利用指紋圖譜和網絡藥理學預測牽牛子抗炎Q-marker

李娟，彭洪兵，向玉林，劉雪年，孫媛，詹志來

（1 湖北中醫藥大學 藥學院，武漢 430065；2 中國中醫科學院 中藥資源中心/道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100007）

牽牛子，又名黑丑、白丑、二丑等，為旋花科植物裂葉牽牛Pharbitisnil（L.）Choisy或圓葉牽牛Pharbitis purpurea（L.）Voigt 的干燥成熟種子，始載于《名醫別錄》.其味苦性寒，有毒，具有瀉水通便、消痰滌飲、殺蟲攻積的功效［1］.牽牛子主要含有酚酸類、樹脂苷類、木脂素類、萜類、脂肪油類等化學成分.據報道，樹脂苷類是牽牛子瀉下作用的主要活性成分，但是該類成分結構復雜多樣，研究起來較為困難.目前中國藥典對其質量控制的方法主要為醇浸出物測定，該方法并不能較好地控制牽牛子的質量.

中藥質量標志物是劉昌孝院士于2016 年針對中藥質量標準與質量控制提出的概念［2-3］.同時，網絡藥理學能從系統層面揭示中藥對機體調控的網絡作用機制，反映出有效成分與靶點蛋白之間的作用關系，具有系統性與整體性的特點［4］.由于目前網絡藥理學缺乏規范的技術引領，分析結果存在諸多問題，數據采集不規范，預測結果差異大，缺乏驗證等等，因而本文根據《網絡藥理學評價方法指南》按照規范操作預測牽牛子質量標志物［5］.本研究通過牽牛子指紋圖譜、主要成分測定和網絡藥理學相結合的方法分析預測牽牛子的抗炎Q-marker，并通過分子對接和抗炎活性驗證，為全面控制牽牛子的質量，進一步研究牽牛子的作用機制提供參考.

1 儀器與材料

高效液相色譜儀（1260 Infinity II，美國安捷倫）；色譜柱（Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1 ×50 mm，1.8-Micron）；電子分析天平（BP211D，德國Satorius）；超聲清洗器（KUDOS SK250H，上?？茖В?

新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C（成都瑞芬）；綠原酸（中國食品藥品檢定研究所）；異槲皮苷（上海麥克林）；咖啡酸（成都德思特）.超純水；甲醇（上海麥克林，色譜純）；其余試劑為分析純.DMEM 高糖培養基（北京索萊寶）；胎牛血清（FBS，四季青）；二甲基亞砜（DMSO，國藥集團）、四甲基偶氮唑藍（MTT，上海麥克林）；一氧化氮檢測試劑盒（碧云天）.小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 由華中科技大學同濟醫學院免疫學教研室饋贈.牽牛子共16批收集于各地藥材市場或企業，藥材來源信息見表1，經湖北中醫藥大學陳科力教授鑒定為旋花科植物裂葉牽牛Pharbitisnil（L.）Choisy 或圓葉牽牛Pharbitispurpurea（L.）Voigt的干燥成熟種子.

表1 16批牽牛子藥材樣品來源信息Tab.1 Source information of 16 batches of Pharbitidis Semen medicinal materials

2 實驗方法

2.1 色譜條件

流動相：0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脫0～2 min，10%～30% B；2～10 min，30%～65% B；10～14 min，65%～80% B；14～15 min，80%～100%B；15～17 min，100%～10% B.柱 溫25 ℃；流 速0.25 mL·min-1；檢測波長296 nm；進樣量1 μL.

2.2 樣品溶液的制備

稱取不同批次牽牛子Q1～Q16 樣品粉末（過四號篩）1.0092、1.0096、1.0020、1.0065、1.0073、1.0096、1.0076、1.0023、1.0074、1.0041、1.0071、1.0017、1.0061、1.0054、1.0064、1.0011 g，置于100 mL錐形瓶中，加入25 mL 的70%甲醇，稱重，超聲處理1 h（40 kHz，240 W），自然放置冷卻后稱定重量，用70%甲醇補足損失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即得.

