近紅外光協同免疫療法增強抗腫瘤效果研究進展

祝紅達，楊朝波，劉閱，張子林，馬凱，關業能

（湖北工業大學 a.生物工程與食品學院；b.發酵工程教育部重點實驗室；c.工業微生物湖北省重點實驗室，武漢 430068）

傳統的腫瘤治療方法（手術、化療和放療）在本質上都是局部直接根除腫瘤細胞和組織，雖有一定的療效但通常難以治愈，特別是化療由于靶向性差造成的副作用嚴重，還會導致免疫系統功能的降低.近年來腫瘤免疫療法得到極大的發展，如免疫檢查點抑制劑、細胞因子、癌癥疫苗等，其通過活化免疫細胞激活免疫系統達到殺死腫瘤細胞的目的［1］.2015 年美國食品藥品監督管理局（FDA）批準將免疫檢查點抑制劑用于非小細胞肺癌的治療，使其成為最耀眼的抗癌明星［2］，但患者的實際響應率偏低，部分患者出現較嚴重的免疫相關不良事件（irAEs）［3］.為了降低免疫療法的副作用，許多研究試圖用多種方法聯合免疫療法用于腫瘤的治療，其中光療特別是近紅外光（650～1700 nm）由于其優異的光物理學參數在醫學領域的診斷與治療方面被廣泛關注.首先，近紅外光以非電離方式進行輻射，不會對組織造成明顯的傷害及遺傳毒性［4］；其次，用于近紅外的設備與輻射設備相比要便宜得多［5］；最后，近紅外激光在醫學領域已有數十年的發展，其安全性和方法理論有一定的保障［6］，這些優勢給予近紅外光以巨大的臨床應用潛能.近紅外光聯合免疫療法策略不僅增強了原發腫瘤細胞的凋亡，遠端腫瘤和腫瘤轉移也被明顯抑制［7］.本文對近年來近紅外光協同免疫療法增強抗腫瘤的設計策略、應用、現存問題及未來展望進行綜述.

1 近紅外光協同免疫療法的設計策略

1.1 光熱療法協同免疫治療

光熱治療（PTT）是基于能夠將光能轉換為熱能的光熱轉化劑的一種治療方法，其靶向腫瘤細胞后，在近紅外光的照射下光熱轉化劑吸收光子能量使其從基態單重態轉化為激發單重態，激發的光熱試劑通過與周圍分子之間的碰撞返回基態，動能的增加會導致腫瘤部位周圍微環境溫度升高而消融腫瘤細胞［8］，造成腫瘤細胞的DNA 及蛋白質等的不可逆損壞而抑制腫瘤細胞的生長［9］；同時腫瘤細胞凋亡產生免疫原性細胞死亡（ICD），釋放損傷相關的分子模式（DAMPs）［10］，刺激樹突狀細胞（DC）的成熟并激活殺傷性的免疫細胞、提高相關細胞因子表達水平［11］（圖1）.目前研究較多的光熱轉化劑有CuS［12］、金納米粒子［13］、有機聚合物［14］及小分子染料［15］等.

圖1 光熱治療協同免疫治療的原則概述［11］Fig.1 Overview of the principles of photothermal therapy combined with immunotherapy［11］

佐劑的加入可以改善免疫細胞的功能［16］，因此PTT與免疫佐劑的聯合使用成了近年來治療遠端腫瘤的研究熱點.Guo 等［11］設計了基于殼聚糖包裹的可生物降解中空CuS納米顆粒包載免疫佐劑寡聚脫氧核苷酸（CpG），該納米粒子治療平臺結合了PTT和免疫治療，光熱消融誘導的腫瘤細胞死亡抑制腫瘤的生長，而免疫佐劑則增強宿主的抗腫瘤免疫.結果表明聯合光熱免疫治療比免疫治療或單獨光熱治療對初次治療和遠端未治療的腫瘤更有效.

PAN 等［17］選用抗原卵清蛋白（OVA）包裹小分子染料吲哚菁綠（ICG）構建OVA-ICG 納米疫苗并評價在動物實驗中腫瘤光熱免疫治療效果［18］.結果顯示該納米疫苗具有抗原載藥率高（80.8%）、產率高（＞90%）、近紅外吸收和熒光強、重復性好、穩定性好、生物相容性好等優點；在標記/跟蹤DC方面較靈敏，能夠協同光熱免疫治療腫瘤并有效地預防腫瘤.該策略為大規模、重復制備高抗原負載率的多功能納米疫苗用于腫瘤治療提供了一種較為簡便可靠的方法.

