雙黃連口服液不同精制工藝對比評價研究*

白璐 惠志立 崔春利 史亞軍 劉紅波 劉航 劉文豪

(1.西安市第一醫院,陜西 西安 710002;2.西安醫心演繹醫療科技有限公司,陜西 西安 710301;3.陜西中醫藥大學/陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室,陜西 西安 712046;4.陜西中醫藥大學附屬醫院,陜西 咸陽 712000)

以水煎服的中藥湯劑,是中醫臨床用藥的主要形式,也充分體現出中藥水提液臨床應用的普遍性與重要性?！叭芤涵h境”是指溶液體系所具有的黏度、pH、離子強度、電解質成分等特征性質[1-2]。中藥水提液因為溶媒水、極性大、溶出成分多樣,使得水提液環境復雜。正如雙黃連口服液在提取過程中,不僅提取出了對疾病有治療作用的有效成分,如黃芩苷、綠原酸等;一些易溶于水的雜質和無效成分也隨之被提取出來,如多糖、蛋白質等大分子物質。為了確保藥物有效成分的溶出度,提高藥物療效,水提醇沉法[3-4]、微濾法[5-11]、絮凝法[12-15]、高速離心法[16-17]均在中藥水提液精制中被探索研究。本文以雙黃連口服水提液為實驗體系,基于“溶液環境”與藥物有效成分密切關系,通過研究雙黃連口服液三種不同精制工藝,比較其物化參數、指標性成分黃芩苷的含量和其大分子去除率,從而得出雙黃連口服液的最佳精制工藝,以期為復雜“溶液環境”的中藥水提液的精制提供實驗基礎。

1 儀器與試藥

1.1儀器 KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);UPR系列超純水器(四川優普超純科技有限公司);Agilent 1260高效液相色譜(美國);實驗室用LNG-CM-101膜分離機(上海朗極膜分離設備工程有限公司);DDS-307電導率儀(上海精密科學儀器有限公司);PHSJ-4F實驗室用pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司);DV-I+黏度計(美國BROOKFIELD公司);WGZ-3.3A濁度計(上海昕瑞儀器儀表有限公司)。

1.2試藥 黃芩、金銀花和連翹3味藥材飲片均購自西安興盛德中藥飲片有限責任公司,經王繼濤高級實驗師鑒定均符合《中國藥典》2020年版一部規定。黃芩苷標準物質(批號:110715-201318)來源于中國食品藥品檢定研究院。牛血清白蛋白(BSA);考馬斯亮藍G-250;甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1雙黃連口服液水提液的制備 按處方比例,分別取金銀花375 g,黃芩375 g,連翹750 g,稱取各味藥的1/15。黃芩煎煮3次,第一次加入14倍水,煎煮2 h;第二次加12倍水,煎煮1 h;第三次加12倍水煎煮1 h。分別用四層紗布濾過,合并濾液。金銀花、連翹先溫浸30 min,煎煮兩次,第一次14倍水,煎煮1.5 h;第二次12倍水,煎煮1.5 h。四層紗布濾過,合并濾液。將兩次濾液合并,調整成濃度為0.04 g·mL-1(以生藥量計,下同)的水提液,待用。

2.2精制操作工藝

2.2.1微濾法 取雙黃連水提液500 mL,過孔徑為0.08 μm的無機陶瓷膜,收集濾液,調整成0.04 g·mL-1,待用。

2.2.2醇沉法 取1 L雙黃連水提液平均分成四等份,不斷攪拌并緩慢加入250 mL、375 mL、583 mL、1000 mL的95%分析乙醇(慢加快攪),分別使含醇量達到50%、60%、70%、80%,靜置24 h,濾過,揮至無醇味后,調整成0.04生藥g·mL-1,待用。

2.2.3絮凝法 取三等份雙黃連水提液,每份500 mL,加入配置好的殼聚糖絮凝液,使殼聚糖含量達10%、20%、30%,靜置24 h,濾過,揮至無酸味后,調整成0.04生藥g·mL-1,待用。

2.3物化參數的測定 分別取雙黃連口服液水提液及精制液適量,均通過恒溫水浴恒溫至25 ℃,分別以已校正精密pH計測定pH值;以電導率儀測定電導率值;以濁度計測定濁度;依據《中國藥典》2020年版四部通則0633黏度測定法第三法中(3)轉子型旋轉黏度計以BROOKFIELD黏度計測定水提液及各純化法所得精制液流體的相對黏度。

2.4高分子物質的測定 分取2.1項下雙黃連口服液水提液及2.2項下各精制液適量,采用考馬斯亮藍G-250比色法測定蛋白質含量[18];采用《中國藥典》2020年版四部通則2202鞣質含量測定法測定鞣質含量[19];采用高錳酸鉀滴定法測定酶解前的還原糖量及酶水解和酸水解后還原糖量,依據公式計算:淀粉含量=酶水解和酸水解后還原糖量-酶解前的還原糖量[20];果膠含量測定利用果膠酸鈣不溶于水的特性,向含果膠溶液中加入沉淀劑,使果膠形成果膠酸鈣沉淀,測定果膠酸鈣量并換算成果膠量[21]。