2.3 方法學考察

稱取牽牛子樣品（Q2），按照2.2 方法制備樣品，按照2.1的色譜條件進樣.

精密度試驗：連續進樣6次，計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面的RSD.

穩定性試驗：分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣，計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD.

重復性試驗：平行制備6份樣品進樣，計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD.

加樣回收實驗：牽牛子（Q2）6份樣品，分別加入7種標準品，結果代入回歸方程計算出7種化合物的回收率和RSD.

2.4 指紋圖譜的建立

取牽牛子供試品一共16 批，按照2.2 方法制備樣品溶液，按照2.1 的色譜條件進行進樣檢測，并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”進行相似度評價.

分別以對照圖譜S1 為參照，對16 批牽牛子黑白丑供試品進行相似度評價.

2.5 主成分分析

利用SPSS 21.0軟件進行主成分分析.

2.6 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）

以VIP＞1 為篩選標準，篩選出影響牽牛子藥材成分差異的標志性成分.

2.7 多成分含量測定

2.7.1 線性關系考察試驗

取新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸C 對照品1.10、2.02、2.66、1.52、1.21 mg，用甲醇溶解，配成混合對照品母液，將混合對照品母液逐級稀釋成5 個濃度，按照2.1 項下的色譜條件進樣，記錄色譜峰信息，繪制標準曲線（橫坐標為各對照品的濃度，縱坐標為峰面積值）.

2.7.2 含量測定

按照2.2 方法制備16 批牽牛子供試品溶液，按照2.1 色譜條件進樣，記錄色譜圖信息，將新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷和異綠原酸C 的峰面積數據代入上述線性方程，計算出藥材中的成分含量.

2.8 網絡藥理學分析

2.8.1 牽牛子化合物的靶點預測［6］

檢索Swiss Target Prediction 數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、中藥系統藥理數據庫（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中咖啡酸、新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、異槲皮苷7 個化合物，預測化合物作用的靶點；以probability＞0.1 為條件，篩選出靶點信息.搜索Uniprot 數據庫（http：//www.uniprot.org/），將預測出的靶點蛋白名稱輸入后，找到對應的基因名.然后整理各數據庫篩選出的靶點蛋白，將重復靶點除去.

2.8.2 蛋白相互作用（PPI）網絡分析

利用STRING 11.0 軟件（https：//string-db.org/cgi/input.pl），輸入 82 個選中的靶點，選擇人（homo sapiens），點擊確認，最高置信度選擇＞0.9，隱藏網絡中的單一節點，其他參數設置不變，得到 PPI 網絡圖.再利用Cytoscape 3.7.2 軟件選取藥物作用靶點，共得到 32個相關靶點.

2.8.3 功能富集分析與通路分析

利用David 6.8 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），輸入選中的32個靶點蛋白，物種選擇為人，選擇P值＜0.05、FDR＜0.05，進行 GO 功能和KEGG 通路富集分析.

2.8.4 構建成分-靶點-通路網絡［7］

將篩選得到的7 個成分、32 個靶點和6 條通路數據整理完成后導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建“成分-靶點-通路”網絡圖.

2.9 分子對接驗證分析與可視化

根據網絡藥理學成分與靶點之間的連接度選擇異綠原酸C（連接度最大）作為分子對接配體展示，核心靶點MMP1、MMP2、MMP13、AKR1B1、AKR1B10 作為受體，在Pubchem 數據庫下載配體的3D結構圖，在RSCB PDB 數據庫下載受體的蛋白3D結構圖.利用AutoDockTools1.5.6軟件對受體和配體進行去水、加氫等處理，將配體與受體進行分子對接計算，導出配體與受體之間的結合能.

2.10 牽牛子標志物的抗炎活性驗證

2.1 0.1 細胞培養

RAW264.7 細胞于37 ℃、5% CO2環境下，在含有10% FBS 和 1%雙抗的高糖 DMEM 培養液中培養.當細胞生長至80%時，進行傳代并用于后續實驗.

