轉化生長因子β 對口腔軟組織纖維化疾病發生發展影響的研究進展

郭晶瑩, 潘啟源, 李 芳, 熊曼雯, 王若琳, 劉 敏

（吉林大學口腔醫院牙周科，吉林 長春 130021）

纖維化疾病通常以成纖維細胞的活化和細胞外基質（extracellular matrix，ECM） 的過度產生為主要表現，破壞相應器官和組織的正常結構，引起不同程度功能障礙，通常繼發于組織損傷后異常的愈合反應或由感染、缺血、過敏和自身免疫反應等因素導致的慢性炎癥引起［1-2］。在口腔疾病中，一些軟組織病變通常表現出明顯的纖維化特征，如家族性牙齦纖維瘤（hereditary gingival fibromatosis，HGF）、藥物性牙齦肥大（drug-induced gingival overgrowth，DIGO） 和口腔黏膜下纖維化（oral submucous fibrosis，OSF），組織學特征均表現為上皮釘突的形成和上皮下結締組織中膠原過度沉積［3-5］。過度沉積的膠原改變了牙齦和口腔黏膜的結構和外形，不僅會對患者的咀嚼、發音和美觀造成影響，更會形成不利于患者自潔的口腔環境，從而使纖維化持續進展且會增加患者罹患牙周疾病的風險。因此，了解口腔纖維化疾病發生發展的機制具有重要意義。盡管不同組織出現纖維化的原因不同，但纖維化疾病的發生發展均與轉化生長因子β（transforming growth factor- β， TGF- β） 有關。TGF-β 在纖維化組織中高表達，且其在口腔軟組織纖維化疾病中發揮重要作用。本文作者就TGF-β 的活化和信號傳導功能及TGF-β 對口腔軟組織纖維化疾病發生發展的影響進行綜述，旨在為口腔軟組織纖維化疾病的病因研究和臨床治療提供參考。

1 TGF-β 的活化和信號傳導

TGF-β 是一種分泌性的多功能生長因子，參與調節增殖分化、代謝凋亡、侵襲遷移和ECM 合成等一系列細胞活動，在纖維化疾病的發生發展中發揮重要作用［6］。TGF-β 有3 種亞型，分別為TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3。TGF-β1 能夠刺激成纖維細胞產生ECM，而TGF-β2 能夠通過減少自身表達代償性地調節TGF-β1 的過度產生，TGF-β3 則可以中和TGF-β1 和TGF-β2 產生的影響并抑制纖維化作用［7］。生物合成后，TGF-β 先與潛伏期相關肽（latency-associated peptide，LAP）非共價結合形成小的潛在復合物（small latent complex，SLC），再共價結合潛在TGF-β 結合蛋白（latent TGF-β-binding protein，LTBP）形成大的潛在復合物（large latent complex，LLC）［8］。大量TGF-β 以LLC 或SLC 的形式分泌并儲存于ECM中。TGF-β 被激活后才可在組織中發揮各種作用。TGF-β 的激活主要涉及2 個機制：纖溶酶、凝血酶和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等蛋白酶水解切割LAP 后，由LLC 中釋放活性TGF-β；細胞表面的整合素與LAP 的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD） 序列結合，傳遞ECM 硬化和細胞骨架變化引起的機械阻力，誘導LLC 構象的變化，導致活性TGF-β 的釋放［9］。整合素也可與MMP 相互作用，將MMP定位于潛在復合物，切割LAP 后釋放活性TGF-β。整合素αv（integrin alpha V，αv） 是潛伏性TGF-β局部激活的主要調控因子，其中整合素αvβ6和αvβ1分別介導纖維化病變上皮細胞和成纖維細胞表面TGF-β1 的活化［10］。此外，TGF-β 也可被血栓反應蛋白等特殊的基質蛋白或低pH、高溫、輻射、剪切應力和活性氧等特定的物理及化學條件激活［11］?；罨蟮腡GF-β 通過細胞表面的Ⅰ型TGF-β 受體（typeⅠTGF-β receptor，TβRⅠ）和Ⅱ型TGF-β 受體（type Ⅱ TGF-β receptor，TβRⅡ） 發揮作用。TβRⅡ的高親和力使其可直接與TGF-β 結合形成受體復合物，該復合物通過磷酸化TβRⅠ近膜結構域中的絲氨酸和蘇氨酸殘基激活TβRⅠ，并通過TβRⅠ的絲氨酸殘基進一步激活效應蛋白Smad。受體調控的（receptor-regulated，R） -Smad （即Smad2 或Smad3）與Smad4 結合形成復合體并進入細胞核，在核內與DNA 結合轉錄因子和輔助調控因子共同激活或抑制相關基因的表達［12］。TGF-β也可激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide-3 kinase， PI3K） 通路和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 通路等非Smad 通路［13］，這些通路既可以獨立發揮作用，也能夠與Smad 通路相互作用以更好地響應TGF-β信號［10］。