2.5黃芩苷含量測定[22-25]

2.5.1色譜條件 以十八垸基硅烷鍵合硅膠為填充劑;甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.1)為流動相,檢測波長為280 nm。理論板數按黃芩苷峰計算應不低于2500。

2.5.2對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含0.064 mg黃芩苷的溶液,即得。

2.5.3供試品溶液的制備 分別取各方法精制樣液25 mL,搖勻,精密吸取1 mL,置于50 mL量瓶中,加70%乙醇約45 mL,超聲處理30 min,放至室溫,加70%乙醇定容至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,精密量取5 mL,加甲醇稀釋至10 mL,搖勻,0.45 μm微孔濾膜過濾,備用。

2.6相關性統計分析方法 采用R語言3.4.3軟件和IBM SPSS Statistics 19.0軟件分別進行性分析,分別對pH、濁度、黏度、電導率、蛋白質含量、鞣質含量、淀粉含量、果膠含量及黃芩苷含量進行正態性檢驗。R語言構建目標數據集,然后批量求解,*表示P<0.1,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

3 結果

3.1物化參數測定 結果與原液相比較,唯獨微濾液pH顯著上升,醇沉液的pH隨著加入醇量的增大變化不明顯,絮凝液的pH隨著絮凝劑濃度變化,其中20%絮凝液的pH最大,30%絮凝液次之;濁度微濾液的濁度顯著下降,醇沉液的濁度隨著醇量的增多先減小后增大,其中60%醇沉液濁度下降最多,隨絮凝液濃度增大濁度增加,10%絮凝液濁度最小;三種精制液的黏度變化不大,微濾液的黏度下降最為明顯,醇沉液的黏度基本隨加入醇量的增大而增大;電導率與原液相比較,微濾液的電導率下降最明顯,醇沉液的電導率隨加入醇量的增多而減小,絮凝液的電導率隨加入絮凝劑的增多而增大。結果見表1。

表1 物化參數測定結果

3.2高分子測定結果 通過數據比較分析,從四種高分子去除總體70%醇沉液>微濾液>50%醇沉液>80%醇沉液>10%絮凝液>30%絮凝液>60%醇沉液>20%絮凝液,結果見表2。

表2 高分子含量測定結果

3.3黃芩苷含量測定結果

3.3.1線性關系考察 分別精密吸取3.4.1對照品溶液2、4、6、8、10μL注入高效液相色譜儀,按選定的色譜條件進行測定,記錄色譜圖及峰面積。以峰面積的積分值定量,以峰面積積分值Y為縱坐標,進樣量X(μg)為橫坐標,繪制標準曲線,并進行回歸分析,黃芩苷的回歸方程為:Y=301.1X+27.678,r=0.9997。結果表明,黃芩苷的進樣量在0.128～0.64 mg范圍內具有良好的線性關系。

3.3.2精密度實驗 精密吸取標準品溶液10 mL,連續進樣5次,測得黃芩苷峰面積積分值的RSD值為0.38%,結果表明該儀器精密度良好。

3.3.3穩定性實驗 取標準品溶液,依法分別于0、2、4、6、8、12 h測定,測得黃芩苷峰面積積分值的RSD值為1.99%,表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

3.3.4重復性實驗 取微濾液5份,分別按2.5.3項下供試品溶液制備方法制成5份供試品溶液,以2.5.1項下色譜條件測定,測得黃芩苷質量濃度分別為1.145、1.138、1.147、1.135、1.142 mg·mL-1,RSD值為0.43%,表明該方法重復性良好。

3.3.5回收率實驗 取微濾液10 mL,6份,分別加入一定量的黃芩苷對照品,按照供試品溶液的制備方法制備供試品溶液,按上述色譜條件及測定方法進行測定,計算回收率,平均回收率為96.51%,RSD值為1.42%。表明黃芩苷回收率良好,結果見表3。

表3 回收率試驗測定結果(n=6)

3.3.6樣品含量測定 分別取供試品溶液,進樣10 μL,在給定的色譜條件下,測定黃芩苷的峰面積,由對應的線性方程計算其含量,結果見表4。

表4 黃芩苷含量測定結果

由表4結果顯示,膜過濾液黃芩苷含量略有下降,可能是過濾時黃芩苷隨雜質一起被濾過所致;醇沉液黃芩苷含量反而略有上升,這可能與黃芩苷的溶解度密切相關,表明黃芩苷在50%～80%的醇液中溶解度會增大,其中50%醇沉液黃芩苷含量最高,60%醇沉液、70%醇沉液、80%醇沉液的黃芩苷含量相近。絮凝液黃芩苷含量大幅下降,其中20%絮凝液黃芩苷含量較10%絮凝液、30%絮凝液高。由此可見,對于雙黃連口服液最不理想的精制方法為絮凝法。

