游泳運動可能通過調控Nrf2/HO-1/Keap1通路改善尼古丁脅迫大鼠肝損傷

孔海軍,張 亮,熊 偉,諶曉安

《中國吸煙危害健康報告2020》顯示,我國吸煙人群已超過3億,每年由吸煙造成的死亡病例超過100萬以上,吸煙已成為危害公共健康的重大隱患[1]。尼古丁是煙草制品中的主要成分,具有較強的毒性和成癮性,長期吸煙或攝入尼古丁可能導致機體白細胞介素(Interleukin)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor)和血管內皮生長因子(Vascular endothlial growthfactor,VEGF)等血管生成因子,以及纖維化介質和細胞外基質蛋白的增殖[2]。尼古丁能導致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶系統的激活,抑制谷胱甘肽等抗氧化途徑,并誘導肝臟自由基脂質過氧化、肝星狀細胞活化和系膜細胞活化[3]等。隊列研究顯示,與不吸煙者比較,長期吸煙者的堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和谷氨酰轉肽酶(Glutamyl transpeptidase,GGT)等肝代謝酶水平明顯升高[4]。黃小溪等[5]的研究發現,長期的香煙煙霧暴露會導致大鼠肝細胞變性、細胞浸潤、門周纖維化、肝實質退化以及中央和門靜脈充血等。此外,亦有多項研究證實了尼古丁攝入或長期吸煙與肝細胞壞死、肝組織損傷有一定的關聯性[6]。

尼古丁通過炎癥和細胞凋亡途徑,如,NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3)等的全身效應作用于心血管系統,從而形成多器官影響效應[7]。有研究發現,核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2)/血紅素氧合酶1(Heme Oxygenase-1,HO-1)/Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-1ike ECH-associated protein l,Keap1)通路通過轉導NLRP3和Caspase-3信號分子調節肝組織脂質過氧化、自由基損傷和內皮細胞的功能障礙。Sudhir Chowdhry等的研究發現,Nrf2活性受損可能是導致急、慢性肝損傷向肝纖維化演變的主要風險因素[8]。大量研究也報道了運動對非酒精性脂肪肝或化學物質(如,CCl4、D-氨基半乳糖等)致肝損傷的保護效應,運動干預改善肝臟損傷的機制主要是通過激活肝細胞自噬和清除過剩氧化物,進而減輕肝細胞凋亡、組織氧化應激和炎癥反應[9]。但現階段,尚缺乏運動對尼古丁致肝損傷保護作用的直接證據?；诖?本研究旨在構建尼古丁脅迫(Nicotine stress,NS)模型,通過游泳運動干預,驗證Nrf2/HO-1/Keap1通路在NS大鼠肝代謝、炎癥反應、氧化應激和纖維化蛋白中的具體作用,為運動干預在NS致肝損傷的康復治療中提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

40只6周齡SPF級雄性SD大鼠由新疆醫科大學醫學實驗動物中心提供,實驗動物許可證編號為SYXK(新)2016-0002。實驗室條件適應性飼養3 day后隨機分組,分別為假手術組(Sham組,n=10)、游泳運動組(Ex組,n=10)、尼古丁脅迫組(NS組,n=10)及尼古丁脅迫+游泳運動組(NS+Ex組,n=10)。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器有大鼠恒溫泳池(上海軟隆科技公司)、KH-Q330全自動組織切片機(湖北闊海醫療科技公司)、TE2000-U顯微圖像分析系統(日本奧林巴斯公司)、imark酶標儀(美國Bio-Rad公司)、5424R高速冷凍離心機(德國艾本德公司)、AlphaImager EP凝膠成像系統(美國ProteinSimple公司)、Gene Pulser Xcell電泳系統(美國Bio-Rad公司)、170-3930蛋白轉印系統(美國Bio-Rad公司)、Eppendorf紫外分光光度計(德國艾本德公司)、SCIEX Triple TOF?4600 AB ACQUITY液相色譜系統(美國AB公司)和Micromass Quattro Micro API質譜儀(美國AB公司)。

