可知，乳腺中，RNASE1、Novel02780和TECTB表達與乳脂率和乳脂產量呈顯著負相關(P＜0.05 或P＜0.01)；GSTA2、FCGR1A、SAA3、RNASE1、Novel02780和NLRC4表達與DMI 呈極顯著負相關(P＜0.01)，其中FCGR1A、SAA3和NLRC4參與炎癥與免疫反應；GPA33、LRRC75A、GPR37L1、COL26A1、APLN、SREBF1、VDR、FGFR4、CCL21和NEURL1表達與產奶量和乳脂產量呈顯著正相關(P＜0.05)；FBXO10、HTR2B、TYRP1、CD40LG、AGAP2和IGFBP5表達與乳脂產量呈顯著正相關(P＜0.05)。

表2 奶牛泌乳性能與部分乳腺差異基因表達的相關分析1)Table 2 Correlation analysis of lactation performance and expression of selected differential genes in mammary glands of dairy cows

3 討論與結論

3.1 高淀粉高油日糧對奶牛DMI 和泌乳性能的影響

DMI 受日糧適口性、能量水平等多種因素影響。本研究得出，處理組奶牛的DMI 和產奶量在13 和16 d 顯著降低。早期研究顯示，每天采食高濃度油時，DMI 較低，產奶量也有所下降[10]。但Boerman 等[11]飼喂添加大豆油或大豆脂肪酸餾出物飼糧時發現，奶牛的DMI 下降，產奶量卻提高。此外，Oba 等[12]研究發現，在奶牛瘤胃中灌注丙酸來替代乙酸可導致奶牛DMI 下降。本試驗處理組日糧中添加了粉碎玉米，較高的淀粉含量可在瘤胃中產生較多的丙酸，參與到肝臟的氧化代謝，抑制動物機體采食，進而導致奶牛DMI 下降。

產奶量受生理、環境、營養、疾病等多種因素影響。在瘤胃健康時，高精料飼糧通?？商岣吣膛５漠a奶量，但是當瘤胃健康受損時，高精料飼喂則會降低奶牛的產奶量[13]。另一方面，泌乳后期奶牛在妊娠過程中食欲較差，采食量下降，產奶量也會降低[14]。本試驗得出，誘導初期處理組奶牛的產奶量略高于對照組，之后呈下降趨勢，可能與DMI 的顯著降低及瘤胃健康有關。

本試驗處理組奶牛飼糧添加粉碎玉米和大豆油飼喂7 d 后，乳脂率和乳脂產量開始下降且差異顯著。研究表明，用高精料誘導奶牛MFD 時乳脂率顯著降低了25%，乳脂產量顯著降低了27%[15]；飼糧中添加4%(w)豆油或4%(w)胡麻油后，奶牛均出現了乳脂降低現象[16]；高淀粉飼糧添加600 g 葵花籽油飼喂2 周以上，可引起奶牛的乳脂合成抑制[17]，說明高淀粉高油飼糧可降低乳脂合成，與本試驗結果一致。本試驗處理組奶牛第13、16 和19 天的乳蛋白、乳糖和非脂固形物含量顯著提高。然而部分研究顯示，飼喂高精料植物油飼糧時并未觀察到乳糖、乳蛋白和非脂固形物有顯著影響[18]，與本試驗結果不一致，這可能與引起乳脂降低的飼糧組成及其對產奶量的影響不同有關。有研究表明，乳蛋白含量與飼糧的能量水平有關，適當增加飼糧精粗比可以提高乳蛋白含量[19]。乳糖含量增加，可能是由于奶牛采食高淀粉日糧后，飼糧中的過瘤胃淀粉進入腸道生成葡萄糖量相應增加[20]。

3.2 高淀粉高油日糧對奶牛乳腺組織脂代謝相關基因表達的影響

對乳腺差異mRNA 進行富集分析后發現，上調mRNA 顯著富集到的GO 條目主要與炎癥反應和免疫反應、氨基酸代謝和有機氮化合物代謝有關；下調mRNA 顯著富集到的GO 條目主要與脂質生物合成與脂質代謝、細胞增殖分化與細胞發育以及乳腺發育有關。

3.2.1 高淀粉高油日糧影響奶牛乳腺脂質代謝的作用機制 通過篩選得到與炎癥反應和免疫反應相關的基因有FCGR1A、SAA3、NLRC4和CATHL5。FCGR1A 是免疫球蛋白FcγR 受體家族的主要成員之一，可參與調節免疫反應，它可通過激活NF-κB 信號傳導增加NLRP3 炎癥小體的形成以及炎性細胞因子(IL-1β 和IL-18)的釋放，從而加劇免疫炎癥[21]。SAA3(血清淀粉樣蛋白A3)是奶牛乳腺上皮細胞(Mammary epithelial cell，MEC)分泌的主要血清淀粉樣蛋白A (Serum amyloid A，SAA)亞型，在炎癥期間于大多數MEC 中高水平表達，能在宿主防御中發揮作用。此外，研究表明，SAA3 也能由脂肪細胞產生，且SAA3 參與奶牛分娩前后的炎癥反應調節[22]。NLRC4 在幽門螺桿菌感染中，可通過控制IL-18 的產生來降低宿主的免疫反應，從而導致炎癥[23]。CATHL5 是抗菌肽家族的成員，具有抗菌活性和炎癥反應調節功能，還可觸發宿主的特定防御反應，對哺乳動物的免疫反應有重要作用[24]。除此之外，CD40LG和CCL21基因表達下調并顯著富集到NF-κB 信號非經典通路，CD40LG 在免疫應答中起主要作用，能誘導激活NF-κB[25]；CCL21 是一種趨化因子，對淋巴組織內原始淋巴細胞的返回和運輸具有重要作用[26]。本研究中，CCL21表達與乳脂產量之間具有高度正相關性，因此CCL21表達量的減少可能是乳脂產量降低的影響因素之一。

