環2-(4-三氟甲基)苯基吡啶釕亞硝酰配合物的合成與光敏NO釋放

李襄宏，吳秋俁，王藝榮，李珍

（中南民族大學 化學與材料科學學院，武漢 430074）

一氧化氮（NO）作為重要的生物活性分子之一，已被證實在高濃度（μmol·L-1～mmol·L-1）下可促使細胞凋亡壞死.隨著光熱及光動力治療技術的發展，光敏型NO 供體分子包括硝基苯類［1-2］、N-亞硝胺類［3-4］、金屬亞硝酰配合物［5］等的設計、合成及性能研究受到了國內外學者的廣泛關注.釕亞硝酰配合物作為NO 分子供體，具有特殊的光敏性、較高的熱穩定性、低的細胞毒性和較好的抗腫瘤活性［6-10］.因此，開發結構新穎、合成較容易且功能優異的新型釕亞硝酰配合物在抗腫瘤治療領域具有重要意義［5］.環金屬釕配合物以Ru—C 鍵替代Ru—N［11-12］，增加了配合物在生理環境中的穩定性和親脂性，具有更好的生物相容性和對癌細胞更強的細胞毒性［13-14］.然而，基于環金屬釕亞硝酰配合物的NO 供體分子方面的研究卻比較少見［15-17］，合成新的環金屬釕類亞硝酰配合物仍然具有很大的挑戰性.

本文以2-（4-三氟甲基）苯基吡啶為C，N-配體，2，2′-二聯吡啶為N，N-配體，合成了其環金屬釕配合物［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6，隨后將其與NOBF4反應制備得到了環2-（4-三氟甲基）苯基吡啶釕亞硝酰配合物［Ru（bpy）（4-CF3ppy）（CH3CN）NO］（PF6）2（配合物1，如圖1 所示），核磁、紅外、質譜和循環伏安表征其結構正確.紫外-可見吸收光譜以及EPR 表征說明該配合物可光敏釋放NO.相同條件下，其光敏NO 釋放量顯著高于［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+和［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+，這一結果與理論計算中Ru-N（NO+）的結合能大小一致.

圖1 釕亞硝酰配合物1的合成Fig.1 Synthesis of ruthenium nitroyl complex 1

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

甲苯、乙醇、乙腈、石油醚、二氯甲烷等有機溶劑、碳酸鈉、六氟磷酸銨等無機鹽（國藥集團化學試劑）；4-三氟甲基苯硼酸、2-溴吡啶、四（三苯基膦）鈀、對氨基苯磺酸、85%濃磷酸、N-（1-萘）乙二胺二鹽酸鹽、四丁基六氟磷酸（上海阿拉?。?；四氟硼酸亞硝鎓、NO 自由基捕獲劑2-（4-羧基苯基）-4，4′，5，5′-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物鉀鹽（c-PTIO）（上海麥克林）；［Ru（cymene）Cl2）］2（北京百靈威），所有試劑均為分析純.環金屬釕亞硝酰配合物［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+和［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+按文獻［17］方法合成并通過核磁表征；2-（4-三氟甲基苯基）吡啶參考文獻［18］方法合成并通過核磁表征.

核磁共振儀（Ascend Ⅲ TM 600 MHz，Bruker）；質譜儀［autoflex TM speed MALDI-TOF，Bruker，以CHCA（α-氰-4-羥基肉桂酸）為基質］；紫外-可見分光光度計（UV-1800PC，上海美析）；紅外光譜儀（Nexus470，Thermo Nicolet）；順磁共振波譜儀（EMX Plus，Bruker）；電化學工作站［CHI660C，以Ag+/Ag 做參比電極，玻碳電極做工作電極，Pt 絲做對電極，n-Bu4NBF6（0.1 mol·L-1）做支持電解質，乙腈溶液中掃描速度為50 mV·s-1］；氙燈光源系統（CEL-HXF300-T3，中教金源科技）；光功率與能量計（PM100D，Thorlabs）.