3.6相關性分析結果

3.6.1不同精制工藝“高分子含量-物化參數”“物化參數之間”“高分子含量之間”相關性分析結果 通過分析,物化參數與高分子含量之間均沒有相關性。物化參數之間結果顯示:pH與濁度呈顯著負相關(P<0.05);pH與電導率呈顯著負相關(P<0.05);濁度與電導率呈顯著正相關(P<0.05)。高分子之間相關結果顯示:蛋白質含量與淀粉含量呈極顯著正相關(P<0.001)。見圖1。

注:圖中方框中數字表示兩個比較樣本相關值;*表示顯著程度(*P<0.05,***P<0.001);Turbidity表示濁度;Viscosity表示黏度;EL為 electrical conductivity縮寫,表示電導率;Protein表示蛋白質;Tannins表示鞣質;Starch表示淀粉;Pectin表示果膠

3.6.2不同精制工藝“黃芩苷含量-物化參數”相關性分析結果 相關性結果顯示:pH與黃芩苷含量呈顯著正相關(P<0.05);濁度與黃芩苷含量呈負相關(P<0.1),黏度與黃芩苷含量沒有相關性;電導率與黃芩苷含量呈顯著負相關(P<0.05)。見圖2。

注:圖中方框中數字表示兩個比較樣本相關值;*與#表示顯著程度(*P<0.05,#P<0.1);Turbidity表示濁度;Viscosity表示黏度;EL為 electrical conductivity縮寫,表示電導率;Baicalin表示黃芩苷

3.6.3不同精制工藝“黃芩苷含量-高分子含量”相關性分析結果 高分子含量中僅鞣質含量與黃芩苷含量呈顯著相關(*P<0.05),蛋白質含量、淀粉含量、果膠含量均與黃芩苷含量沒有相關性。見圖3。

注:圖中方框中數字表示兩個比較樣本相關值;*表示顯著程度(*P<0.05);Protein表示蛋白質;Tannins表示鞣質;Starch表示淀粉;Pectin表示果膠

從以上相關性結果可以看出,采用不同精制工藝測得的黃芩苷含量與pH、鞣質含量呈正相關;與濁度、電導率呈負相關。相關性較好,說明不同精制工藝對雙黃連口服液有效成分黃芩苷含量有顯著影響。

4 討論

中藥復方水提液是一個極其復雜的化學體系,對水提液精制方法應建立在能去除雜質,最大程度的保留有效成分,同時還要考慮其經濟性、實用性?；谥兴帍头剿嵋旱奶攸c,膜分離技術在中醫藥領域的應用彰顯優勢。郭立瑋等[26]在20多年前分析論證了21世紀中藥植物藥深加工與現代膜分離技術相結合的研究開發思路,之后很多研究者開展了符合國際規范的中藥或復方的膜分離技術探究。孫立霞等[27]采用KBT-ZTC絮凝澄清法、酶解法、微濾法、酶解-微濾法及絮凝澄清-微濾法澄清參玉口服液,研究結果證實絮凝澄清-微濾法為最佳方法。高紅寧等[28]通過比較分析枳實、苦參和金銀花澄清前后固形物、性狀、膜通量、指標成分等指標,研究證實微濾法對中藥水提液起到較好的澄清除雜效果。不僅如此,微濾法也被應用到中藥揮發油的分離,韓志峰[29]以常見的九種含油水體進行優化探究,旨在推進微濾在揮發油淋領域的應用。朱華旭等[30]探討了膜分離技術在中藥廢棄物有效組分資源化的原理、方法與應用實踐,比較系統描述了膜技術在中藥廢棄物的提取、分離、濃縮、純化工程的應用前景,論述了膜技術在中藥資源產業化過程中的適宜性和可行性。

本文以雙黃連口服液為例,實驗結果顯示,采用醇沉法略高保留了有效成分,但其存在耗醇量大、乙醇回收率低、耗能大、醇沉后的藥液進行濃縮相對較慢、成本較高、危險性較大的缺點。絮凝法中絮凝劑在凝結過程中不僅去除了雜質,還去除了一些小分子有效成分,導致其有效成分大幅含量降低。膜過濾法其有效成分含量介于醇沉法和絮凝法之間,但物化參數結果顯示膜過濾法能更大程度的去除雜質,保證藥液澄明度和穩定性。綜合考慮,膜微濾法應用于中藥復方水提液的精制效果最佳。

雙黃連口服液不同精制工藝研究中,從相關分析性結果看,在物化參數相關性結果中提示pH值濁度、電導率測定具有較大意義,而黏度測定意義不大。高分子含量相關性分析結果提示,鞣質測定對處方中黃芩苷含量具有顯著影響,果膠測定意義不大,處方中蛋白質含量與淀粉含量具極顯著正相關性,今后評價時應予以重點關注。