肉制品中卡那霉素膠體金快速檢測試紙條的研制

伍智蔚,董 露,韓佳佳

(1.中國科學院 沈陽應用生態研究所,遼寧 沈陽 110015; 2.沈陽市食品藥品檢驗所,遼寧 沈陽 110122)

0 引言

卡那霉素分為鹽酸卡那霉素和硫酸卡那霉素,它是一種蛋白質生物合成抑制劑[1].卡那霉素作為一種氨基糖苷類抗生素,因其價格低廉且抗菌性廣的特點,而被人們廣泛使用在動物養殖中,但是其使用不規范導致越來越多的動源性食品中殘留超標[2].醫學研究表明,卡那霉素使用不當會對人體產生嚴重的毒副作用[3-6].因此,規范卡那霉素的使用,對確保食品安全進而保障人們健康具有重大意義.目前,食品中卡那霉素殘留的檢測方法以儀器分析法為主,常用的有高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質譜法等[7].此外,還有電化學檢測法、比色法、熒光法以及酶聯免疫分析法等[8-10].上述方法雖然靈敏度高,但操作復雜,價格昂貴,且受儀器數量限制.因此,很有必要研究一種快速、經濟、簡便的檢測方法.

膠體金快速檢測試紙條是食品安全檢測中常用的一種檢測手段[11],具有便攜、快速、原地檢測等特點,可以大大降低檢測成本,提高檢測效率.本文研制了一種卡那霉素膠體金檢測試紙條,以實現對肉制品進行卡那霉素殘留的快速檢測.

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和材料

1.1.1 主要儀器

UV759CRT型紫外-可見分光光度計(青島聚創華業分析儀器有限公司),BSA224S型分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司),TGL-16A型高速臺式離心機(常州邁科諾儀器有限公司),AM-5250C型恒溫磁力攪拌機(天津奧特賽恩斯儀器有限公司),PHS-3C型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司),DMT-2500X型旋渦振蕩器(南京互川電子有限公司),JYEB-60型超純水機(北京嘉遠環?？萍加邢薰?.

1.1.2 材料

氯金酸、蔗糖、檸檬酸三鈉、碳酸鉀、磷酸鹽緩沖液、PEG-20000、Tween-20,上述試劑均為分析純,購于國藥集團試劑有限公司.

超純水(18.2 MΩ·cm),自制.

PVC底板、硝酸纖維素膜(CN95/CN140)、樣品墊、金標墊、吸水紙,購于上海杰一生物技術有限公司.

肉制品(鮮豬肉、臘肉、罐頭等),購于生鮮超市.

牛血清白蛋白、抗原、卡那霉素標準品、卡那霉素單克隆抗體、青霉素、氨芐青霉素,購于賽默飛世爾科技公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 膠體金溶液的制備

采用檸檬酸三鈉還原法來配制膠體金溶液.首先在錐形瓶中加入50 mL超純水和1 mL 1%氯金酸,搖勻后將其放入到恒溫磁力攪拌器中加熱至沸騰,停止升溫,然后迅速加入2.0 mL 1%檸檬酸三鈉溶液,繼續保溫5 min.當看到溶液變紅時停止加熱,冷卻至室溫,采用超純水定容至100 mL,密封保存備用[12].

1.2.2 金標抗體的制備與鑒定

1.2.2.1 金標抗體的制備

首先在離心管中加入1 mL膠體金溶液,用0.1 mol/L的碳酸鉀溶液調節pH值至8.3,并加入20 μL卡那霉素抗體溶液(0.2 g/L),混勻,靜置15 min.然后加入牛血清蛋白溶液20 μL,密封靜置25 min.最后在高速離心機中離心25 min(溫度4 ℃,離心力24 200 g),移除上清液,加入膠體金復溶液(采用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液、0.5% Tween-20、5%蔗糖、0.1%牛血清蛋白和0.1% PEG-20000配伍制備)溶解沉淀物,混勻,4 ℃條件下冷藏待用.