除免疫佐劑外，針對免疫檢查點抑制劑如PD-L1和抗CTLA4 抗體也可以極大地增強PTT 介導免疫反應［19-20］.原位自體癌癥疫苗（inCVAX）［21］由于抗原來自癌細胞本身，喪失了增值活性，保留了免疫原性，這使得其在聯合PTT 時對不同的癌癥均有療效［22］.將免疫佐劑和免疫檢查點抑制劑合用于PTT治療可綜合各自的優勢而產生協同作用［18］.

1.2 光動力療法協同免疫治療

光動力治療（PDT）被認為是癌癥的一種替代療法.光敏劑在光照條件下吸收光子變為激發電子態，能量發射為熒光、熱和/或其他形式的光物理能量，如產生自由基及其離子并將能量傳遞給腫瘤細胞部位的氧氣而產生具有細胞毒性的活性氧（ROS），特別是高活性的單線態氧（1O2）達到抗腫瘤目的［8］，這樣的特征使得其在癌癥的治療中發揮著重要的作用.在腫瘤部位PDT 介導腫瘤細胞對免疫的響應如圖2 所示［23］：首先在近紅外光的照射下產生大量的ROS 導致細胞凋亡，而凋亡的腫瘤細胞會募集單核細胞等具有清除功能的細胞同時誘導部分細胞因子的釋放，將單核細胞轉化為腫瘤相關巨噬細胞（TAM），而TAM 對小分子藥物、尺寸較大的顆粒等有一定的吞噬作用，這使得光敏劑在TAM 中富集成為可能［24］，在PDT 作用下，光敏劑將腫瘤部位的氧氣轉化為可以殺滅癌細胞的單線態氧（1O2），死亡的癌細胞作為抗原刺激免疫細胞的活化激活免疫反應.

圖2 光動力療法介導的免疫反應［23］Fig.2 photodynamic therapy mediated immune response［23］

將疫苗［25］、免疫檢查點抑制劑［26］、IDO 酶抑制劑［27］、酸性神經酰胺酶抑制劑［28］等用于抗腫瘤研究時發現，在PDT 作用下可以明顯激活免疫系統增強抗腫瘤活性.XU 等［29］設計一種基于上轉換納米顆粒（UCNPs）的多功能納米粒子UCNP-Ce6-R837，不僅可以用于近紅外誘導的PDT 直接殺傷腫瘤細胞，還可以通過觸發樹突狀細胞的成熟和細胞因子的分泌刺激免疫應答.這種基于UCNP-Ce6-R837 的PDT 結合臨床批準的CTLA4 免疫檢查點阻斷療法抑制調節性T 細胞（Treg）的活性，能夠有效地消除原發腫瘤，在免疫反應的作用下有效抑制遠端腫瘤；此外該光動納米粒子能誘導記憶T 細胞的成熟產生長期免疫記憶效應進而有效防止腫瘤的復發.該研究證明了以UCNP 為基礎的PDT 與腫瘤免疫治療相結合在消除原發腫瘤、抑制遠處腫瘤、防止腫瘤復發方面具有顯著的協同治療效果.

在臨床應用方面，PDT 從1970 年開始用于臨床治療，因其良好的重現性、選擇性、低毒性以及微創等特點而被FDA 批準用于晚期的癌癥患者［30］，推薦用于不能手術的癌癥患者［31］.

1.3 光化學療法協同免疫治療

在低能量的近紅外光作用下硅酞菁衍生物IRDye700DX（IR700）發生光致反應，能引起細胞膜的應激反應，使跨膜靶蛋白損傷而降低細胞膜的完整性導致細胞死亡［32］.NAGAYA 等［33］構建基于近紅外光免疫治療（NIR-PIT）的復合體（APC）IR700，其在690 nm 近紅外光的激活下可增強抗腫瘤的治療.采用近紅外光直接照射腫瘤細胞使其膨脹致細胞膜破裂，觸發ICD 進而激活熱休克蛋白70 和90（HSP70/90）等應激物及死亡信號鈣網蛋白（CRT）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）和高遷移率族蛋白B1（HMGB1）［34］，這些物質協同促進DC 的成熟，隨后在DC 的提呈作用下激發免疫反應［35］，誘導CD8+T細胞的增值殺死腫瘤細胞（圖3）.復合體中光活性的染料IR700 可與多種抗體結合，其本身無毒性且易通過尿液排出體外［34］.復合物中抗體的靶向性使得NIR-PIT 具有很強的選擇性，這也是該方法與傳統腫瘤治療方法的最大不同點，不會對正常的非靶向細胞造成明顯的副作用［36］.

