CRISPR/Cas9核糖核蛋白介導的無T-DNA插入的白樺BpGLK1精準突變

王 偉, 邱志楠, 李 爽, 白向東,劉桂豐,姜 靜

(林木遺傳育種全國重點實驗室(東北林業大學),黑龍江 哈爾濱 150040)

CRISPR/Cas9技術是繼鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、TALEN核酸酶(transcription activator like effector nucleases,TALENs)之后的第3代基因編輯技術[1-2],該技術與ZFNs/TALENs技術比較,其操作方法簡便,敲除基因效率更高,編輯更精準,大大降低了編輯脫靶機率。目前已成功地在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianabenthamiana)、棉花(Gossypiumhirsutum)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)、蘋果品種(Malusprunifolia‘Seishi’ ×M.pumilavar.paradisiaca‘M.9’)和葡萄(Vitisvinifera)等植物基因組定點編輯研究中廣泛應用。大量研究表明該技術是作物品質改良、提高產量及抗逆性的強大工具[3-7]。通常CRISPR/Cas9技術主要采用根癌農桿菌介導法在T-DNA的驅動下,將Cas9蛋白-gRNA-核糖核蛋白以及選擇標記基因導入受體細胞,進而通過選擇培養將非轉化細胞殺死,而轉化細胞由于獲得標記基因的抗性而成活下來,最終獲得基因組編輯植物。此類方法在獲得基因組編輯的植物基因組中仍含有插入的T-DNA(包括載體及標記基因)序列等[3],篩選標記基因雖為轉化植株的篩選提供了方便,但一旦完成篩選得到所需要的轉化植株之后,選擇標記基因就變成多余的,甚至有潛在危害[8]。近年來,科研人員開發了一種基于CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)的無外源基因整合的基因編輯系統,即在體外將Cas9蛋白與sgRNA進行預組裝形成復合物,然后通過微彈轟擊轉化方式直接導入受體細胞核中,進而完成對靶基因的定點突變[9]。該技術的主要特點是避免了外源基因及選擇標記轉基因插入的干擾。目前,已在擬南芥、煙草和水稻等植物中實現了無T-DNA插入的定向基因編輯,獲得的基因編輯突變體與天然存在的遺傳變異毫無區別[10]。因此,探究無選擇標記轉基因技術研究已成為當今的熱點之一。

確定適合標記靶基因是探究無選擇標記轉基因技術研究的第一步。廣泛存在于植物中的GLK轉錄因子屬于GARP超家族中的一員,在調控葉綠體發育等方面起著十分關鍵的作用[11]。該轉錄因子參與調控核定位的葉綠體蛋白以及與光合作用相關基因的表達[12],研究證明,白樺glk缺失突變株、白樺BpGLK1干擾表達及銀中楊PaGLK1干擾表達株系的葉色均為鮮艷的黃綠色[13-14],不僅表明GLKs基因在調控植物葉綠素合成進而影響葉色方面至關重要,同時也可以BpGLK1作為靶基因,其功能失活后可提供一個易于肉眼觀察的明顯葉色變化。因此,本研究以白樺為受體,利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)的無外源基因整合的基因編輯系統,進行BpGLK1特定靶點的定向編輯,研究結果可為創制林木無T-DNA插入突變體提供嶄新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白樺(Betulaplatyphylla×B.pendula)種子采自東北林業大學白樺強化種子園內自由授粉的優樹,將采收的種子晾干,去除苞片等雜質后,塑料袋塑封后置于-20℃冰箱保存備用。

PCR純化試劑盒(QIAGEN 28206),膠回收試劑盒(QIAGEN 28706),T7快速高產RNA合成試劑盒(NEB E2050S),BstEII(NEB R0162V),Cas9蛋白(質量濃度為1 mg/mL)由林木遺傳育種全國重點實驗室(東北林業大學)姜立泉教授團隊惠贈,pAbAi質粒(4 894 bp)由東北林業大學林木遺傳育種研究團隊保存,金粒(Biorad)。