2 TGF-β 對口腔軟組織纖維化疾病發生發展的影響

ROBERTS 等［13］通過在新生小鼠皮下注射純化的TGF-β 成功誘導注射部位活化的成纖維細胞產生膠原蛋白，首次發現了TGF-β 在纖維化中的關鍵作用。隨后研究［9］進一步證實TGF-β 信號通路與ECM 基因表達及纖維形成有密切關聯。在口腔中，炎癥細胞、上皮細胞和成纖維細胞等多種細胞均可表達TGF-β［3，14］。而TGF-β 在纖維化組織中的異常表達提示其可能是口腔軟組織纖維化疾病的重要致病因子［14-15］。

2.1 TGF-β 對HGF 發生發展的影響HGF 是一種罕見的良性遺傳性疾病，可單獨發生或作為某些綜合征的伴發癥狀，表現為角化牙齦組織緩慢漸進性增生，增生的程度和范圍因人而異，可覆蓋部分或全部牙冠［3］。最早發現的基因突變發生于SOS1（Son of sevenless-1） 基因［16］，單胞嘧啶的插入使其活性增強，通過促進大鼠肉瘤（rat sarcoma，Ras） 蛋白上三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP） 與二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）的交換，間接激活Ras 蛋白，進而激活并磷酸化細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路。該通路可上調TGF-β 的表達，這可能是HGF 中TGF-β 高表達的原因之一［17］。該結果與TIPTON 等［18］的研究結果一致，該研究從HGF 和正常牙齦組織中提取成纖維細胞進行培養，發現HGF 來源的細胞能夠產生更多的TGF-β1 和TGF-β2。WRIGHT 等［14］對HGF 中TGF-β 亞型表達的研究顯示：HGF 中TGF-β1 表達水平明顯升高而TGF-β2 表達水平降低，且TGF-β1 表達水平升高可能抑制TGF-β2 表達水平降低和TGF-β3 發揮的抗纖維化作用，表明TGF-β1 是HGF 纖維化形成中的關鍵因子。