2.1 0.2 MTT 法檢測 RAW264.7 細胞存活率

取對數期 RAW264.7 細胞，以 1 × 104個/ 孔密度接種于96孔板中，培養24 h 后，吸出培養液，加入用DMEM 培養液配制的各濃度藥物 100 μL，使牽牛子各單體化合物的濃度分別為50、100、200、400 μM，牽牛子提取物的濃度為50、25、12.5、6.25 μg/mL，每個濃度設置 6 個復孔.24 h 后棄去含藥培養液，每孔加入含 5 mg/mL MTT 的高糖 DMEM 培養液 100 μL 并繼續培養 4 h，吸出培養液，每孔加入100 μL DMSO，震蕩10 min 后用酶標儀于 490 nm 波長測定各孔的吸光度（OD）值.

2.1 0.3 Griess法檢測RAW264.7細胞NO分泌量

將RAW264.7 細胞以 2 × 105個/ 孔的密度接種于24 孔板中，培養24 h 后棄去舊培養液，分別加入用DMEM 培養液配制的各濃度藥物（根據 MTT 細胞活力實驗選擇濃度），并設置空白組與模型組（LPS 組），每組3 個復孔.藥物作用于細胞 2 h 后，除空白組外，其余各組加入LPS使其終質量濃度為 0.5 μg/mL.繼續培養24 h 后，收集細胞培養上清，使用NO 檢測試劑盒按照 Griess 法進行檢測.

3 結果與分析

3.1 方法學考察

精密度試驗：結果共有峰相對保留時間RSD 為0.05%～0.43%、相對峰面積RSD 為0.61%～2.72%，表明儀器精密度良好.

穩定性試驗：結果共有峰相對保留時間RSD 為0.01%～0.50%、相對峰面積RSD 為0.21%～4.01%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好.

重復性試驗：結果共有峰相對保留時間RSD 為0.06%～0.90%、相對峰面積RSD 為0.51%～3.90%，表明該方法重復性良好.

加樣回收實驗：結果代入回歸方程計算出7 種化合物的回收率為104.96%、96.85%、101.67%、97.25%、102.60%、97.24%、98.15%.RSD 分別為2.62%、2.47%、2.67%、2.80%、2.87%、2.97%、2.74%.表明回收效果好.

3.2 指紋圖譜的建立

3.2.1 指紋圖譜分析

16 批牽牛子藥材指紋圖譜和混合對照品色譜圖分別見圖1和圖2.

圖1 16批牽牛子藥材指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of 16 batches of Pharbitidis Semen

圖2 混合對照品色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed reference substance

3.2.2 相似度評價

結果顯示部分樣品相似度小于0.6（表2）.由此可見，牽牛子樣品雖然來源復雜，但7個共有成分在16批樣品中均穩定存在.

表2 16批牽牛子供試品與對照圖譜的相似度Tab.2 Similarity of 16 batches of Pharbitidis Semen test substance and control chromatogram

3.3 主成分分析

前3 個主成分（2、5、3 號峰）包含了7 個共有成分的91.177%的信息（表3）.說明這3 個成分能夠概括共有峰總數據的絕大部分信息.碎石圖見圖3.

圖3 牽牛子主成分分析碎石圖Fig.3 Pharbitidis Semen principal component analysis gravel diagram

表3 牽牛子供試品主成分特征值及累計方差貢獻率Tab.3 Principal component eigenvalues and cumulative variance contribution rate of Pharbitidis Semen test products

3.4 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）

一共標記出3個貢獻較大的成分，依次為2、5、3號色譜峰，分別為化合物綠原酸、異綠原酸A和咖啡酸，與主成分分析結果一致（圖4）.

圖4 牽牛子樣品PLS-DA 模型中 7 個色譜峰的 VIPFig.4 VIP of seven chromatographic peaks in the PLS-DA model of the Pharbitidis Semen sample

3.5 多成分含量測定

線性關系考察試驗結果表明，5 種成分在一定范圍內線性關系良好.標準曲線結果見表4.

表4 牽牛子5種成分的線性關系Tab.4 Linear relationship of the five components of Pharbitidis Semen

藥材中的5種成分含量測定結果見表5.