1.2 試驗方法

1.2.1BpGLK1第1外顯子的克隆及重組載體的構建

根據白樺BpGLK1(Bpev01.c0167.g0013.m0001)基因序列,在BpGLK1第1外顯子BpGLK1-E1(946 bp)序列前后設計上下游引物BpGLK1-E1-F.5′-CGGGGTACCGCTCACGAGCTGCCACT-3′;BpGLK1-E1-R.5′-ACGCGTCGACAGCTGCTCCACAGCTTGC-3′。以白樺DNA為模板進行PCR擴增,獲得BpGLK-E1片段。用KpnI和SalI分別雙酶切pAbAi質粒及BpGLK1-E1片段,酶切產物用T4連接酶連接后并轉化大腸桿菌,挑取陽性克隆進行菌液PCR檢測,并送往擎科生物有限公司測序,獲得pAbAi-BpGLK1-E1重組質粒。

1.2.2 靶點設計及gRNA的合成

利用CRISPR-direct網頁(http://crispr.dbcls.jp/)篩選特異靶點。在BpGLK1第1外顯子BpGLK1-E1(圖1)選定1個靶點序列,根據靶點序列合成BpGLK1-gRNA引物(表1),采用PCR技術合成gRNA的雙鏈DNA模板。反應體系為:rTaq1 μL、10×PCR Buffer(Roche)5 μL (5 U/μL)、BpGLK1-gRNA引物2 μL(0.4 μmol/L)、BS6 2 μL(500 mmol/L)、T25-long 5 μL(10 μmol/L)、BS7 10 μL(10 μmol/L)、dNTP Mix 2 μL(2.5 mmol/L),加ddH2O補足體積50 μL。反應程序為:95 ℃預變性1 min,95 ℃變性10 s,59℃退火10 s,72℃延伸10 s,40個循環,72 ℃ 30 s,16 ℃保溫,反應結束即可獲得gRNA雙鏈DNA。隨后用T7快速RNA合成試劑盒合成gRNA,反應體系中分別加入:NTP Buffer Mix 7.5 μL、BpGLK1-gRNA雙鏈DNA 8 μL、T7 RNA聚合酶1.5 μL,加水至總體積20 μL,充分混勻后37 ℃反應4 h,即可獲得BpGLK1-gRNA。

表1 gRNA靶序列合成相關引物

下劃線序列為靶位點序列 The underlined sequence is the target site sequence。圖1 BpGLK1第1外顯子序列Fig. 1 BpGLK1 exon 1 sequence

1.2.3 CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)體外活性檢測

以pAbAi-BpGLK1-E1質粒(長度為5 840 bp)為模板(圖2),用BstEⅡ酶切后獲得線性化質粒,隨后進行體外活性檢測?；钚詸z測反應體系:2 μL Cas9蛋白、2 μL gRNA、12 μL線性化的pAbAi-BpGLK1-E1質粒、0.8 μL 1 mol/L(pH 7.5)磷酸緩沖液、1 μL(100 mmol/L) MgCl2、0.02 μL(1 mol/L)dDTT充分混勻,37 ℃下孵育1 h,1%(質量分數,下同)瓊脂糖凝膠電泳檢測,根據線性化pAbAi-BpGLK1-E1質粒能否被剪切成兩條譜帶(其中1條譜帶長度為BpGLK1-gRNA靶點到BstEII限制酶切位點約1 155 bp左右,另1條線性化質粒為剩余部分約為4 685 bp),判斷Cas9蛋白活性及gRNA的精準性。