1.2.2.2 膠體金標記抗體的鑒定

首先吸取3 μL的二抗溶液在硝酸纖維素膜上劃一條線,待完全干燥后,吸取3 μL的膠體金抗體溶液劃在之前的那條線上,自然晾干.然后吸取超純水劃在那條線上,如果線上出現紅色的點,那么說明膠體金標記抗體是成功的.

1.2.3 試紙條的組裝和檢測方法

1.2.3.1 試紙條的組裝

如圖1所示,按照順序將硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊、吸水紙一次粘貼在相應位置.首先吸取已經確定好濃度的二抗,在硝酸纖維素膜上劃一條質控線,吸取已經確定好濃度的抗原,在硝酸纖維素膜上劃一條檢測線.然后以1%牛血清白蛋白溶液作為封閉液對硝酸纖維素膜進行封閉和干燥.吸取最適噴涂量的金標抗體劃到硝酸纖維素膜上,置于室溫下干燥.最后使用工具將試紙條進行切割,將切割好的試紙條密封保存于塑料盒內,待用.

圖1 試紙條的組裝

1.2.3.2 試紙條的測定方法

吸取50 μL的待測樣液滴于微孔板中,將試紙條帶有樣品墊的一端(見圖1中的S位置)插入含有待測樣液的微孔板中.通過觀察可以發現,待測物質通過層析作用與金標墊處的抗體相遇,如果待測物與抗體沒有完全結合,那么層析到檢測線處(見圖1中的T線)就會與抗原結合,從而在檢測線處顯現紅色.未完全結合的金標抗體層析到質控線處(見圖1中的C線)與二抗反應,從而在質控線處顯現紅色.如果待測物與抗體完全結合,那么層析到檢測線處就不會有較為清晰的紅色,接著層析到質控線處,在質控線處出現較為清晰的紅色.

1.2.4 試紙條制備條件優化

1.2.4.1 試紙條材料的選擇

首先吸取樣品溶液分別劃在型號為CN95和 CN140的硝酸纖維膜上,然后將其放入37 ℃的干燥箱中烘干.吸取膠體金標記抗體溶液分別劃在之前劃線的位置,最后根據線上的顏色的深淺來選擇較好型號的硝酸纖維素膜.

1.2.4.2 金標抗體最佳稀釋度和噴涂量

用金標墊處理液按照2、4、6倍的稀釋倍數分別稀釋純化好的金標抗體.在控制其他條件不變的情況下,分別在硝酸纖維素膜上噴灑噴涂量分別為30 μL/cm2、50 μL/cm2和70 μL/cm2的金標抗體稀釋液,通過對比不同稀釋度和不同噴涂量的硝酸纖維素膜的變化情況,來選擇金標抗體最佳稀釋度和噴涂量.

1.2.4.3 硝酸纖維素膜上抗原與二抗最佳濃度

將抗原分別稀釋為1.0 g/L、1.5 g/L和1.8 g/L的抗原稀釋液,將二抗分別稀釋為1.0 g/L、1.2 g/L和1.5 g/L的二抗稀釋液.分別吸取上述被稀釋后的抗原和二抗溶液10 μL,在硝酸纖維素膜上劃一條檢測線,分別加入10 μL濃度為0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L和150 μg/L的卡那霉素標準液,最后通過硝酸纖維素膜上的檢測線的顯色情況來選擇抗原和二抗的最佳濃度.

1.2.5 試紙條的性能測試

1.2.5.1 試紙條靈敏度檢測

分別將卡那霉素標準品濃度為0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、150 μg/L和200 μg/L的溶液各取50 μL置于微孔板中,然后將試紙條帶有樣品墊的一端插入微孔板中,根據試紙條的變化情況來判斷試紙條的靈敏性.

1.2.5.2 試紙條特異性檢測

分別將濃度為0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、150 μg/L和200 μg/L的卡那霉素、青霉素、氨芐青霉素溶液置于微孔板中,然后將試紙條帶有樣品墊的一端插入微孔板中,根據試紙條的變化情況來判斷試紙條的特異性.

