一株內切葡聚糖酶產生菌株的分離鑒定及其產酶條件優化

趙思卡，許倍滔，馮喆，王力，張建國，李曉華*

（1 中南民族大學 a.生命科學學院；b.微生物資源與利用湖北省工程技術研究中心，武漢 430074；2 江蘇神力生態農業科技有限公司，江蘇 宜興 214211）

纖維素酶是作用于纖維素中β-1，4-葡萄糖苷鍵的一組酶［1］，能夠使纖維素變為葡萄糖和纖維二糖［2-3］，根據酶功能不同主要分為3 種：外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶［4］，纖維素酶在各行業應用廣泛，在全球市場占據了酶產業份額的15%［5］.目前篩選到具有產纖維素酶能力的真菌主要來自木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和脈孢菌屬（Neurospora）等；細菌主要來自芽胞桿菌屬（Bacillus）、高溫單胞菌屬（Thermomonospora）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）等；放線菌主要有鏈霉菌屬（Streptomyces）、小單胞菌屬（Micromonospora）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）等［6］.秸稈主要成分為木質纖維素［7］，具有致密結構，在自然條件下難以被動物體降解和吸收［8］，纖維素酶在秸稈飼料中的應用可以起到增加飼料適口性和動物體吸收率等作用［9］.

本研究從健康的牛胃秸稈發酵物中分離內切葡聚糖酶產生菌株，并通過菌落特征、生理生化性質、16S rDNA 序列對比分析對菌株進行鑒定，進一步對菌株產酶條件進行研究，為內切葡聚糖酶在秸稈飼料中應用奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗樣品采自于湖南省長沙縣養殖場健康牛胃中的秸稈發酵物.

1.2 培養基

（1）基礎發酵培養基：葡萄糖5.0 g·L-1，酵母浸粉10.0 g·L-1，pH值自然.

（2）牛肉膏蛋白胨培養基：NaCl 5.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，牛肉膏3.0 g·L-1，瓊脂18.0 g·L-1，pH值7.0.

（3）CMC-Na培養基：羧甲基纖維素鈉10.0 g·L-1，酵母浸粉0.5 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，蛋白胨0.5 g·L-1，MgSO40.3 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，瓊脂15.0 g·L-1，pH 值自然.

1.3 實驗方法

1.3.1 產內切葡聚糖酶菌株的篩選

將牛胃秸稈發酵物在CMC-Na 液體培養基中37 ℃，180 r·min-1，富集培養24 h，取富集培養液1 mL，稀釋涂布于CMC-Na固體培養基中，37 ℃培養24 h，多次分離純化挑取單菌落.用牛津杯法［10-11］測定降解圈大小，實驗設置3次重復.

1.3.2 菌株特征、生理生化特性及16S rDNA 序列的擴增分析

將篩選得到的菌株劃線接種后，37 ℃培養12 h，革蘭氏染色［12］，鏡檢觀察.根據《常見細菌鑒定手冊》對菌株進行生理生化鑒定［13］.提取菌株基因組DNA，使用16S rDNA 通用引物［14］擴增.PCR 產物由武漢擎科生物公司測序，利用BLAST 對16S rDNA序列比對分析，使用MEGA7.0構建系統進化樹.

1.3.3 菌株產酶條件單因素優化

以培養時間、pH值、溫度、碳源、氮源、無機鹽作為影響因素，依次改變其中一個因素，研究各因子對SCUEC7菌株產內切葡聚糖酶的影響.

以1%接種量將SCUEC7 菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養基中，37 °C，180 r·min-1培養48 h，每隔4 h測定一次菌體量和酶活性；分別將pH值設置為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，37 °C、180 r·min-1培養12 h 測定菌體量和酶活性；分別將培養溫度設置為25、30、37、42、50、55 °C，180 r·min-1培養12 h，每個處理設置3 次重復，測定菌體量和酶活性.

以發酵培養基為基礎，分別將唯一碳源設置為濃度分別為10 g·L-1的蔗糖、麥芽糖、果糖、淀粉、魔芋粉；唯一氮源設置為濃度分別為10 g·L-1的胰蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白、尿素、硫酸銨；分別向培養基中添加濃度為1 g·L-1的K+、Cu2+、Na+、Mn2+、Mg2+，37 °C、180 r·min-1培養12 h，每個處理設置3 次重復，測定菌體量和酶活性.