表5 牽牛子中5種成分含量測定結果（n=3）Tab.5 Determination results of five components in Pharbitidis Semen（n=3）

3.6 網絡藥理學分析

3.6.1 牽牛子化合物的靶點預測

最終得到與7個化合物相關的82個靶點蛋白.

3.6.2 蛋白相互作用（PPI）網絡分析

PPI 網絡圖（圖5）和 32個相關靶點（圖6）.

圖5 PPI網絡圖Fig.5 PPI network diagram

圖6 牽牛子“成分-靶點-通路”網絡Fig.6 “Component-target-pathway” network of Pharbitidis Semen

3.6.3 功能富集分析與通路分析

GO分析結果提示BP顯著富集在炎癥反應的調節、細胞外基質拆卸、MAP 激酶活性的正調控、平滑肌細胞增殖的正向調控、膠原分解代謝過程、以及對糖皮質激素、脂多糖、缺氧的反應等過程，其中炎癥反應的調節功能和調節平滑肌收縮的功能可能分別與牽牛子消痰滌飲、瀉水通便的功效有關；MF主要富集在內肽酶活性、酶結合功能；CC 主要富集在質膜.具體信息見表6.富集到的6 條通路，為雌激素信號通路、癌癥途徑、TNF信號通路、膀胱癌、癌癥的蛋白聚糖、血清素能突觸，表明這6個通路可能是32 個靶點干預疾病的主要途徑（表7）.其中TNF信號通路和膀胱癌信號通路可能分別與牽牛子抗菌消炎、利尿的作用有關.牽牛子有刺激子宮的藥理作用［8］，對離體兔腸及離體大鼠子宮有興奮作用，這可能與雌激素信號通路有關.

表6 基因生物學過程Tab.6 Gene biology process

表7 主要作用靶點的通路富集分析Tab.7 Pathway enrichment analysis of main targets

3.6.4 構建成分-靶點-通路網絡

以成分、靶點、通路之間的連接度為參考（圖6），發現異綠原酸B 和異綠原酸C 的連接度較高，可能是發揮作用的主要成分；MMP1、MMP2、MMP13、AKR1B1、AKR1B10相關的成分通路相對較多，這5個靶點蛋白可能是牽牛子發揮作用的關鍵靶點；6 條信號通路的連接度相差不大，都有可能是牽牛子的潛在Q-marker關鍵信號通路.

3.7 分子對接驗證分析與可視化

異綠原酸C與MMP1、MMP2、MMP13、AKR1B1、AKR1B10 的結合能依次為-8.6、-5.5、-9.8、-9.6、-8.5 kcal/mol，結合能越小，配體與受體之間越容易結合.5個配體與化合物結合能均較小，表明化合物與關鍵靶點之間有較強的結合活性，并運用Pymol3.2軟件進行可視化處理，結果見圖7.

圖7 靶點與異綠原酸C分子對接圖Fig.7 The docking diagram of the target and isochlorogenic acid C molecule

抗炎Q-Marker 異綠原酸C 與MMP2、MMP13 的結合能分別為-9.8 kcal/mol 和-9.6 kcal/mol，遠低于-4.0 kcal/mol［9］，這說明配體有較強的生物活性.

3.8 牽牛子標志物的抗炎活性驗證

3.8.1 MTT 法檢測 RAW264.7 細胞存活率

結果表明，25 μg/mL 以下的牽牛子提取物和7個單體成分在各濃度下細胞存活率均大于85%，表明提取物和7 個單體成分無明顯的細胞毒副作用（圖8）.

圖8 牽牛子提取物和各單體對RAW264.7細胞存活率的影響Fig.8 Effects of Pharbitidis Semen extract and each monomer on the viability of RAW264.7 cells

3.8.2 Griess法檢測RAW264.7細胞NO分泌量

結果表明，牽牛子提取物（25 μg/mL）可顯著抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞產生NO，抑制率達到269%（圖9）.濃度為100 μM 時，牽牛子各單體均可抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞產生NO，其中咖啡酸、異綠原酸B的抑制效果較好，均大于50%.