試劑方面,尼古丁購自美國Sigma公司;谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)、白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司;Trizol總RNA抽提試劑、cDNA合成試劑盒、雙鏈cDNA合成試劑盒、dNTP Mixture、Taq PCR MasterMix、免疫組織化學染色及DAB試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司;cDNA引物Oligo購自上海生工生物工程股份有限公司;α-SMA、SMAD3、Caspase-3和NLRP3抗體購自Proteintech公司;Nrf2、NQO-1、HO-1、Keap-1和β-Actin抗體購自Abcam公司;Bax、Bcl-2和NF-kB抗體購自Thermo Fisher公司。

1.3 尼古丁脅迫模型及運動方案

首先,NS組和NS+Ex組大鼠接受尼古丁腹腔注射(2.5 mg/kg·bw/d),連續4周,滅菌注射用水配置尼古丁所需濃度;Sham組和Ex組不接受腹腔藥物給藥,正常飼養。其次,尼古丁脅迫模型建立后,Ex組和NS+Ex組大鼠進行適應性游泳訓練,3 d,1次/d,15 min/次;Sham組和NS組不接受運動干預,正常飼養。再者,適應性游泳訓練后,Ex組和NS+Ex組進行連續8周的自由游泳運動:(1)1～2周:2次/d,20 min/次;(2)3～4周:2次/d,25 min/次;(3)5～8周:2次/d,30 min/次。Sham組及NS組大鼠保持正常飼養及自由活動,不參與游泳運動干預方案。

1.4 樣本采集

末次游泳運動后的次日,麻醉、尾靜脈取血,全血室溫自凝45 min,4 ℃、2 000 r/min離心10 min,取上清即為血清;迅速取肝臟,稱取1 g肝臟加入PBS勻漿介質,1 500 r/min勻漿30 s,勻漿液轉移至離心管,4 ℃、6 000 r/min,離心10 min,取上清于-80 ℃保存。

1.5 酶聯免疫吸附試驗

分別取肝組織勻漿液和血清,采用試劑盒法檢測谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.6 蘇木素-伊紅染色和免疫組織化學染色

取大鼠肝組織,制作切片并脫蠟、復水,蘇木素-伊紅染色后,鏡下觀察,切片中心視野采集圖像。經抗原修復,分別加抗α-SMA抗體(1∶300)和抗SMAD3抗體(1∶400),4 ℃孵育過夜,PBS緩沖液清洗,二抗孵育,按照DAB顯色試劑盒流程進行顯色反應。

1.7 LC-MS法檢驗

1.8 RT-PCR法檢測

取200 μL肝組織勻漿液,采用Trizol法提取組織液總RNA,逆轉錄為cDNA,采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測mRNA相對表達水平。PCR反應體系(20 μL)分別為cDNA模板1 μL、ddH2O 7 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、2×Taq PCR master mix10 μL,條件為95 ℃初始變性55 s;然后在95 ℃變性10 s,57 ℃退火30 s,40個循環。引物序列如表1所示。

表1 目標基因引物序列表

1.9 Western Blot檢測蛋白表達量

1.10 統計學分析

采用SPSS 25.0統計學軟件進行統計分析,數據結果以平均數±標準差(mean ± SD)表示,兩樣本平均數間比較采用t檢驗分析,多樣本平均數間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA),組間比較采用LSD檢驗,P<0.05表示有顯著性差異。

2 結 果

2.1 各組大鼠肝重、肝系數及肝功能

與Sham組比較,NS組和NS+Ex組大鼠肝系數和肝組織ALT、AST和ALP水平顯著上升(P<0.05);Ex組ALT水平顯著降低(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠肝系數和肝組織ALT、AST和ALP水平顯著降低(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠肝重、肝系數及肝功能指標統計表Table 2 Liver weight, liver coefficient and liver function indexes of rats in each group