圖3 NIR-PIT誘導的免疫原性細胞死亡激活免疫反應［35］Fig.3 NIR-PIT induced immunogenic cell death activates the immune response［35］

近紅外光免疫治療已經在靶向于EGFR、HER2、GPC3 等腫瘤治療方面成功應用［33］.NAGAY 等［37］描述了NIR-PIT 的有效性，將靶向表達間皮素的A431/H9 細胞的人源化抗體（hYP218）偶聯到光吸收劑IR700上并與細胞共同孵育.體外實驗表明hYP218-IR700 有細胞特異性殺傷作用.荷瘤小鼠動物實驗結果表明hYP218-IR700 具有較高的腫瘤聚集率和較高的腫瘤背景比（TBR），近紅外光照射組的腫瘤生長受到明顯的抑制.

1.4 近紅外熒光成像協同免疫治療

如1.2 所述，光敏物質在近紅外光照條件下吸收光子變為激發電子態后能夠將能量發射為熒光或磷光，這使得近紅外成像可以和多種光譜、多種治療方法聯合使用對復雜的免疫系統成像［38］.與可見光相比，近紅外光特別是第二近紅外（NIR-II）具有更高的信號背景比（SBR）、更高的靈敏度以及成像的高分辨率等［39］，這些特性賦予近紅外光以優異的成像能力.因此采用合適的熒光團標記抗體［40］，疫苗［41］，免疫細胞（T細胞［42］，B細胞［43］，巨噬細胞［38］，DC 細胞［44］，NK 細胞［45］）制備成探針，再利用近紅外熒光成像可以實現免疫相關生物分子的實時監控［46］，可以確定它們的生物分布及表達水平從而評估治療效果，為治療過程的安全性提供保障.

WAN 等［47］將熒光團（IR-BGP6）通過共價結合的方式結合到程序性細胞死亡配體-1 單克隆抗體（PD-L1 mAb）上制備成探針（anti-PD-L1-BGP6），分析了不同細胞系內PD-L1 的表達水平，實現了非侵入性的體內分子成像.腫瘤與正常組織信號背景比高達≈9.5，與在組織內非特異性蓄積的NIR-II 熒光團相比，IR-BGP6 標記的PD-L1 顯著提高分子成像性能，并且該熒光團能夠在腎臟快速排泄（在注射后10 h 內一般91%通過尿排出）不會引起蓄積毒性.

1.5 多種光療協同免疫的復合療法

多種光療協同免疫的復合療法是當前研究的熱點，一方面是復合療法在發揮療效的同時也能大大降低對正常組織的傷害，另一方面得益于納米技術和材料科學的飛速發展，基于納米材料的光療可能達到最佳的治療效果.單一的光照治療方式可能無法完全殺死腫瘤細胞而導致腫瘤細胞轉移，多種光療協同作用下可以產生足夠的抗原物質［48］，再輔以免疫治療可以進一步增強抗腫瘤活性同時防止復發.多種光療協同治療可以在完全消融癌細胞的前提下使PTT更溫和地升溫而避免對正常組織的損傷，降低PDT 光敏劑可能帶來的毒副作用，可視化治療過程控制治療效果及避免對正常細胞的損害.HAN 等［49］開發了一種超低強度近紅外光同步激活的協同Chemo/PTT/PDT 納米平臺，該納米平臺由高發射上轉換（UC）核、二氫卟吩e6（Ce6）光敏劑和抗癌藥物鹽酸阿霉素（DOX）共負載于介孔二氧化硅（MS）殼中組成，聚乙二醇修飾的石墨烯（PGO）作為光熱試劑和智能開關促進藥物的釋放.低于皮膚最大允許照射功率（0.33 W/cm2）的808 nm 超低強度近紅外光照射（0.25 W/cm2）下的輕度高熱可誘導腫瘤細胞不可逆性死亡，并最大量地促進化療藥物的釋放；來自UC 的660 nm 光激活Ce6 產生PDT 的活性氧，540 nm 光可以用于可視化處理過程；動物體內外抗腫瘤實驗表明，超低強度近紅外光同步激活的Chemo/PTT/PDT 納米平臺具有顯著的療效，并且光損傷最小.

2 近紅外光協同免疫療法在不同腫瘤中的應用研究

近紅外光協同免疫療法是非常有前景的治療方法，近紅外光可以直接及間接激活免疫系統，可同時進行成像監測治療效果、評估在治療過程中產生的不良反應，因此在腫瘤治療方面具有很大的臨床應用潛力.近紅外光協同免疫治療的研究中幾乎都涉及納米材料，這些納米材料雖然表現出強大的功能和有效性，但其長期毒性及體內蓄積目前仍然不是很明確，因此在臨床轉化方面還有大量的工作需要做，值得鼓勵的是目前已有獲批臨床研究的項目.