TGF- β1 對ECM 有雙重作用。 一方面，TGF-β1 可以促進ECM 合成。HGF 患者的牙齦組織中KCNQ1 表達增強，這是一種編碼鉀離子（K+）通道基因，其表達增強使外向K+電流增加，促進牙齦成纖維細胞中ECM 的合成。TGF-β1 和KCNQ1 編碼的通道形成正反饋回路，通過激活該通道促進ECM 積累［19］。TGF-β1 對Ⅰ型膠原的合成具有自分泌作用，即成纖維細胞自分泌TGF-β1控制膠原蛋白合成。在膠原合成過程中，單一的前膠原多肽在內質網中發生翻譯后修飾，形成三螺旋鏈并分泌至ECM 中。這一過程涉及位于內質網中的熱休克蛋白47（heat shock proteins 47，HSP47），其與Ⅰ型前膠原多肽結合防止前膠原鏈的過早折疊和聚集，并參與Ⅰ型前膠原多肽向ECM 的轉移和分泌。TGF-β1 可促進Ⅰ型膠原和HSP47 在成纖維細胞中的表達，且Ⅰ型膠原的過度生成與HSP47的合成增加有關［20-21］。TGF-β1 還可以刺激絲氨酸-甘氨酸生物合成途徑，提供增加膠原合成所需的額外甘氨酸［22］。另一方面，TGF-β 也可以抑制ECM分解。MMPs 對ECM 成分有降解作用，抑制其表達會使膠原蛋白和纖連蛋白等沉積進而引發纖維化。TGF-β 可能對MMP-1 和MMP-2 的表達改變同樣具有自分泌作用，添加TGF-β1 可以使正常牙齦成纖維細胞中MMP-1 和MMP-2 表達減少，并可能通過其下游Smad 抑制MMP-1 啟動子活性所介導［3，20］。 組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs） 對MMPs 具有特異性抑制作用，其與MMPs 的比值升高可造成膠原蛋白的過度沉積，TGF-β1 則可以上調其表達［17］。

TGF-β1 還可誘導肌成纖維細胞分化。肌成纖維細胞是介于成纖維細胞與平滑肌細胞之間的表型，當其被激活時能夠產生大量的ECM。肌成纖維細胞的出現是結締組織纖維化的共同特征［23］。SMITH 等［24］發現：TGF-β1 能夠誘導牙齦成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，這一過程是通過激活RhoA-Rho 相關蛋白激酶（Rho associated protein kinase，ROCK） 和c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK） 信號通路實現的。SOBRAL 等［25］發現：干擾素γ 能夠通過上調Smad7 表達進而抑制TGF-β1 對牙齦成纖維細胞分化的誘導作用，表明Smad 依賴性通路可能也參與了這一過程。SOBRAL 等［26］在其隨后的實驗中通過質粒轉染實現了Smad7 的過表達，進一步證實牙齦成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的過程確實有Smad 通路的參與，并且這一過程是由結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）介導的。CTGF 的啟動子中包含TGF-β1 響應元件和Smad 結合位點，TGF-β1 可以通過Smad 通路或JNK1 和Rho 通路誘導CTGF 表達，CTGF 可能也作為介質在纖維化中發揮作用［27-28］。該結論與BITU 等［23］認為HGF 中肌成纖維細胞的存在可能依賴于CTGF 表達水平的結果一致。此外，自噬可能也參與TGF-β1 誘導的肌成纖維細胞分化［29］。

研究［3］顯示：TGF-β1 通過增加細胞周期G1/S轉變和DNA 合成及縮短細胞周期的G1期促進成纖維細胞增殖。DE 等［30］發現：TGF-β1 以自分泌方式介導HGF 成纖維細胞G1/S 期轉變，應用中和抗體阻斷內源性TGF-β1 的產生和抑制其活性可以明顯減少HGF 中成纖維細胞的增殖，同時發現HGF成纖維細胞的增殖率明顯高于正常成纖維細胞，這一結論與JOHNSON 等［31］的研究結論相反。研究者［32］認為：增殖速率的差異是由于在正常和病變的牙齦組織中存在不同表型和功能的成纖維細胞亞群，但具體原因仍需要更多研究闡明。

2.2 TGF-β對DIGO 發生發展的影響DIGO 是由于長期服用某些藥物所引起的不良反應，表現為牙齦纖維性增生并覆蓋部分牙冠。能夠導致牙齦增生的藥物包括免疫抑制劑、鈣通道阻滯劑和抗癲癇藥物，最常見的為環孢素（cyclosporin A，CsA）、硝苯地平和苯妥英鈉。對DIGO 組織進行免疫組織化學染色發現TGF-β1 和TGF-β2 的表達水平升高而TGF-β3 的表達水平降低，證實成纖維細胞中TGF-β 表達水平與服用藥物有關。TGF-β 在DIGO中具有自分泌作用，牙齦纖維化可能是TGF-β1 表達增加和TGF-β3 表達降低的聯合作用［14］。并非所有服藥患者均會出現牙齦增生，且牙齦增生和纖維化的嚴重程度也與服用藥物的種類、劑量、持續時間和口腔衛生情況有相關［33］。