2.2 各組大鼠血清和肝組織氧化應激

與Sham組比較,NS組大鼠血清和肝組織MDA水平顯著上升,SOD和GSH-px水平顯著降低(P<0.05);NS+Ex組大鼠血清和肝組織MDA水平顯著上升,肝組織SOD顯著降低(P<0.05);Ex組血清、肝組織GSH-px和肝組織MDA、SOD水平顯著上升(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠血清和肝組織MDA水平顯著降低,SOD和GSH-px水平顯著上升(P<0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠血清和肝組織氧化應激統計表

2.3 有氧運動對NS大鼠血清和肝組織炎癥因子的影響

與Sham組比較,NS組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著上升(P<0.05);Ex組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠血清炎癥因子水平統計表

2.4 各組大鼠肝臟病理形態學特征

圖1 各組大鼠肝組織HE染色圖(200×)Figure 1 HE staining of rat liver tissues in each group (200×)

Sham組和Ex組大鼠肝小葉結構正常,肝細胞排列整齊,肝竇清晰連續且無壞死區域。其中,NS組大鼠肝細胞胞質深染,肝細胞索結構不清晰,出現大量壞死灶和炎性細胞浸潤,肝損傷明顯;NS+Ex組大鼠肝組織壞死灶減少,炎性細胞浸潤減輕,肝結構逐漸趨于正常,肝組織損傷減輕(見圖1)。

2.5 各組大鼠肝組織代謝組學

通過Met PA通路富集分析各組大鼠肝組織代謝通路,結果表明,游泳運動對NS大鼠肝組織代謝影響度較高的通路包括甘氨酸和蘇氨酸代謝通路、抗壞血酸和藻酸鹽代謝通路、花生四烯酸代謝通路、α-亞油酸代謝通路和甘油酯代謝通路等(見表5)。

表5 肝組織代謝通路Met PA分析表

2.6 各組大鼠肝組織纖維化蛋白表達

與Sham組比較,NS組和NS+Ex組大鼠肝組織α-SMA和SMAD3陽性細胞數量顯著上升(P<0.05);Ex組大鼠肝組織α-SMA陽性細胞顯著降低(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠肝組織α-SMA和SMAD3陽性細胞數量顯著降低(P<0.05)(見圖2)。

圖2 各組大鼠肝組織α-SMA、SMAD3免疫組織化學染色圖Figure 2 Immunohistochemical staining of α-SMA and SMAD3 in liver tissue of rats in each group

2.7 各組大鼠肝組織炎癥反應及凋亡相關蛋白表達

與Sham組比較,NS組大鼠肝組織Bcl-2、Caspase-3、NLRP3和NF-кB蛋白表達顯著上升(P<0.05),Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05);NS組大鼠肝組織Bax和NLRP3蛋白表達顯著下降(P<0.05);NS+Ex組大鼠肝組織Bcl-2、Caspase-3和NF-кB蛋白表達顯著上升(P<0.05),Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠肝組織Bcl-2、Caspase-3、NLRP3和NF-кB蛋白表達顯著下調(P<0.05),Bax蛋白表達顯著上調(P<0.05)(見圖3)。

2.8 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1和Keap-1 mRNA表達

與Sham組比較,NS組大鼠肝組織Nrf2和HO-1 mRNA表達顯著降低(P<0.05),Keap-1 mRNA表達顯著上升(P<0.05);Ex組大鼠肝組織Nrf2和HO-1 mRNA表達顯著上升(P<0.05),Keap-1 mRNA表達顯著降低(P<0.05);NS+Ex組大鼠肝組織Keap-1 mRNA表達顯著上升(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠肝組織Nrf2和HO-1 mRNA表達顯著上調(P<0.05),Keap-1 mRNA表達顯著下調(P<0.05)(見圖4)。

圖4 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1和Keap-1 mRNA表達圖Figure 4 mRNA expression of Nrf2,HO-1 and Keap-1 in liver tissues of rats in each group