圖9 牽牛子提取物和各單體對LPS誘導的RAW264.7細胞產生NO的影響Fig.9 Effects of Pharbitidis Semen extract and each monomer on NO production in LPS-induced RAW264.7 cells

4 討論

本研究通過UPLC 建立了牽牛子的指紋圖譜，指認了牽牛子中7 個共有成分，通過主成分和偏最小二乘法判別分析等找出3 個主要成分綠原酸、咖啡酸和異綠原酸A.綠原酸具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、降血糖和免疫調節等多方面的生物活性［10］，有利尿補腎的功效［11］，能顯著增加腸胃蠕動，促進胃液分泌.研究發現綠原酸是通過調控絲裂原活化蛋白激酶/ ERK/c-Jun 氨基末端激酶信號通路來降低組織的炎癥反應［12］.咖啡酸具有抗氧化、抗炎、免疫調節、抗菌等多種藥理作用［13］，可以抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、單核細胞增生利斯特菌的生長，具有一定的毒性，可能與牽牛子殺蟲功效有關.咖啡酸等小分子酚酸類成分的自氧化過程中會產生含1，4-苯并二噁烷結構的化合物，此類化合物具有很好的抗炎活性［12］.綠原酸和咖啡酸中的兒茶酚基團可以清除細胞內活性氧，通過抑制人腸上皮細胞中PKDNF-κB 信號來抑制H2O2誘導的IL-8 的產生，從而抑制嚴重的細胞損傷和炎癥性腸道疾病.新綠原酸為綠原酸的同分異構體，具有抗炎、抗氧化、增強免疫等作用.楊海星［14］研究發現，新綠原酸對由LPS 誘導的RAW264.7 細胞具有明顯抗炎作用，其機制可能與下調P-NF-κbp65 有關.異綠原酸A、B、C 是金銀花中有機酸類天然活性成分，在其他植物中也廣泛存在［15-18］.異槲皮苷為黃酮醇苷類化合物，具有抗炎、抗病毒、降血壓等多種藥理活性，能在抗Cd2+誘導的腎臟和肝臟毒性中發揮重要作用.異槲皮苷能夠抑制血管緊張素轉化酶，起到抗高血壓的功效，并且具有利尿和保鉀的功能［16］.綜上，7 種化合物具有抗菌消炎、利尿通便等功效，與牽牛子的傳統功效相似，可作為牽牛子的潛在抗炎Q-marker.

結合牽牛子的功效，運用網絡藥理學分析篩選出與7個化學成分相關的32個靶點、6條通路.分子對接分析驗證其中異綠原酸C 具有很好的生物活性，由于7 個化合物均做分子對接驗證，數據繁多，而7 個化合物結構相似，與受體的結合能也應該相似，本文未一一驗證.抗炎活性實驗驗證牽牛子提取物以及7種化合物均可抑制LPS誘導的RAW264.7細胞產生NO，具有很好的抗炎效果，可能是通過上述6 條通路相互作用于32 個蛋白靶點起作用，進一步說明這7種化合物可作為牽牛子的抗炎Q-marker.

Q-marker 的“五原則”的特點包含特有性、有效性、可測性、傳遞與溯源性、和處方配伍，反映了中藥的安全性和有效性，有利于中藥質量溯源體系建設和全程質量控制［17］.雖然文獻報道牽牛子苷為牽牛子瀉下和殺蟲等的有效成分，但研究發現樹脂糖苷類化合物牽牛子苷檢測難度大，不具備可測性，并不適合作為Q-marker.同時由于樣品本身來源復雜，指紋圖譜分析發現調查的16批牽牛子樣品相似度較低，指紋圖譜也不太適合用于牽牛子的質量控制.但結合含量測定和網絡藥理學結果，本研究篩選出的7 個成分在牽牛子各批次樣品中穩定存在，在生品和炮制品中均能檢測出［18］，并具有相關的藥理活性.因而，本研究篩選出的7個化合物雖不是牽牛子中的特有成分，但也滿足化學性質與藥理作用也與牽牛子的傳統藥性和功效基本一致的條件，且含量較高、穩定，檢測識別方法簡單快捷，具備有效性、可測性、可傳遞性等特點，適合作為牽牛子的抗炎Q-marker.