依托咪酯檢測方法研究進展

□汪予佳

(西南政法大學,重慶 401120)

隨著我國禁毒打擊力度的加大,傳統毒品供應大幅降低,國內常見毒品貨源短缺、價格高漲,毒品買不到、吸不起成為普遍現象。吸毒人員為緩解毒癮,轉而尋求其他麻精藥品、新精神活性物質以及未列管的藥品進行替代使用,其中包括麻醉藥品依托咪酯。為應對依托咪酯濫用和非法制售所造成的危害,國家藥監局、公安部、國家衛生健康委員會于2023年9月6日聯合發布關于調整麻醉藥品和精神藥品目錄的公告,將依托咪酯(在中國境內批準上市的含依托咪酯的藥品制劑除外)列入第二類精神藥品目錄。此前,已有研究報道通過LC-MS /MS、GC-MS等技術對依托咪酯使用者的血液、尿液、毛發樣本進行檢測,皆驗證了其方法的可行性,這些檢測方法研究主要目的是為了監測臨床使用中人血漿依托咪酯濃度,用以判斷給藥劑量和血藥濃度范圍以保證用藥安全。[1-4]而出于法醫學或刑事偵查需要的依托咪酯檢測方法研究較少,無法滿足當前公安禁毒工作的需要。本文針對司法實踐需求,總結了現有依托咪酯檢測技術的優勢和不足,認為在提高檢測靈敏度、精簡樣品前處理程序和開發高通量初篩方法等方面還需要引起更多研究人員的關注。

一、依托咪酯概述

依托咪酯是一種基于咪唑的γ-氨基丁酸A型(GABAA)受體激動劑,用于誘導全身麻醉和鎮靜。它最初是作為一種抗真菌藥物被開發出來,其催眠作用在一次動物實驗中被偶然發現。[5]依托咪酯在肝臟和血漿內可被酯酶迅速水解為無活性的羧酸和乙醇,80%的代謝物一般通過尿液和膽汁排出,只有不到2%的藥物以原形排出,其中代謝物的主要成分為依托咪酯酸。[6-7]如圖1所示,依托咪酯的臨床衍生物包括甲氧羰基依托咪酯、[8-9]環丙基甲氧羰基依托咪酯、[10]羰基依托咪酯[11]及ET-26鹽酸鹽[12]等。

圖1 依托咪酯及其臨床衍生物結構示意圖

在醫學臨床使用中,依托咪酯已被發現會造成腎上腺抑制、肌陣攣、惡心嘔吐、注射疼痛、肌張力反應不良、損害長期記憶能力、氧飽和度下降和心動過緩發作等多種不良反應。[13]而現實案例中被濫用的含依托咪酯成分的毒品,不但所摻依托咪酯含量不明,還經常同時摻雜其他種類毒品或藥品,具體組成成分和比例復雜多樣,危害性難以判斷,因此所引起的生理毒性反應必然較臨床使用上更為猛烈。此外,司法實踐中發現吸毒者大劑量吸食依托咪酯會引起偏執、焦慮、恐慌、被害妄想癥等精神方面的問題,嚴重者會精神錯亂、行為失控,如吸食依托咪酯后自殘、傷人或引發交通肇事肇禍等,嚴重危害群眾身體健康和社會安全穩定。[14-15]

二、依托咪酯的檢測方法

《吸毒檢測程序規定》中明確,吸毒檢測包括現場檢測、實驗室檢測和實驗室復檢。尿液、毛發等生物樣本的實驗室檢測結果屬于鑒定意見,是認定吸毒行為的有力證據。在司法實踐中,用于依托咪酯現場初篩的尿檢試劑盒已經投入使用,但隨著列管規定的生效,非法吸食、運輸和制販皆有可能按毒品相關違法或犯罪處理。在這種情況下,不論是檢察院的批捕起訴還是法庭的合法審判,都需要對所繳獲毒品中依托咪酯的有無、數量、純度等有明確的定性定量檢測結果。