2.9 各組大鼠肝組織Nrf2/HO-1/Keap1通路相關蛋白表達

與Sham組比較,NS組大鼠肝組織Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達顯著降低(P<0.05),Keap-1蛋白表達顯著上升(P<0.05);Ex組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達顯著上升(P<0.05),Keap-1蛋白表達顯著降低(P<0.05);NS+Ex組大鼠肝組織Nrf2蛋白表達顯著降低(P<0.05),Keap-1蛋白表達顯著上升(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠肝組織Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達顯著上調(P<0.05),Keap-1蛋白表達顯著下調(P<0.05)(見圖5)。

圖5 各組大鼠肝組織Nrf2/HO-1/Keap1通路相關蛋白表達圖Figure 5 Expression of Nrf2/HO-1/Keap1 pathway related proteins in liver tissue of rats in each group

3 討 論

3.1 游泳運動對尼古丁脅迫大鼠炎癥反應和肝功能的影響

肝臟是負責清除或轉化藥物、酒精和其他有害物質的重要器官。流行病學證據顯示,吸煙或尼古丁攝入會增加慢性乙型、丙型肝炎病毒患者肝纖維化和原發性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)的風險,并降低抗病毒藥物的治療效果[10]。隊列研究顯示,長期吸煙者罹患上呼吸道感染的幾率顯著高于非吸煙者[11]。尼古丁通過抑制核糖核苷酸還原酶和T細胞抗原信號干擾抗體的形成,從而阻礙T淋巴細胞的分化和增殖。此外,尼古丁通過增強Fas/CD95死亡受體表達誘導淋巴細胞凋亡、細胞毒性T淋巴細胞和促炎細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1)表達上升,并造成NK細胞活性受損[12]。體育運動尤其是有氧運動可以參與機體免疫調節,有研究認為,運動通過激活T細胞抗原介導的信號轉導通路和核糖核苷酸還原酶,促進淋巴細胞增殖和分化[13]。此外,有氧運動被證實可以下調Fas/CD95死亡受體表達抑制淋巴細胞凋亡,進而抑制TNF-α、IL-6和IL-1等促炎細胞因子的生成[14]。本研究也觀察到類似的現象,游泳運動有效抑制了NS造成的肝臟氧化應激激活和炎癥反應。

肝功能是反映機體肝損傷的金標準,常采用肝臟代謝酶水平進行評估。Wannamethee等[15]的研究表明,在調整年齡、性別、BMI、酒精和咖啡飲用量等多變量風險后,吸煙者的血清總蛋白和白蛋白水平顯著降低,谷氨酰轉肽酶(Glutamyl transpeptidase,GGT)水平顯著上升。因此,吸煙或尼古丁攝入無疑是肝損傷進展中未被充分認識的病理學因素。肝系數上升是肝損傷或纖維化的早中期特征,這可能與肝組織水腫、充血或增生肥大等病理現象有關。本研究發現,4周高劑量尼古丁注射后,大鼠肝系數顯著上升,提示肝組織可能出現水腫或纖維化增生,病理學觀察也發現肝組織出現大量壞死灶和炎性細胞浸潤。分析認為,可能是高劑量尼古丁提高了肝組織工作負擔、尼古丁的直接毒性作用合并誘發了肝組織損傷和結構性增生。目前,尚缺乏運動對尼古丁誘導肝損傷的干預研究,但部分間接證據顯示,運動干預可以有效改善心肌梗死、高強度急性運動和糖尿病等誘導的肝功能異常[16]。有研究發現,7周跑臺運動可以顯著降低酒精性肝損傷小鼠血清和肝組織AST、ALT和MDA水平[17]。有動物實驗發現,有氧運動顯著降低了心肌梗死小鼠血清AST、ALP和ALT活性[18]。本研究也發現,8周游泳運動可以顯著降低NS大鼠肝組織ALT、AST和ALP水平,說明有氧運動可以有效緩解NS誘導的肝損傷進程。