3.2.2 高淀粉高油日糧影響奶牛乳腺的脂質調控 本試驗結果顯示，多個基因參與脂質合成、代謝等生物學過程。

奶牛飼喂高淀粉高油飼糧后，乳脂合成降低與關鍵脂質合成基因(FASN)和轉錄因子(SREBF1、MLXIPL)的表達下調有關。FASN 是參與脂肪酸合成的關鍵酶，其轉錄本顯著降低直接影響乳腺脂肪酸的從頭合成。SREBF1 可通過調控涉及膽固醇和脂肪代謝的眾多基因的轉錄來調節脂質的生物合成和脂肪形成[27]。MLXIPL 又被稱為碳水化合物反應元件結合蛋白(ChREBP)，是乳腺中調節脂肪生成的另一個轉錄因子；研究表明MLXIPL 對脂肪生成有積極作用，對于脂肪酸和體內甘油三酯合成的協調控制至關重要[28]。本研究發現HTR2B、ETNK2均富集到磷脂合成、甘油磷脂合成的GO 條目中。HTR2B(5-羥色胺受體2B)被發現于研究人類脂肪形成和脂肪儲存的新基因中，當HTR2B表達顯著下調12.25 倍時，脂肪細胞表現出脂質積累增加；用HTR2B拮抗劑處理過的細胞進行驗證發現，細胞中性脂質水平顯著增加[29]。ETNK2(乙醇胺激酶2)是乙醇胺激酶(EKI)家族成員，EKI 通過二磷酸胞苷(CDP) 乙醇胺途徑催化磷脂酰乙醇胺(PE)生物合成的第1 步，該酶參與甘油磷脂代謝。FGFR4 是跨膜酪氨酸激酶受體，在調節肝膽汁酸、全身脂質代謝、葡萄糖穩態以及細胞信號傳導中起重要作用[30]。VDR(維生素D3 受體)是配體誘導型轉錄因子的核激素受體超家族的成員，VDR 直接與NLRP3 相互作用，抑制NLRP3 炎癥細胞的組裝，減少NLRP3 介導的IL-1β 和IL-18 的分泌[31]，提示VDR 可能是一種潛在的抗炎因子。

LRAT(卵磷脂視黃醇?；D移酶)催化視黃醇轉化為視黃酯，在人乳腺組織中的研究表明LRAT在人的乳房生理中起重要作用[32]。CYP1A2 是細胞色素P450 酶超家族的成員之一，CYP1A2 可存在于內質網囊泡產生的脂質微區中但似乎并不影響其形成。TYRP1(酪氨酸酶相關蛋白1)參與黑色素生物合成途徑，Randhawa 等[33]研究發現黑色素生成相關基因在內臟脂肪組織中的表達，首次證明了黑色素的生物合成途徑在脂肪組織中起作用。此外，本試驗相關性分析結果顯示TYRP1表達與乳脂產量之間有極顯著的正相關性。

本研究中AGAP2、NEURL1和IGFBP5參與了乳腺發育過程，說明高淀粉高油飼糧對奶牛乳腺發育有一定的影響。AGAP2 參與細胞凋亡、細胞存活和受體運輸相關的信號通路[34]。NEURL1(神經化E3 泛素蛋白連接酶1) 能通過泛素的賴氨酸殘基K27 導致其蛋白酶體介導的降解來調節PDE9A 蛋白水平，從而可能對細胞cGMP 水平產生積極影響。IGFBP5(胰島素樣生長因子結合蛋白5)對調節乳腺發育和泌乳后復性過程中的細胞凋亡和細胞增殖有重要作用[35]。

以上基因中，CCL21既參與脂質代謝調節也參與了炎癥調節，而由于之前在SREBP1的啟動子區域中發現了NF-κB 的結合位點[36]，因此推測炎癥信號通路可能影響了脂質代謝的調節，有待進一步驗證。結合差異表達基因與泌乳性能的相關性分析，基因FGFR4、VDR、HTR2B、CCL21和TYRP1雖不在常規的脂肪代謝過程中，但其表達量與乳脂產量具有較高的正相關，對乳腺發育和乳腺脂質代謝具有重要調控作用，上述基因表達量的下調可能是引起乳脂含量降低的重要因素，因此可作為研究奶牛MFD 脂質代謝調控的候選基因。

3.3 結論

通過飼喂高淀粉高油日糧，降低了奶牛的DMI、產奶量、乳脂率，提高了乳蛋白、乳糖和非脂固形物含量。測序結果顯示，乳腺中參與脂肪合成的mRNA 的表達下調是造成乳脂率和乳脂產量降低的主要因素。結合差異表達基因與泌乳性能的相關性分析，篩選出了乳腺中可能與脂質代謝調控存在緊密聯系的基因FGFR4、VDR、HTR2B、CCL21和TYRP1作為研究MFD 的候選基因，可為研究荷斯坦奶牛MFD 的分子機制奠定基礎。