圖2 pAbAi-BpGLK1-E1載體簡圖Fig. 2 pAbAi-BpGLK1-E1 vector diagram

1.2.4 基因槍微彈的制備及轟擊白樺愈傷組織

將白樺種子用流水沖泡72 h后,在超凈工作臺中進行消毒,隨后縱向切割種子,剝去種皮,將其接種到愈傷誘導培養基(WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA)中置于無光照條件下培養,20 d左右即可獲得幼嫩的愈傷組織,用于基因槍法轟擊受體。根據相關文獻[15]取30 mg金粉加入Eppendorf管,加入1 mL 70%(體積分數)酒精,充分渦旋,靜置15 min,1 500 r/min離心5 min。棄上清,加入1 mL無菌水,渦旋充分,1 500 r/min離心5 min,進行3次重復。加入1 mL的50%甘油,此時終濃度達到了60 mg/mL,4 ℃保存。CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein(RNP)的包裹,渦旋金粉母液5 min以打碎成團的微粒。需要注意的是,微粒很容易下沉,每一槍吸取的時候都要重新振蕩重懸微粒。取50 μL 金粉懸液于1.5 mL Eppendorf管。依次加入CRISPR/Cas9 RNP復合物,在室溫(25 ℃)下將5 μL Cas9蛋白和5 μL gRNA(gRNA體外驗證已獲得)混合,總體積為10 μL,50 μL 2.5 mol/L CaCl2、20 μL 0.1 mol/L亞精胺(現用現配,邊渦旋邊加入,每加完一樣試劑,振蕩2～3 s)。上述混好的樣品,渦旋1 min,冰上靜置1 min,重復3次。靜置10 min,10 000 r/min離心10 s,去上清。200 μL無菌水沖洗沉淀2次,10 000 r/min離心10 s,去上清。后用40 μL無菌水重懸微粒。制備包被Cas9蛋白+gRNA的基因槍微彈,采用PDS-1000/He基因槍(Bio-Rad, 美國),爆破壓力為7 584.5 kPa,轟擊距離為12 cm,進行白樺愈傷組織的轟擊。轟擊結束后將愈傷組織接種于分化培養基(WPM +1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3)中,置于無光照條件下3～5 d后,隨后在1 500～2 000 lx條件下培養25 d左右,待愈傷組織產生不定芽后轉接于繼代培養基(WPM +1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA),3 000～4 000 lx條件下培養25 d左右,每25 d更換繼代培養基。剪取高為1 cm左右的不定芽轉接到生根培養基(WPM+0.4 mg/L IBA)中進行生根培養。上述培養基中均添加200 g/L蔗糖及5.5 g/L瓊脂,培養室溫度為(25±2)℃。

1.2.5 基因編輯株系的分子檢測

分別提取基因編輯株系組培生根苗的DNA, 以基因編輯株系葉片總DNA為模板,用特異引物BpGLK1-gRNA-F.CTCTCCAGTCTTCCTTCCGAT,BpGLK1-gRNA-R.CTGAAGGTGGCTGGCTATGT進行PCR擴增,用1%的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行檢測,并送往擎科生物有限公司測序,通過Bioedit軟件將測序結果與基因組序列進行比對。

2 結果與分析

2.1 pAbAi- BpGLK1-E1重組載體的獲得

以白樺基因組DNA為模板,用BpGLK1-E1兩端特異引物進行PCR擴增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示,在1 000 bp處可見擴增譜帶(圖3a),與預期的BpGLK1第1外顯子946 bp長度吻合。進而采用雙酶切技術分別對上述擴增片段及pAbAi質粒進行雙酶切,經T4酶連接后并轉化大腸桿菌,挑取單克隆進行PCR檢測,凝膠電泳結果顯示,在1 000 bp處可見擴增譜帶,與預期的946 bp長度吻合(圖3b),將pAbAi-BpGLK1-E1重組質粒送往擎科生物公司測序,經Bioedit比對后顯示BpGLK1-E1序列正確,可用于后續實驗。

a. BpGLK1-E1靶序列擴增電泳圖electrophoretogram of BpGLK1-E1 target sequence amplification;M.Marker DL2000;1.水water;2. BpGLK1-E1序列 BpGLK1-E1 sequence;b.重組質粒檢測PCR擴增電泳圖譜 electropherogram of recombinant plasmid PCR detection;M.Marker DL2000;1. BpGLK1質粒 BpGLK1plasmid;2.水water;3. pAbAi-BpGLK1-E1質粒 pAbAi-BpGLK1-E1 plasmid。圖3 pAbAi-BpGLK1-E1重組載體獲得Fig. 3 Acquisition of pAbAi-BpGLK1-E1 recombinant vector