1.2.5.3 試紙條穩定性檢測

將制作好的試紙條分別置于自然暴露環境、4 ℃恒溫箱環境和真空環境等三個環境下保存3個月,分別隨機抽取各組試紙條(保證取樣的隨機性與結果的準確性)進行穩定性測試(根據試紙條的靈敏度和特異性的變化來確定試紙條的穩定性).最終通過不同保存時間下試紙條靈敏度和特異性的檢測結果來確定試紙條的穩定性.

1.2.6 數據處理

通過SPSS和Origin軟件對實驗中的數據進行處理與作圖,每組實驗平行重復三次,記錄檢測結果.

2 結果與分析

2.1 膠體金溶液的鑒定結果

圖2為膠體金溶液的紫外-可見分光光度計掃描圖.從圖2可知,該膠體金溶液的最大吸收峰波長為520.6 nm.將其代入公式:Y(顆粒粒徑)=0.427 1X(λmax)-211.60,計算得出膠體金顆粒粒徑為10.74 nm,符合膠體金粒徑應用標準[12].

圖2 膠體金溶液紫外可見分光光譜掃描圖

2.2 試紙條的制備條件優化結果

2.2.1 材料優化結果

實驗結果如圖3所示.CN95的質控線比CN140的質控線顏色更深、更明顯,所以選擇CN95硝酸纖素膜.

圖3 不同硝酸纖維素膜的顯色

2.2.2 金標抗體稀釋度和噴涂量優化結果

不同稀釋度和不同噴涂量的測試結果見表1.根據表1中結果,最佳稀釋度為2倍,最佳噴涂量為50 μL/cm2.

表1 金標抗體不同稀釋度和噴涂量的顯色情況

2.2.3 抗原與二抗的濃度優化結果

表2為不同濃度的抗原和二抗的顯色情況.根據表2中的實驗數據和硝酸纖維素膜上的顯色情況,最終選擇抗原濃度為1.5 g/L,二抗濃度為1.2 g/L.

表2 不同濃度的抗原和二抗的顯色情況

2.3 試紙條的性能測試結果

2.3.1 試紙條靈敏度

靈敏度實驗結果如圖4所示.由圖4可知,試紙條的最低檢出限為100 μg/L.該檢出限滿足豬肉制品國家標準規定的卡那霉素檢出限(100 μg/L).

注: 由右至左卡那霉素標準品濃度分別為0、50、100、150和200 μg/L.圖4 試紙條檢出限測定結果

2.3.2 試紙條特異性

特異性檢測結果如表3所示.通過測試不同濃度的卡那霉素、青霉素、氨芐青霉素等物質的顯色情況,發現試紙條對卡那霉素具有明顯的特異性.

表3 特異性檢測結果

2.3.3 試紙條穩定性

試紙條分別在自然暴露環境、4 ℃恒溫箱環境和真空環境下保存3個月后的特異性檢測結果如表4所示,靈敏度結果如圖5所示.通過試紙條靈敏度和特異性的檢測結果可知,試紙條的穩定性好.

表4 不同環境中特異性檢測結果

圖5 不同環境中靈敏度測定結果

2.3.4 實際樣品測定

采用本文建立的試紙條法,對購于生鮮超市的鮮豬肉、臘肉、罐頭制品各10份進行抽樣檢測.結果表明,卡那霉素在樣品中均未檢出,符合國家標準規定的檢出限(100 μg/L)[13].

3 結論

建立了一種快速、簡便的針對肉制品卡那霉素殘留的檢測方法.

根據上述最佳條件制作出的試紙條檢測肉制品卡那霉素殘留的最低檢測限為100 μg/L,該檢出限滿足豬肉制品國家標準規定的卡那霉素檢出限.該檢測方法能夠用于肉制品的卡那霉素殘留的快速檢測,而且經濟、簡便,具有實用價值.