1.2 配合物［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6的合成

氬氣氣氛下，2-（4-三氟甲基苯基）吡啶（0.174 g，0.78 mmol）、KPF6（0.294 g，1.60 mmol）、乙腈12 mL和三乙胺0.35 mL依次加入50 mL三頸瓶中.攪拌均勻后，再加入［Ru（cymene）Cl2）］2（0.300 g，0.5 mmol），在55 ℃下回流16 h.冷卻反應液至室溫，旋蒸除掉溶劑得暗紅色固體.繼續向上述反應體系中加入2，2′-二聯吡啶（0.250 g，1.57 mmol）和甲醇10 mL，回流12 h 后停止反應并冷卻至室溫.旋蒸，以二氯甲烷/乙腈作為洗脫劑，通過硅膠柱層析純化，得黑色固體產物0.55 g，產率為70%.1H NMR（600 MHz，CD3CN）δ8.46（d，J=8.3 Hz，1H），8.39（d，J=8.1 Hz，1H），8.33（d，J=7.8 Hz，2H），8.12（d，J=8.0 Hz，1H），8.03～7.92（m，3H），7.88～7.77（m，4H），7.77～7.68（m，3H），7.65～7.61（m，1H），7.44～7.39（m，1H），7.27～7.17（m，3H），7.16（dd，J=8.1，1.3 Hz，1H），7.04～6.99（m，1H），6.69（s，1H）.13C NMR（151 MHz，CD3CN）δ194.87，166.54，158.18，157.43，157.19，155.68，154.74，151.28，150.92，150.76，150.35，149.74，137.18，136.58，135.87，134.88，134.76，131.42，131.40，127.65，127.12，126.98，126.86，124.34，124.10，124.04，123.84，123.76，123.71，120.47.MS（Maldi-TOF，CHCA）：m/z計算值636.09［M-PF6-］+，實驗值636.23.

1.3 環金屬釕亞硝酰配合物1的合成與表征

氬氣氣氛下，向三口瓶中依次加入配合物［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6（0.101g，0.13 mmol）、乙腈12 mL和四氟硼酸亞硝鎓（0.076 g，0.65 mmol），在10 ℃下避光反應1 h 后，濃縮反應液體積至3 mL.室溫下，緩慢加入飽和六氟磷酸銨水溶液10 mL，待固體析出后過濾，用大量去離子水和乙醚洗滌產品，真空干燥后，將其溶解乙腈中，加入乙醚重結晶得到0.098 g 暗紅色晶體1，產率90%.1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ9.45（dd，J=6.6 Hz，1.2 Hz，1H），9.09～9.00（m，2H），8.89（d，J=8.0 Hz，1H），8.82（d，J=8.0 Hz，1H），8.72（td，J=8.0，1.4 Hz，1H），8.63（td，J=7.9，1.5 Hz，1H），8.49（d，J=8.2 Hz，1H），8.42（td，J=8.0，1.4 Hz，1H），8.24～8.20（m，1H），8.01～7.98（m，1H），7.73（dd，J=8.0，1.2 Hz，1H），7.62～7.58（m，1H），7.22（dd，J=6.6 Hz，1.2Hz，1H），6.71（d，J=1.2 Hz，1H），2.08（s，3H）.13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ161.29，155.85，153.32，152.91，150.43，147.13，146.64，143.85，143.79，142.91，130.34，130.02，129.39，128.63，126.77，126.64，126.09，125.38，124.96，124.24，123.64，122.43，118.08，1.15.IR（KBr，cm-1）：1911（νN≡O），839（νP-F）.MS（Maldi-TOF，CHCA）：m/z計算值696.01 ［M-PF6-］+，實驗值：696.38，666.28 ［M-PF6-NO］+.

1.4 理論計算

分子的幾何結構使用Perdew-Burke-Ernzerhof（PBE）方法結合def2-SVP 基組，通過Gaussian16 軟件進行了充分優化，采用Grimme 的DFT-D3（BJ）經驗色散校正.在相同水平上計算了振動頻率，以確認所有結構都不具有虛頻，即所優化結構對應于勢能面上的局部極小值.在PBE0/def2-TZVP 級別上對Ru 和NO 之間的相互作用能進行了計算，并使用Boys 和Bernardi 提出的counterpoise 方法對進行了基組重疊誤差（BSSE）進行了校正，其中相互作用能被定義為復合物的能量與NO 分子和不包括NO 的結構的能量之差，其中后兩者的幾何結構均凍結為其在復合物中的結構.在基態結構下，采用TDPBE0-D3（BJ）/def2-TZVP 計算了體系的激發能.根據Multiwfn 的分析結果，采用VMD 1.9.3 繪制了HOMO（最高占據分子軌道）和LUMO（最低未占據分子軌道）.

1.5 吸收光譜及光敏NO釋放

將配合物1 用乙腈溶解，配成1.0 mmol·L-1儲備液，用乙腈稀釋至20 μmol·L-1，在用氙燈照射0、10、30、60、120、180 min 后掃描吸收光譜，即得到1 在光照下的吸收光譜變化，光照強度為850 mW·cm-2.