2.2 Cas9蛋白的核酸酶活性

以pAbAi-BpGLK1-E1質粒載體為模板,采用BstEⅡ限制酶酶切得到線性化重組質粒。進而以線性pAbAi-BpGLK1-E1重組質粒為模板(含有BpGLK1靶序列),在含Cas9蛋白及gRNA的緩沖液中反應后(同時設置3組陰性對照:不加Cas9蛋白、不加gRNA、空載體),瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖4。

M.DL10000;1. gRNA-Cas9蛋白復合物 gRNA-Cas9 protein complex; 2. 無Cas9蛋白對照 no Cas9 protein;3. 空載(陰性對照)empty (negative control);4. 無gRNA對照no gRNA control。圖4 CRISPPR/Cas9靶位點活性檢測Fig. 4 Activity detection of CRISPPR/Cas9 target site

由圖4可知,1 155 bp左右可檢測到電泳譜帶,而3個對照組在1 155 bp左右則未見電泳譜帶,表明Cas9蛋白及gRNA復合體具有裂解活性。

2.3 白樺glkc基因編輯株系的獲得

以白樺成熟胚為材料,在無光照條件下進行愈傷組織誘導,25 d左右即可用于基因槍轟擊的受體。在基因槍參數設置為7 584.5 kPa爆破壓力,轟擊距離12 cm的條件下,用包被Cas9蛋白與gRNA(RNP)金粒轟擊白樺幼嫩愈傷組織,在分化培養過程中愈傷組織漸漸膨大(圖5a),隨后轉接到繼代培養基中培養25 d左右時,可見長高的不定芽。在繼代培養的不定芽中明顯可見葉色呈現黃綠色的編輯株系(命名為glkc)(圖5b),待30～40 d時與野生型白樺呈現明顯差異(圖5c、5d)。

a.愈傷組織callus;b.繼代培養的 glkc株系differentiated cultured glkc line;c.野生型白樺wild type;d. glkc株系glkc line。圖5 白樺glkc基因編輯株系的獲得Fig. 5 Acquisition of glkc gene editing line

2.4 glkc株系的分子檢測

以glkc株系的10株組培生根苗葉片總DNA為模板,用BpGLK1-gRNA-F、BpGLK1-gRNA-F特異引物對BpGLK1-E1片段進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示:glkc株系在900 bp左右有擴增譜帶(圖6a),進而將擴增譜帶回收后對其中5株進行測序。測序結果通過Bioedit軟件比對,發現測序結果一致,glkc編輯株系在BpGLK1基因的315～332 bp處有18個堿基缺失的純合突變(圖6b),結果說明,獲得的glkc株系為BpGLK1缺失突變株。

a.BpGLK1-E1序列擴增電泳圖譜electrophoretogram of BpGLK1-E1 target sequence amplification;M.Marker DL2000; 1—10. glkc株系組培生根苗 rooted seedling of glkc line by tissue culture; b.glkc基因編輯株系測序比對結果sequencing comparison result of glkc gene editing line。圖6 白樺glkc株系的分子檢測Fig. 6 Molecular detection of glkc line