COTRIM 等［34］將牙齦成纖維細胞與CsA共培養發現其可促進人牙齦成纖維細胞TGF-β1表達和產生，抑制基質金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinases-1，MMP-1） 和 基 質 金 屬 蛋 白 酶 2 （matrix metalloproteinases-2，MMP-2）表達，但對TIMP-1和TIMP-2 的表達無明顯影響。CsA 還可以刺激成纖維細胞增殖并通過阻斷內質網鈣釋放抑制成纖維細胞對膠原的吞噬作用。由于TGF-β1 可誘導內質網和線粒體的鈣釋放并刺激細胞增殖，因此CsA的這一作用可能是由TGF-β1 介導的。而抑制TGF-β1 的產生可調節MMPs 的表達，表明在CsA誘導的牙齦組織過度生長中，TGF-β1 可能通過自分泌抑制人牙齦成纖維細胞的蛋白水解活性，從而使ECM 累積。此外，CsA 還可誘導牙齦上皮細胞發生上皮- 間質轉化 （epithelial-mesenchymal transformation，EMT）。FU 等［4］發現：CsA 處理后牙齦上皮細胞的形態發生改變，EMT 標志物表達增加，而TGF-β1 抑制劑可以阻止這一過程，表明CsA 誘導牙齦發生EMT 依賴或部分依賴于TGF-β1。研究［35］顯示：CsA 可誘導人牙齦成纖維細胞產生活性氧，通過抗氧化劑處理能夠改善CsA引起的TGF-β1 分泌增強和牙齦增生。且活性氧可通過激活潛在的TGF-β1 并刺激細胞表達及分泌TGF-β1 來促進纖維化。提示CsA 可能通過刺激活性氧的產生而促進TGF-β1 表達和牙齦增生。因此，CsA 可通過刺激成纖維細胞增殖、抑制膠原降解、誘導EMT 和刺激活性氧的產生誘導牙齦增生，而這些過程均需TGF-β 參與。

除TGF-β 外，由苯妥英鈉引起的DIGO 還可產生大量CTGF。CTGF 具有多種生物活性，能夠刺激細胞增殖并且誘導Ⅰ型膠原和纖連蛋白的產生從而加劇纖維化，還可促進細胞黏附并增強細胞外配體對信號傳導的響應，創造有利于纖維化形成的環境［36］。研究［37］顯示：TGF-β 可上調成纖維細胞中CTGF 的表達，但對上皮細胞中CTGF 的表達無明顯影響。TRACKMAN 等［38］認為：TGF-β 對牙齦成纖維細胞和上皮細胞中CTGF 的表達均有刺激作用。此外，CTGF 在DIGO 中還具有自分泌作用，持續的CTGF 自分泌能夠促進結締組織纖維化［37］。由TGF-β 作為啟動因子，CTGF 作為自分泌或旁分泌信號分子維持并放大組織中成纖維細胞的反應，在組織愈合過程中發揮調節級聯作用，級聯水平升高會導致纖維化［36］。此外，由苯妥英鈉引起的DIGO 中還具有不同于健康牙齦的炎癥細胞亞群，而炎癥在一定程度上可增加牙齦組織中的細胞凋亡。KANTARCI 等［39］發現：減少成纖維細胞凋亡可能對牙齦組織的纖維性增生具有促進作用，由于TGF-β1 可抑制獲得性免疫反應，刺激TGF-β/CTGF 通路可能會減少牙齦炎癥和成纖維細胞凋亡，從而促使牙齦增生。此外，炎癥有助于基底膜的破壞，可能會導致上皮和結締組織之間不適當的因子擴散，從而維持上皮細胞中CTGF 的表達，該過程可能也涉及EMT［40］。