將等體積的1%磺胺酸、5%磷酸和0.1%N-（1-萘）乙二胺二鹽酸鹽水溶液混合制備Griess試劑.將亞硝酸鈉水溶液（5～100 μmol·L-1）與Griess 試劑混合，掃描其吸收光譜，以產生的偶氮染料在540 nm處的吸光度A 為縱坐標，NO2-濃度為橫坐標制作標準曲線.吸取配合物1、儲備液150 μL，Griess 試劑100 μL，配置1 的溶液（50 μmol·L-1）進行測試，光照強度為850 mW·cm-2.根據標準曲線測算NO/NO2-的量，以確定配合物1 的光敏NO 釋放量.相同條件和方法測定［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+和［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+的NO釋放量.

2 結果與討論

2.1 配合物的合成與表征

按照文獻［19］方法，首先合成了環金屬釕配合物［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6，氫譜［圖2（a）］、碳譜［圖2（b）］及質譜［圖2（b）插圖］確認了其結構.這里，圖2（b）碳譜中位于δ194.87 的信號歸屬于苯環上與中心釕（Ⅱ）結合的碳原子特征信號峰.而圖2（b）插圖質譜中位于636.23 處的信號峰為配合物失去平衡陰離子PF6-后形成的分子離子碎片峰，與理論值636.09 ［M-PF6-］+相符.

圖2 ［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6的NMR譜和質譜Fig.2 NMR and MS spectra of ［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6，respectively

隨后，將［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6在弱酸性條件下與亞硝酸鈉進行反應制備配合物1［16］.由于環金屬釕配合物中Ru-C在酸性溶液中不穩定性［20］，盡管獲得了目標配合物1，但產率極低，且副產物多，分離提純困難.因此，以NOBF4代替亞硝酸鈉作為NO 源，將其與［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6進行反應，后處理得到釕亞硝酰配合物1，產率高達90%.氫譜［圖3（a）］和碳譜［圖3（b）］中所呈現的氫信號及碳信號表明［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］+在與NOBF4的反應中失去了一個bpy 分子從而空出兩個配位點，分別與NO+及溶劑分子CH3CN配位并最終形成六配位的配合物1.質譜［圖3（b）插圖］中出現在696.38 的分子離子峰與［M-PF6-］+理論值696.01 接近，進一步確認該亞硝酰配合物的生成過程中失去了一個bpy 分子.值得一提的是，質譜中也觀察到666.28 處的分子離子碎片峰，與失去一個NO 分子的分子離子碎片［M-PF6--NO］+（理論值666.02）一致.以上表征結果確認了配合物1的結構.

圖3 配合物1的NMR譜和質譜Fig.3 NMR and MS spectra of complex 1

此外，與［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6相比，圖4 FT-IR 譜圖中觀察到配合物1 在1911 cm-1處出現了一個中等強吸收峰，這歸屬于NO+中N—O特征伸縮振動［15-17，21-22］，表明該配合物中存在RuⅡ-NO+特征結構.圖4 插圖為配合物1 的循環伏安圖，相關數據整理在表1 中（這里配合物1 所有的電位都相對于二茂鐵Fc+/0進行修正，即圖示電位數據加36 mV）.如圖4 所示，歸屬于配合物1 的Ru（Ⅱ）→Ru（Ⅲ）氧化峰位出現在-0.015 VvsFc+/Fc0.與［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+和［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+分別位于-0.154 V 和-0.164 VvsFc+/Fc0的氧化峰位相比［17］，可知苯環上取代基的吸電子特性明顯增加了Ru（Ⅱ）的穩定性，使得配合物1 的Ru（Ⅱ）/（Ⅲ）氧化電位更高［11］.值得注意的是，在-0.51～-0.91 VvsFc+/Fc0范圍內，配合物1 經歷了RuⅡNO+→RuⅡNO·和RuⅡNO·→RuⅡNO-的兩步連續還原過程［8，23］，進一步證實了結構中RuⅡ-NO+的存在.此外，正電位區0.2 V 以上的氧化峰可歸因于碳陰離子配體的氧化，而發生在更負的電位上的還原峰則歸屬于聯吡啶配體的還原.

表1 三個環金屬釕亞硝酰配合物性質比較Tab.1 Comparison of properties of the three cyclometalated ruthenium nitrosyl complexes.