按國際單位規定：在37 °C、pH 值7.0條件下，每分鐘催化CMC-Na水解產生1 μg葡萄糖所需要的酶量定義為1個內切葡聚糖酶酶活性單位（1 U）.

1.3.4 菌株產酶條件響應面法優化

在單因素實驗的基礎上，采用Box-Behnken 響應面設計，分析各因素的交互作用，構建二次響應面回歸模型，計算方差，得出最佳酶活性條件并驗證.響應面試驗各因素與水平如表1所示.

表1 響應面試驗因素與水平Tab.1 Analytical factors and levels for response surface methodology

2 結果與討論

2.1 產內切葡聚糖酶菌株篩選

將牛胃中秸稈發酵物在CMC-Na 液體培養基中富集培養，用生理鹽水進行梯度稀釋，涂布于CMCNa 固體培養基上，利用牛津杯法測定，結果如表2所示，11株菌株中纖維素降解圈在11.38～22.83 mm之間，G2 菌株直徑最小，為11.38 mm，G7 菌株直徑最大，為22.83 mm，將G7菌株命名為SCUEC7菌株.

表2 11株菌株降解圈大小Tab.2 Size of CMC-Na degradation circle of 11 strains

2.2 內切葡聚糖酶產生菌SCUEC7菌株的鑒定

將SCUEC7菌株接種到牛肉膏蛋白胨固體培養基上，菌落扁平，呈圓形，邊緣不規則，無光澤，呈現不透明黃白色，易挑起，無色素.SCUEC7 菌株生理生化特性測定結果：革蘭氏染色試驗、酪素利用試驗、甲基紅試驗、伏-普試驗、檸檬酸鹽利用試驗、淀粉利用試驗、丙酸鹽利用試驗和硝酸鹽還原試驗結果呈陽性，硫化氫試驗、枸櫞酸鹽利用試驗和吲哚試驗結果呈陰性.

以SCUEC7 菌株基因組DNA 為模板，PCR 法擴增菌株的16S rDNA 序列，利用BLAST 進行同源性序列比對，使用MEGA7.0 軟件N-J 法構建系統進化樹，結果如圖1 所示，SCUEC7 菌株與Bacillussubtilisstrain ATCC 6015 相似度達到99%，結合SCUEC7 菌株形態特征、生理生化特性，初步鑒定SCUEC7菌株為枯草芽胞桿菌.

圖1 基于16S rDNA 的SCUEC7菌株系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of SCUEC7 strain based on 16S rDNA

2.3 單因素實驗優化產酶條件

2.3.1 培養時間

以1%接種量將SCUEC7 菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養基中，結果表明（圖2），培養時間在0～12 h范圍內，菌株生長量和酶活性隨時間的增加而增加；培養時間在12～48 h 范圍內，菌株生長量和酶活性隨時間的增加而下降.

圖2 培養時間對SCUEC7菌株生長和產酶活性的影響Fig.2 Effects of culture time on the growth and enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.2 pH值

以1%接種量將SCUEC7 菌株接種到不同初始pH 值的牛肉膏蛋白胨培養基中，培養12 h 后，pH 值在2.0～6.0 范圍內，菌株的生長量和內切葡聚糖酶活性隨pH 值的增加而增加（圖3）；pH 值在6.0～11.0范圍內，菌株生長量和酶活性隨pH值的增加而逐漸降低.pH 值為6.0 時，SCUEC7 菌株產酶活性顯著高于其他實驗組（P＜0.05）.結果表明，pH 值為6.0 時，枯草芽胞桿菌SCUEC7 菌株生長量和酶活性較高.

圖3 pH值對SCUEC7菌株生長和產酶活性的影響Fig.3 Effects of pH value on the growth and enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.3 溫度

培養溫度在25～37 °C 范圍內，菌株生長量和酶活性隨培養溫度的升高而增加（圖4）；培養溫度在37～55 °C 范圍內，菌株生長量和酶活性隨溫度的升高而下降.溫度為37 °C 時，SCUEC7 菌株產酶活性顯著高于其他實驗組（P＜0.05）.因此，培養溫度為37 °C 時，枯草芽胞桿菌SCUEC7菌株生長量和酶活性較高.