鈣通道阻滯劑硝苯地平能夠以某種方式增強TGF-β 信號傳導從而增加骨膜蛋白的表達。骨膜蛋白作為一種ECM 蛋白，可以通過與加工ECM 蛋白前體的功能性結構相互作用促進ECM 的生物合成，導致纖維化［38］。氨氯地平使牙齦組織中的白介素17A （interleukin-17A，IL-17A） 表達增加，加劇TGF-β 對EMT 的影響，通過TGF-β 刺激Ⅰ型膠原表達增加和EMT 誘導纖維化［41］。因此，EMT 可能是DIGO 中普遍存在的致病原因。

研究［33］顯示：在DIGO 中有多種物質通過TGF-β 發揮作用，共同參與牙齦成纖維細胞的活化。TGF-β 在過度生長的牙齦組織中高表達可能是由炎癥細胞和牙齦間充質細胞產生的因子相互干擾引起的，尤其是肥大細胞。在細胞的顆粒中儲存潛在的TGF-β，經蛋白酶激活后分泌TGF-β，可能是導致牙齦過度生長的關鍵驅動力。研究［42］表明：肥大細胞可能對纖維化具有誘導作用。有學者［43］發現：肥大細胞有刺激成纖維細胞增殖和膠原合成的潛力，因此其認為纖維化的發生需要肥大細胞和TGF-β 等因子的共同參與。血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）和內皮素1 也可由肥大細胞衍生而來。AngⅡ通過牙齦成纖維細胞中的AngⅡ 1 型受體上調TGF-β1 的表達，在牙齦成纖維細胞中通過TGF-β 和細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK） 誘導膠原蛋白的產生，而TGF-β1 又可以通過激活素受體樣激酶5（recombinant activin receptor like kinase 5，ALK5）和Smads 直接刺激AngⅡ1 型受體表達［44］。因此，TGF-β1 和AngⅡ可能存在自分泌環作用，TGF-β/AngⅡ通路可能協同驅動體內的纖維化反應。內皮素1 可調節TGF-β 的合成，并且可作用于TGF-β/AngⅡ通路的下游，驅動成纖維細胞活化和纖維化［33］。

2.3 TGF-β 對OSF 發生發展的影響OSF 是一種伴有疤痕形成和組織纖維化的癌前病變，通常好發于頰黏膜，在確診3~16 年后進展為口腔癌，癌變率7%~26%［15］。組織病理學的特征性表現為口腔黏膜上皮萎縮至增生或發育不良的階段性改變及上皮下結締組織中膠原的過度沉積和局部慢性炎癥，隨著疾病的進展還會出現肌肉的退行性改變，導致患者出現張口受限等癥狀［5］。引起OSF 最常見的原因是咀嚼檳榔。咀嚼檳榔時，檳榔粗糙的纖維會引起口腔黏膜組織的微創傷，從而繼發上皮組織炎癥，激活T 淋巴細胞和巨噬細胞分泌細胞因子，其中包括在OSF 發生發展中發揮重要作用的細胞因子TGF-β［45］。

TGF-β 能夠通過激活COL1A2、COL3A1、COL6A1、COL6A3 和COL7A1 等前膠原基因，明顯增加膠原蛋白的產生，同時也可通過激活TIMP基因和纖溶酶原激活物抑制劑來阻止膠原降解［5］。此外，在OSF 中發揮重要作用的蛋白酶和基質交聯酶也受到TGF-β 的影響。OSF 中主要的蛋白酶包括賴氨酰氧化酶和轉谷氨酰胺酶2，賴氨酰氧化酶能夠催化膠原蛋白和彈性蛋白前體中的賴氨酸殘基形成醛，而轉谷氨酰胺酶2 能夠催化轉酰胺基?；D移酶反應，使膠原纖維的交聯發生改變，增加膠原的降解抗性，使基質穩定進而導致纖維化［46］。