(一)非生物檢材中依托咪酯的檢測

根據國家藥監局網站信息,依托咪酯作為藥品,以兩種形式被批準,分別為原料藥和注射制劑。中國藥典(2005版)二部中采用吸收系數法測定依托咪酯注射制劑含量,高效液相色譜法(HPLC)測定依托咪酯,該HPLC法以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以甲醇-0.062%醋酸銨溶液(60∶40)為流動相;檢測波長為240 nm,柱溫為50 ℃。[16]2010年,王發[17]等對藥典提供的HPLC檢測方法進行細化用以測定依托咪酯注射液,該方法采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(150 mm×4.6 mm×5 μm),以0.062%醋酸銨溶液-甲醇(55∶45)為流動相;流速為1.0 mL/min;檢測波長為241 nm;柱溫為35 ℃,實驗結果表明依托咪酯與雜質分離良好,在0.01～10×104mg/mL質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系(r=0.9999),線性方程為y=27037.6x-14181.0,方法回收率為99．3%(n=9),相對標準偏差(RSD)為0.6%。2014年,李志琴[18]等進一步改進HPLC檢測法對依托咪酯脂肪乳注射液進行定量檢測,使用大連伊利特HypersilBDS C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)色譜柱,流動相為乙腈-0.01 mL磷酸銨(含1%四丁基溴化銨,磷酸調PH=6.5)(50∶50),流速為1.0 mL/min,檢測波長為243 nm,柱溫為50℃。實驗結果顯示依托咪酯在1.6～2.4×105ng/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系(r=0.9997),線性方程y=55.113x-103.4,方法回收率為99.8%(n=9),RSD為0.81%,依托咪酯檢測限為0.18 ng。該方法在流動相加入陽離子試劑四丁基溴化銨,樣品溶解后可以過濾為澄明溶液,檢測峰型更好,依托咪酯與各雜質之間均達到良好分離?！吨腥A藥典》更新至2020版后,有關依托咪酯的檢測方法依舊沿用通則0512提供的HPLC法。2023年,馬雅茹等[19]采用HPLC法測定依托咪酯衍生物甲氧依托咪酯,使用Waters X-SelectC18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm) ,流動相A為 pH 2.0磷酸溶液,流動相B為甲醇和乙腈(5∶100)的混合溶液,實驗結果顯示甲氧依托咪酯與8種有關物質可完全分離,甲氧依托咪酯的最低檢測限為 80 ng/ml。

總體而言,這些檢測方法都是基于藥典方法操作步驟層面的細化探索,并未涉及新的檢測技術或復雜樣品檢測等方面。司法實踐中,依托咪酯在進入非法渠道從上游往下游的流通過程中,會在各環節被添加多種雜質或其他列管物質。如,在所查獲的依托咪酯電子煙煙油、煙粉中發現摻有氟胺酮、可卡因、尼古丁、香精等其他成分?，F有的檢測方法能否應對現實的復雜情況,對摻雜物進行有效分離,開發新的快捷檢測方法,則需要研究人員進一步探索。

(二)生物檢材中依托咪酯的檢測

血液、毛發、尿液是目前毒品檢測中最常用的三種生物檢材。血液檢測具有即時性,準確度高,但樣本采集為侵入性,檢測程序復雜且成本高。毛發檢測可以反映長達數月的吸毒史,但存在一定的延遲性。尿液檢測是最常用的檢測方法,能夠反應一周內的吸毒情況。

1.血液檢測

臨床醫學上對血液檢材中存在的依托咪酯及其代謝物進行檢測,用以量化藥物在體內的作用強度,從而實現監測麻醉效果的目的。自1979年開始,已有關于檢測含有依托咪酯血液的方法,其中最常用的是HPLC法。Le[20]采用HPLC法檢測血液中依托咪酯的含量,使用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(25cm×4.6 mm),流動相為乙腈-甲醇-0.025M磷酸鹽緩沖液(30∶40∶30)(用28%氨水28%調節pH為8.1),流速設為1.2 mL/min,檢測波長為242 nm。實驗結果顯示依托咪酯在10～200 ng/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系(r=0.9993),線性方程y=0.002768x+0.005956,方法回收率為98±2%(n=9),依托咪酯檢測限為5 ng/mL。盡管這一方法已經獲得了較高的準確度,但采用該方法檢測前需要通過復雜的液液萃取法提取血液中的依托咪酯,操作過程繁瑣,且必須在20℃的工作溫度下對溶劑進行蒸發干燥,萃取條件高。McIntosh[21]等人改進了血液中依托咪酯的萃取方法,將樣品前處理時間縮短到40 min以內,然后采用前述Le等人提供的HPLC法對血液中的依托咪酯進行檢測,實驗表明依托咪酯在50～5000 ng/mL的濃度范圍內呈線性關系(r=0.99),回收率在97%～104%之間,檢測限為50 ng/mL。此后,隨著聯用技術的發展,液質聯用分析技術也被應用于依托咪酯檢測。Remane[22]等采用超高效液相色譜-串聯質譜聯用法(UPLC-MS/MS)提出一種多藥物篩選和定量的分析程序,對血漿中的阿芬太尼、鹽酸芬太尼、舒芬太尼、依托咪酯、氯胺酮、嗎啡和吡硝胺這七種藥物進行選擇性檢測,梯度洗脫采用TFHypesil GOLD苯基色譜柱(100×2.1 mm,1.9 mm),流動相為10 mM甲酸銨水溶液加0.1%甲酸(pH 3.4),流速為500 mL/min。除阿芬太尼和嗎啡外,所有藥物均獲得了準確度較高的定量檢測結果,其中以依托咪酯的檢測效果最為突出,其檢測的低質量控制樣品(QCLow)為6.5×104ng/mL,該濃度要遠高于正常醫療情況下血液中依托咪酯的含量,且研究也并未展示其所檢測藥品的最低檢測限。Hyesun[23]等將液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)用于分析血液樣品中的依托咪酯,依托咪酯10～500 ng/ml范圍線性關系良好(r2=0.999),最低檢測限為10 ng/mL,依托咪酯在48小時內的回收率在94%～95%之間,7天后的回收率在89%～100%之間,具有較高的穩定性。該方法被成功應用于一例人類尸體血液樣本中依托咪酯檢測,發現股血中依托咪酯的濃度為110 ng/mL,心臟血中為210 ng/mL。氣相色譜法(GC)也與其他精密檢測儀器耦合用于血液中依托咪酯的檢測。Luhmann等[24]將氣相色譜儀與氮磷探測器相聯用于檢測血液中的依托咪酯。選用25 m×0.32 mm色譜柱,采用氦氣為載氣,流速為1.6 mL/min。氮氣為補充氣,流速為2.9×104μL/min,注入器和探測器的溫度分別保持在250 ℃和300 ℃,等溫分離溫度為195 ℃。實驗結果顯示在0.5～250 ng/mL范圍內依托咪酯的峰面積呈良好的線性關系,線性回歸方程y=1.056x-3.828(r2= 0.9979),方法回收率為75%。