圖4 培養溫度對SCUEC7菌株生長和產酶活性的影響Fig.4 Effects of culture temperature on the growth and enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.4 碳源

當以麥芽糖作為碳源時（圖5），枯草芽胞桿菌SCUEC7 菌株的內切葡聚糖酶活性較高，除與葡萄糖、果糖實驗組差異不顯著外，顯著高于其他三個實驗組（P＜0.05）.結果表明，麥芽糖為碳源時，枯草芽胞桿菌SCUEC7菌株的內切葡聚糖酶活性較高.

圖5 不同碳源對SCUEC7菌株生長和產酶活性的影響Fig.5 Effects of different carbon sources on the growth and enzyme production of SCUEC7 strain

將培養基中的麥芽糖濃度分別設為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g·L-1的梯度，培養12 h 后發現（圖6），麥芽糖濃度在5.0～20.0 g·L-1范圍內，酶活性從203.8 U·mL-1增加到242.4 U·mL-1，麥芽糖濃度在20.0～30.0 g·L-1范圍內，酶活性從242.4 U·mL-1下降 到198.0 U·mL-1.麥芽糖濃度為20.0 g·L-1時，SCUEC7 菌株產酶活性顯著高于其他實驗組（P＜0.05）.所以麥芽糖濃度為20.0 g·L-1時，枯草芽胞桿菌SCUEC7菌株的內切葡聚糖酶活性較高.

圖6 不同濃度麥芽糖對SCUEC7菌株產酶活性的影響Fig.6 Effects of different concentration maltose on enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.5 氮源

當胰蛋白胨作為唯一氮源時，SCUEC7 菌株的內切葡聚糖酶活性顯著高于其他五個實驗組（P＜0.05）.結果表明：胰蛋白胨為氮源時，枯草芽胞桿菌SCUEC7菌株的內切葡聚糖酶活性較高（圖7）.

圖7 不同氮源對SCUEC7菌株產酶活性的影響Fig.7 Effects of different nitrogen sources on enzyme production of SCUEC7 strain

將胰蛋白胨濃度分別設置成5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g·L-1的濃度梯度，培養12 h 后，測定內切葡聚糖酶活性，結果如圖8所示：胰蛋白胨的濃度在5.0～15.0 g·L-1范圍內，酶活性由198.0 U·mL-1增加到222.0 U·mL-1，胰蛋白胨的濃度在15.0～30.0 g·L-1范圍內，酶活性由222.0 U·mL-1下降到185.1 U·mL-1.胰蛋白胨濃度為15.0 g·L-1時，SCUEC7 菌株產酶活性顯著高于其他實驗組（P＜0.05）.結果表明，胰蛋白胨濃度為15.0 g·L-1時，枯草芽胞桿菌SCUEC7菌株的內切葡聚糖酶活性較高.

圖8 不同濃度胰蛋白胨對SCUEC7菌株產酶活性的影響Fig.8 Effects of different concentration tryptone on enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.6 金屬離子

以1%接種量將SCUEC7 菌株分別接種到添加1.0 g·L-1的Na+、K+、Mn2+、Cu2+和Mg2+離子的基礎發酵培養基中，培養12.0 h后（圖9），添加Mn2+的實驗組，SCUEC7 菌株的內切葡聚糖酶活性顯著高于其他四個實驗組（P＜0.05）.因此，添加Mn2+，枯草芽胞桿菌SCUEC7菌株的內切葡聚糖酶活性較高.

圖9 不同金屬離子對SCUEC7菌株產酶活性的影響Fig.9 Effects of different metal ions on the growth of SCUEC7 strain

將Mn2+濃度分別設置成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g·L-1的梯度，培養12.0 h 后，測定內切葡聚糖酶活性，結果如圖10所示，Mn2+濃度在0.5～1.5 g·L-1范圍內，酶活性由311.6 U·mL-1增長到354.3 U·mL-1，Mn2+濃度在1.5-3.0 g·L-1范圍內，酶活性由354.3 U·mL-1下降到310.6 U·mL-1.Mn2+濃度為1.5 g·L-1時，SCUEC7菌株產酶活性顯著高于其他實驗組（P＜0.05）.