MOUTASIM 等［47］發現：檳榔的主要成分檳榔堿在口腔角質形成細胞中通過毒蕈堿型乙酰膽堿受體M4上調αvβ6的表達，αvβ6與TGF-β1和TGF-β3 的亮氨酸氨基肽酶（leucine arylamidase，LAP） 結合，促進TGF-β 活化?；罨蟮腡GF-β1 誘導肌成纖維細胞轉化并上調與組織纖維化相關基因的表達，導致ECM 積聚，促進OSF 的發生發展。此外，HSIEH 等［48］發現：檳榔堿可使頰黏膜成纖維細胞中的線粒體產生活性氧，細胞氧化還原狀態的改變和氧化應激的增加促進了TGF-β 的激活。潛在的TGF-β1 被活性氧激活后可能通過間變性淋巴瘤激酶（anaplastic，ALK）5、JNK 和p38/MAPK通路刺激CTGF 的合成［49］。咀嚼檳榔引起的頰黏膜微創傷和過度激活的凝血級聯反應也通過活性氧途徑介導CTGF 等次級介質合成，發揮促纖維化作用。由此可見，檳榔堿/活性氧/TGF-β 通路可能成為預防和治療OSF 的新靶點之一。盡管角質形成細胞是TGF-β1 的主要來源，但異常表達的TGF-β1 也可由成纖維細胞產生。有研究［15］顯示：在無刺激因素存在或上皮受損的情況下，成纖維細胞無法表達更高水平的TGF-β。αvβ6可以激活TGF-β，因此上皮來源的TGF-β1 與αvβ6共同參與OSF 組織中成纖維細胞的活化，表明上皮細胞可能也是OSF 組織中異常表達TGF-β 的重要來源［47］。KHAN 等［46］發現：檳榔及其主要成分多酚和生物堿對上皮細胞中TGF-β 通路具有誘導作用，而其對成纖維細胞中促纖維化基因的表達幾乎無直接影響，上皮細胞中由檳榔誘導產生的TGF-β 通過誘導膠原蛋白等ECM 成分產生對成纖維細胞發揮促纖維化作用。PANT 等［50］發現：檳榔堿與TGF-β 協同活化成纖維細胞，促進纖維化基因表達。但檳榔堿不能引起成纖維細胞中TGF-β 及其受體的改變，表明其作用于上皮后誘導TGF-β 的分泌，再作用于成纖維細胞。提示檳榔通過TGF-β 發揮作用，EMT 可能也在OSF 的發生發展中發揮作用。

3 總結與展望

目前，關于以HGF、DIGO 和OSF 為代表的口腔軟組織纖維化疾病的病因及其致病機制尚未完全闡明?？谇卉浗M織纖維化疾病發生發展過程中重要的促進因子TGF-β 主要通過刺激前膠原基因等纖維化相關基因增加ECM 的合成，同時通過抑制蛋白酶的表達和改變膠原交聯減少ECM 的降解和誘導組織中的成纖維細胞活化，并分化為肌成纖維細胞及誘導上皮細胞發生EMT，使上皮細胞和結締組織相互作用進而發揮其致病作用。

TGF-β 在口腔軟組織纖維化疾病中的作用具有個體和組織特異性。TGF-β 同時也是成纖維細胞中蛋白質翻譯和營養吸收的有效刺激因子，可增加葡萄糖消耗和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP） 合成速率，且TGF-β 介導的膠原沉積和肌成纖維細胞分化伴隨葡萄糖攝取、糖酵解代謝和氨基酸生物合成途徑的激活［22］。

綜上所述，不同組織中TGF-β 的具體來源及其活化的具體機制、誘導纖維化的靶細胞類型和具體通路等方面還需大量的研究進一步闡明，該過程中糖代謝的改變也是未來重要的研究方向。