3 討 論

近年來興起的CRISPR/Cas9 系統由于能夠精準進行基因編輯,已在基因工程領域廣泛應用。以往人們主要采用質粒轉染或直接轉染體外轉錄的Cas9 mRNA及gRNA等方法將Cas9蛋白和gRNA導入細胞,其中,質粒轉染可能導致外源基因(T-DNA或抗性基因)的插入[10];而直接轉染Cas9 mRNA 和gRNA的方式雖然避免了外源基因插入的發生,但存在著RNA易降解等問題[16]。RNP技術是近年興起的直接將Cas9蛋白和gRNA復合物導入細胞的新技術,即Cas9蛋白與gRNA在試管中孵育,通過靜電互作組裝形成Cas9/gRNA復合物(RNP)[17],導入細胞后即可發揮其基因編輯功能。RNP技術中體外表達的Cas9蛋白的活性和gRNA的精準性非常重要,因此,通常在進行基因編輯前需要對其進行活性檢測。本研究檢測顯示,體外表達的Cas9蛋白具有活性,gRNA也具有定點編輯功能。

植物中主要采用微粒轟擊或聚乙二醇(PEG)將Cas9/gRNA 復合物導入細胞,例如,Woo等[10]通過轉染CRISPR/Cas9 RNPs進入原生質體,獲得了基因組修飾的萵苣(Lactucasativa)。在擬南芥、煙草、矮牽牛(Petuniahybrid)、葡萄藤和蘋果的原生質體中也獲得了基因編輯突變體,但沒有再生突變植株[18-19]。白樺作為樹木,相對模式植物及農作物而言,研究比較滯后,從原生質體再生植物仍然是一個挑戰。另外,對于一些大粒種子的小麥(Triticumaestivum)、玉米等作物通常以未成熟胚為受體,利用微粒轟擊將CRISPR/Cas的核糖蛋白RNP導入植物組織細胞中[9, 20]。按前人經驗采用種子胚是一條有效途徑,而白樺種粒較小(長寬僅為1.5和1 mm),去除種皮操作過程較費時,故此,本研究通過將少量的種子胚在暗培養條件下進行愈傷誘導,培養獲得大量的松散愈傷組織,以此愈傷組織為受體利用基因槍將CRISPR/Cas核糖蛋白(RNP)微粒導入白樺細胞中,經過分化培養,即可獲得白樺glkc編輯株系。本研究利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白的無外源基因整合的基因編輯系統,以白樺合子胚誘導的愈傷組織為受體,采用微粒轟擊技術進行BpGLK1定向誘變,獲得了glkc編輯突變株,為創制林木無T-DNA插入突變體提供了新線索。該項研究優勢在于這種無T-DNA插入的無選擇標記的轉化方法,不需要經過有性雜交和自交將轉入的CRISPR/Cas9系統和編輯的靶位點編輯基因從個體中分開,可以在T0代中生成不含外源DNA的經過編輯的基因編輯株系。

研究證明,GLK基因家族成員在調控植物的葉綠體發育及葉綠素合成等方面至關重要,例如,擬南芥AtGLK1和AtGLK2雙突變體葉片表現為葉綠素含量降低,呈現黃色[21],在番茄(Solanumlycopersicum)中SIGLK1抑制表達株系其葉色呈現黃綠色,其葉綠素含量較對照株系降低[22]。對白樺、銀中楊(Populusalba×P.berolinensis)的研究也顯示,BpGLK1基因的缺失及干擾表達可通過影響葉綠體發育進而導致葉片葉綠素含量降低,葉片呈現鮮艷黃綠色[12-13, 23]。glkc突變株則不同,該株系通過CRISPR/Cas9編輯后,在BpGLK1基因的315～332 bp處有18個堿基的缺失,是由于堿基的缺失而導致BpGLK1基因編碼蛋白功能發生改變,該基因缺失突變產生新的未知蛋白,但從獲得的glkc編輯株系生長來看,這種突變是不利突變,glkc突變株的組培無根苗在生根培養基中生根能力較弱,不定根數量較少,在生根過程中苗木葉片漸漸變為白色,最后葉片干枯后衰老死亡。BpGLK1基因序列分析顯示,該基因共有6個外顯子,本實驗是在第1外顯子處設計的靶位點,后續還需在其他5個外顯子處設計靶位點,找到不影響白樺突變株系生長的編輯靶位點。