圖4 配合物1和［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6的FT-IR紅外光譜Fig.4 FT-IR spectra of complex 1 and ［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6

2.2 理論計算

圖5 列出了配合物1 的HOMO 及LUMO 軌道分布.由圖5 可見：其HOMO 軌道電子云主要分布在C^N 配體上；LUMO 軌道電子云則主要分布在Ru 原子和NO 上，這也說明Ru（Ⅱ）的d軌道與NO 分子的π*分子軌道之間有很強的相互作用.表1 給出了配合物1、［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+和［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+中Ru（Ⅱ）與NO 分子間 的Ru-NO 結合能，分別為-69.30、-98.28［17］和-101.17 kcal·mol-1［17］.這里，吸電子基團—CF3的引入，使Ru—NO 結合能數值明顯降低，RuⅡ—NO+更容易發生斷裂.因此，可以推斷含吸電子基團的釕亞硝酰配合物作為NO供體，其NO釋放更容易.

圖5 配合物1的HOMO和LUMO軌道Fig.5 HOMO and LUMO orbitals of complex 1

2.3 吸收光譜及光敏NO釋放

研究了配合物1的乙腈溶液在黑暗和光照下的吸收光譜（見圖6）.黑暗條件下，配合物在可見光區幾乎沒有吸收，在314 nm 附近的譜帶歸屬于dπ（Ru）→π*（bpy）躍遷，在252 nm 和297 nm 附近的吸收帶歸于2-苯基吡啶和2，2′-二聯吡啶的π→π*躍遷.光照后，230～300 nm 間的吸收峰強度隨光照時間增加而增強（光照強度為850 mW·cm-2），該吸收譜帶歸屬于聯吡啶及C，N-配體到NO+的LLCT躍遷吸收.314 nm 附近的吸收峰強度下降的同時，430 nm 處出現新峰且峰強度隨著光照時間的增加而增加，這可歸屬于dπ（Ru）→π*（NO）的MLCT 躍遷［23-24］.以上吸收光譜的變化說明在光照條件下，配合物可能存在分子內的電子轉移過程，光敏NO 釋放是可能的，其光敏釋放NO 的過程可用下式描述［8，17，24］：

圖6 配合物1的乙腈溶液（20 μmol·L-1）在氙燈照射下隨時間變化的吸收光譜Fig.6 Time-dependent UV-vis absorption spectra of complex 1（20 μmol·L-1）in CH3CN under xenon lamp irradiation

（L）RuⅡ-NO++hv+solv→［（L）RuⅢ-（solv）+NO·］→RuⅡ-（solv）+NO·.

EPR 表征進一步證實了配合物1 可光敏釋放NO.如圖7 所示：在DMSO 中混合等摩爾量的配合物1 和NO 自由基捕獲劑c-PTIO（二者濃度均為50 μmol·L-1），在黑暗條件下，EPR 中顯示了c-PTIO典型的五重峰信號.氙燈照射1 h 后（光照強度為850 mW·cm-2），c-PTIO 的特征五重峰衰減并轉變為屬于亞氨基氮氧化物c-PTI 的特征七重峰.這可歸因于配合物1在光照下產生了NO自由基，與c-PTIO發生特征還原反應，將c-PTIO還原為c-PTI［8，25-26］.

圖7 配合物1的EPR光譜Fig.7 EPR spectra of complex 1

基于配合物1在光照下的吸收光譜以及EPR 譜的變化，隨后利用Griess 試劑測定了配合物1 和［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+、［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+的光敏NO 釋放量.如表1 所示，隨著光照時間的增加，所有配合物的光敏NO 釋放量均增加.其中，配合物1 的光敏NO 釋放量增加尤其顯著.光照10 min 時，配合物1 釋放的NO 量為4.23 μmol·L-1；光照60 min 時，釋放NO 量則達到18.48 μmol·L-1.顯然，同等條件下，配合物1 的光敏NO 釋放量遠大于其它兩個配合物（見表1），這可從Ru-N（NO）的結合能理論計算值得到合理解釋.

3 結語

合成了新的釕亞硝酰配合物［Ru（bpy）（4-CF3ppy）（CH3CN）NO］（PF6）2（配合物1），NMR 及MS確認其結構，并通過IR、CV 譜圖信息證實了結構中存在RuⅡ-NO+.光照下的吸收光譜以及EPR 變化表明：該配合物可光敏釋放NO，其釋放量通過Griess試劑測定得到.通過比較同條件下配合物1、［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+和［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+的光敏NO 釋放量以及它們的Ru-NO結合能理論計算值發現，吸電子基團的引入更有利于NO 的光敏釋放.這一結果為后續設計具有優良光敏NO 釋放能力的釕亞硝酰配合物提供了數據支持.