3.2 游泳運動對尼古丁脅迫大鼠肝臟代謝功能的影響

肝損傷中常常會觀察到肝功能異常和相關代謝紊亂,為了確定NS誘導肝損傷的代謝學特征,本研究對其肝組織代謝組學進行了分析。結果表明,NS導致大鼠肝組織差異代謝物出現顯著擾動現象,甘氨酸和蘇氨酸、抗壞血酸和藻酸鹽、花生四烯酸等肝損傷標志物表達下降;而游泳運動通過逆轉差異代謝物擾動并上調甘氨酸和蘇氨酸、抗壞血酸和藻酸鹽、花生四烯酸等肝損傷標志物,從而減輕了NS誘導的肝損傷。有研究認為,甘氨酸和蘇氨酸代謝受損與諸多肝臟疾病誘導的肝損傷密切相關[19]。臨床和動物實驗證據顯示,非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)患者和小鼠肝組織甘氨酸生物合成基因丙氨酸-乙醛酸氨基轉移酶1(Alanine-glyoxylate aminotransferase 1,AGXT1)被顯著抑制[20]。甘氨酸參與構成蛋白質結構鏈,同時調控谷胱甘肽合成和單碳代謝,在肥胖、2型糖尿病和NAFLD相關的代謝紊亂中,肝組織甘氨酸水平呈下降趨勢。臨床研究表明,補充甘氨酸可以對肝臟代謝產生有益效果[21]。尼古丁可能通過腸道—肝臟代謝軸影響體內甘氨酸代謝,動物實驗證據顯示,尼古丁注射小鼠腸道、肝組織內甘氨酸、絲氨酸和天冬氨酸水平降低[22]。有學者認為[23],尼古丁誘導肝臟甘氨酸代謝失衡的機制包括:(1)尼古丁的毒性作用造成腸道微循環障礙,腸道甘氨酸吸收效率降低;(2)體內甘氨酸生物合成效率下降;(3)甘氨酸分解代謝或尿液排泄速率上升。本研究游泳運動干預后,NS誘導肝損傷甘氨酸和蘇氨酸代謝效率顯著上升,表明游泳運動可以顯著改善大鼠NS誘導肝損傷甘氨酸和蘇氨酸代謝的能力。

3.3 游泳運動對尼古丁脅迫大鼠肝組織纖維化和細胞凋亡的影響

研究認為,長期吸煙、煙霧暴露或尼古丁攝入可以誘導肝組織纖維化[24]。肌成纖維細胞活化是肝纖維化發生的核心環節,α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和信號轉導分子3(Mothers against decapentaplegic homolog 3,SMAD3)的激活與轉化是肌成纖維細胞活化的主要來源,因而成為纖維化診斷和治療的靶點。內質網應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)作為細胞的重要保護機制,參與調節Nrf2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、核因子NF-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)和c/EBP同源蛋白等多種細胞因子,在炎癥過程、細胞防御性氧化應激和細胞凋亡過程中發揮著調控作用[25]。半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Caspase-3)作為Caspase級聯反應下游最關鍵的凋亡執行者,其激活在很大程度上依賴于NLRP3的釋放,而B淋巴細胞瘤(B-cell lymphoma,Bcl)家族中的Bcl-2和Bax基因是目前已知的細胞凋亡中最重要的調控基因,可以通過線粒體途徑介導NLRP3等物質的釋放[26]。Bax不僅作為Caspase-3的上游調控機制參與對Caspase-3活性的調節,還可作為Caspase-3的直接底物作用于Caspase-3下游,二者在細胞凋亡傳導過程中既相互聯系又相互制約。本研究發現,尼古丁腹腔注射4周后,大鼠肝組織Bcl-2、Caspase-3、NLRP3、NF-кB蛋白表達和α-SMA、SMAD3陽性細胞數量顯著上升(P<0.05),Bax蛋白表達顯著降低,表明NS導致大鼠肝細胞炎癥反應和凋亡反應激活,肝組織纖維化水平上升,且NS誘導的細胞炎癥反應和凋亡反應可能是肝損傷的內源性因素。有研究證實,有氧運動可以發揮損傷組織凋亡調控的作用。如,有氧運動和抗阻運動均可以有效地抑制糖尿病脂肪肝大鼠肝臟ERS及其介導的細胞凋亡[27]。亦有部分研究證實,有氧運動可以有效抑制煙霧刺激和低氧暴露誘導的ERS和肝組織凋亡反應[28]。本研究發現,游泳運動顯著降低了NS大鼠肝組織Bcl-2、Caspase-3、NLRP3、NF-кB蛋白表達和α-SMA、SMAD3陽性細胞數量,顯著提高了Bax蛋白表達。提示游泳運動可能通過抑制ERS調控的炎癥過程和細胞凋亡,減輕NS大鼠肝組織損傷。