采用FDA 批準的Erbitux?（Cetuximab）抗體與光吸收劑IR700 的結合物（RM1929/ ASP1929）構建NIR-PIT 治療平臺用于復發性頭頸癌患者的治療，目前已成功地通過了Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，為了克服近紅外光在組織中有限穿透深度，在腫瘤組織內插入了圓柱形擴散光纖，增強光線在整個腫瘤中的傳遞.選用RM1929最大可行劑量640 mg/m2，注射給藥24 h后用使用690 nm 近紅外光50 J/cm2照射表面病變或100 J/cm2照射間位病變.結果顯示：治療有較好的腫瘤抑制效果，盡管在治療部位周圍觀察到出血和疼痛，但未觀察到劑量限制性毒性或光敏性，是一種安全的治療方法（NCT02422979）.

在肝癌、肺癌、乳腺癌等的臨床前研究中，光熱或光動聯合免疫治療都表現出令人滿意的抗腫瘤效果.HANAOKA 等［50］用光敏劑IR700 偶聯抗GPC3人源性重鏈抗體（HN3）分別在體外和體內對荷瘤小鼠進行光免疫治療（PIT），結果表明IR700-HN3和IR700-YP7（免疫球蛋白）介導下的NIR-PIT 在體外和體內均可導致腫瘤細胞死亡，而IR700-HN3 表現更強抗腫瘤效果.LI 等［51］構建具有熒光成像能力的近紅外/pH 雙響應納米復合物CE7Q/CQ/SV（由兩種銫基納米材料CE7Q 和CQ 混合后負載SV），將分子靶向藥物厄洛替尼（Er）、生存素 shRNA 表達質粒（SV）和光熱劑七甲基菁染料（Cy7）整合在一個平臺上，用于近紅外（NIR）熒光成像和對攜帶表皮生長因子受體（EGFR）突變的非小細胞肺癌（NSCLC）的三聯治療.所得CE7Q/CQ/S 具有良好的光熱效應、良好的DNA 結合能力和pH/NIR 雙響應釋放行為，體內外實驗結果表明，生存素基因表達下調和光熱效應可與Er協同作用，在Er敏感或Er耐藥的EGFR突變的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞中均有滿意的抗腫瘤效果，該復合治療納米平臺有望成為治療非小細胞肺癌的候選藥物.

肺轉移在腫瘤細胞的生長過程中是較為常見的現象，單一光療很難達到完全抑制的效果.LI等［52］構建了一種由半導體聚合物納米顆粒（SPN）核心和由單線態氧（1O2）可切割連接物連接的免疫檢查點抑制劑（NLG919）組成的納米平臺（OSPs）用于乳腺癌的治療.OSPs在近紅外激光照射下能夠同時產生熱量和氧氣進行聯合光療，在消融腫瘤的同時產生腫瘤相關抗原；近紅外照射可觸發1O2-可裂解接頭的裂解，觸發免疫刺激劑從OSPs遠程釋放調節免疫抑制的腫瘤微環境，最終導致了小鼠異種移植瘤模型中原發/遠處腫瘤的生長和肺轉移的抑制.

3 總結與展望

近紅外光協同免疫療法可增強抗腫瘤效果、降低各自單獨使用時所引起的不良反應，具有很大的臨床應用潛能，但發展過程中還有一些瓶頸問題需要解決.首先，在利用近紅外光協同免疫治療的過程中會構建或使用一些具有高光活性、靶向性、可生物降解等優勢的納米載體，雖被證實有效但多限于體外實驗或動物實驗數據，況且由于個體差異及體內復雜多變的生物環境使得納米材料在人體內的作用難以預測，臨床轉化方面還有大量的工作要做；其次，對于在使用PTT治療腫瘤時所產生的溫度以多少較為合適目前尚沒有明確的定論，過低可能無法有效消融腫瘤細胞，過高又可能對正常組織造成傷害，還需要大量的研究去探索適宜的溫度范圍；再者，與可見光相比近紅外光尤其是NIR-II在組織穿透方面有了極大的提高，在淺表層的腫瘤細胞殺傷方面有一定的療效，但是在深層腫瘤細胞的損害方面依然達不到理想結果，因此近紅外光的作用下協同免疫療法用于臨床仍然有很長的路要走.若能將一些先進的技術如抗干擾能力強傳輸路徑遠的光纖技術用于增強近紅外光的穿透深度，將可能對深層腫瘤達到治愈的效果.