圖10 不同濃度Mn2+對SCUEC7菌株產酶活性的影響Fig.10 Effects of different concentration Mn2+ on the growth of SCUEC7 strain

2.4 響應面試驗優化結果

2.4.1 響應面設計與結果

選取培養時間、pH 值、麥芽糖含量3 個獨立變量為考察因素，設計響應面試驗，測定每組實驗菌株酶活性，作為響應面法分析的依據，表3為響應面試驗設計及結果.

表3 響應面各因素水平與產酶活性Tab.3 Factor level of response surface methodology and enzyme activity

2.4.2 響應曲面模型構建及回歸方程結果顯著性分析

使用Design-Expert 10 軟件分析表4 實驗數據，建立多元回歸模型.擬合培養時間（A）、pH 值（B）、麥芽糖含量（C）之間的二次多項回歸方程如下：酶活Y=408.78-3.38A-3.22B-1.67C-2.40AB-15.97AC+0.042BC-22.73A2-23.89B2-10.11C2.

表4 回歸模型方差分析Tab.4 Regression model and analysis of variance

如表4 所示，模型的F=11.7，模型P=0.0019＜0.01，表明模型極為顯著.R2=0.9377，表明該方程與對應的響應值吻合程度達93.77%.由F檢驗可知影響菌株SCUEC7 產酶活性的主次因素為培養時間＞pH 值＞麥芽糖含量.通過Design-Expert 10軟件計算得出：當預測的響應值最大時，3 個因素所對應的最佳值是11.9 h，初始pH 值5.9，麥芽糖含量19.8 g·L-1.在此條件下所預測的最大酶活為 409.0 U·mL-1.

2.4.3 響應曲面交互作用及結果分析

培養時間、pH、麥芽糖含量3 個因素對SCUEC7菌株產酶活性影響的響應面圖和等高線圖見圖11.由圖可知，pH 值、培養時間之間存在較弱的交互作用；pH值、麥芽糖濃度之間和培養時間、麥芽糖濃度之間存在很強的交互作用.

圖11 3因素對菌株產酶活性的交互影響Fig.11 The interaction effect of 3 factors on enzyme-producing activity of the strain

2.4.4 模型檢驗試驗結果

將SCUEC7菌株最佳產酶活條件調整為培養時間11.9 h，初始pH 值6.0，麥芽糖含量19.8 g·L-1，此條件下進行3 組平行實驗，所得平均酶活力為409.2 U·mL-1，與預測值409.0 U·mL-1差距不大，表明該結果符合客觀實際.所以采用響應面法優化SCUEC7產內切葡聚糖酶條件可行.

3 結語

本研究從湖南省長沙縣養殖場健康牛胃秸稈發酵物中分離得到枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis）SCUEC7 菌株，通過響應面分析，預測最優產酶條件下培養時間為11.9 h，初始pH 值為5.9，麥芽糖含量為19.8 g·L-1.

在動物飼料加工過程中，內切葡聚糖酶可高效降解秸稈飼料中的纖維素［15］，增加動物體營養物質利用率［16-18］.陳龍等研究Bacillusvelezensis157 發現，以堿處理玉米秸稈和豆粕的質量比為1.0∶1.0，底物與水分質量比為1.0∶0.5，于37 °C 培養溫度下發酵24 h后，其內切葡聚糖酶活性為56.83 U·mL-1［19］；何楠等從玉米秸稈中分離出一株枯草芽胞桿菌BS-DX4，在最適生長溫度 40 °C，最適pH 值7.0 條件下，該菌株胞外分泌液內切葡聚糖酶最高活性為358.3 U·mL-1［20］，其最高酶活低于SCUEC7 菌株，最適pH 值與最適溫度高于SCUEC7 菌株；馬振剛等從自然界分離出一株蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereusstrain CQNUX 3-1，在70 °C、pH 值8.0 條件下該菌株胞外分泌液內切葡聚糖酶最高活性為107.7 U·mL-1［21］，最高酶活低于SCUEC7 菌株，最適pH 值與最適溫度高于SCUEC7.雖然研究者已從芽胞桿菌中分離出多株產內切葡聚糖酶菌株，但遠不能滿足工業生產對產酶菌株需求和酶性質的要求，產內切葡聚糖酶菌種資源篩選備受關注.本研究為內切葡聚糖酶的工業化生產提供了微生物資源.