3.4 游泳運動對尼古丁脅迫大鼠肝組織Nrf2/HO-1/Keap1通路的影響

核因子E2相關因子2(Nrf2)作為轉錄因子參與調控細胞氧化應激反應,在氧化還原平衡、代謝和炎癥反應應答中發揮重要作用[29]。有研究表明,在氧化應激及其他有害刺激作用下,腦、肝臟和腎臟等器官Nrf2表達上升[30]。Kelch樣ECH相關蛋白1(Keap1)、表觀遺傳學和磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)是調節Nrf2信號的三個關鍵途徑。Keap1在生理條件下通過E3連接酶誘導Nrf2泛素化,導致Nrf2被26S蛋白酶體分解,Nrf2從細胞質向細胞核的易位被抑制[31]。血紅素氧合酶1(HO-1)和醌NADH脫氫酶1(Recombinant NADH Dehydrogenase, Quinone 1,NQO-1)是細胞內重要的保護酶,具有抗炎和抗氧化作用,同時參與調節Nrf2-ARE抗氧化反應系統[32]。然而,Nrf2與HO-1和NQO-1相互作用的機制仍不清楚。但多項研究證實,長期煙霧暴露或尼古丁攝入導致動物肝組織Nrf2、HO-1、NQO-1基因和蛋白表達降低,繼而調節多個下游靶基因表達,因此,可以認為Nrf2是多種肝臟疾病肝組織損傷的生物靶點。

動物實驗證實,NAFLD大鼠肝組織Nrf2基因表達下調顯著加劇了其纖維化進程,相反,特異性敲除Keap1基因后,大鼠Nrf2的表達增強,蛋氨酸和膽堿缺乏飲食誘導的脂肪肝癥狀減輕[33]。本研究結果表明,NS誘導大鼠肝組織Nrf2、NQO-1、HO-1 mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.05),Keap-1 mRNA和蛋白表達顯著上升,表明尼古丁注射導致大鼠肝組織Nrf2/HO-1/Keap1通路活性被抑制。有證據表明,運動參與了肝組織Nrf2調節,即,有氧運動可以上調肝臟纖維化患者外周血單個核細胞Nrf2表達[34]。有動物實驗證實,8周跑臺訓練方案后,NAFLD大鼠肝臟Nrf2轉錄活性增加,HO-1蛋白表達上升,肝組織凋亡介質表達顯著降低[35]。Nrf2激活誘導HO-1活化也可以在抗炎機制中發揮作用,HO-1可以顯著降低肝臟、腦和腎臟等多個器官中NF-κB和NLRP3活性,同時降解炎癥介質。說明規律運動可以通過激活Nrf2/HO-1通路活性減輕肝臟炎癥損傷和細胞凋亡,但遺憾的是,運動激活Nrf2/HO-1的具體機制尚不清楚。因此,可以認為游泳運動通過激活Nrf2/HO-1/Keap1通路活性,抑制NS誘導的肝組織炎癥反應和細胞凋亡。

4 結 論

4周尼古丁腹腔注射(2.5 mg/kg·bw/d)可以誘導大鼠肝組織損傷;游泳運動干預可能通過調控尼古丁脅迫大鼠肝組織纖維化和Nrf2/HO-1/Keap1通路活性抑制炎癥反應和細胞凋亡,調節肝組織代謝,進而減輕大鼠肝組織損傷。