Xiao等[25]針對依托咪酯的高沸點和高蛋白結合率,提出一種高效率熱解吸注入結合脈沖凈化的方法,將離子遷移譜(IMS)用于檢測血液中的依托咪酯。檢測過程如圖2所示,實驗結果表明在檢測濃度0.1～10 ng/μL-1的范圍內,信號強度與依托咪酯濃度呈線性相關(r2=0.994),線性方程為y=0.08x+0.06,檢測限為0.017 ng/μL-1,RSD<10%。雖然該方法在靈敏度方面稍微遜于色譜法及聯用技術,但所達到的定量范圍已滿足臨床醫學上依托咪酯的有效血藥濃度范圍為1.25～3.75 ng/μL-1的監測要求,具有分析時間短、預處理工藝簡單、成本較低等優點。

圖2 脈沖吹掃熱解吸離子遷移率光譜儀示意圖

綜上所述,有賴于臨床醫學觀察的需要,依托咪酯的血液檢測方法得到了一定程度的發展,檢測技術相對成熟。但仍然存在樣品前處理程序復雜、檢測成本高、檢測周期長等缺陷;其次,這些檢測研究中使用的血液檢材主要為空白血樣中添加依托咪酯的實驗室自制血液樣品,沒有考慮其代謝物的檢測。而在司法實踐中毒品檢測所面臨的個體情況復雜,不但需要考慮代謝物的檢測,而且對于檢測方法的選擇性、抗干擾性、時效性等具有更高的要求。另外,據文獻統計分析發現,現有的關于依托咪酯的血液檢測的研究主要服務于臨床醫學對于麻醉藥品使用的監測,國內外關于依托咪酯的毒品檢測或藥物濫用鑒定的專門性研究均較少。

2.尿液檢測

依托咪酯在肝臟中被酯酶快速代謝為依托咪酯酸,大部分通過尿液形式排出體內,尿液檢材較血液檢材更易收集。2019年,Jung等[26]使用LC-MS/MS同時測定尿液中依托咪酯及代謝物依托咪酯酸,該方法選用多孔石墨碳柱(50×2.1 mm,5.0 μm),流動相A 為0.05 %甲酸水溶液,流動相B為50%乙腈∶50%甲醇。該方法不需要采用液-液萃取或固相萃取等任何前處理方式。該方法通過改變流動相、色譜柱和分析條件,在6.5 min內分對尿液樣本中的依托咪酯及其代謝物依托咪酯酸進行檢測分析,依托咪酯和依托咪酯酸的標準曲線分別在0.40～120.0 ng/mL和1.0～300.0 ng/mL范圍內呈良好線性關系,測定系數均大于0.9958,最低檢測限分別為0.4 ng/mL和1.0 ng/mL,日內(n=6)和日間(n=24)偏差分別小于10.2%和8.4%。另外,他們對使用過依托咪酯人員的尿液進行檢測,驗證了該方法的適用性,但具體實驗數據尚未在論文中展示。2020年,Huang等人[27]開發出了一種基于DNA-金納米粒子(AuNP)偶聯物的傳感器陣列(如圖3所示),可以簡單快速地檢測和識別水溶液和人體尿液中的九種麻醉藥物,包括戊巴比妥鈉、咖啡因、嗎啡、瑞芬太尼、芬太尼、氯胺酮、依托咪酯、卡芬太尼和舒芬太尼。該方法的傳感機制是基于DNA-AuNP結合物對每種麻醉藥物的不同比色反應,再輔以偏最小二乘法判別析方法用于藥物分析,彌補了無法裸眼區分依托咪酯與舒芬太尼的光譜差異的缺陷,使這9種藥物的識別準確率達到100%。該研究為開發基于尿液檢材的現場即時檢測傳感器提供了新方向和思路。

圖3 三聯傳感器陣列和化學計量學法測定9種麻醉藥品

相較于血液檢測而言,尿液檢測具有取樣方便、樣品前處理程序簡單、檢測周期短等優勢,在開發快速和高通量檢測技術方面具有更大的研究潛力,關于其在依托咪酯檢測中的應用,有待研究人員的進一步探索。

3.毛發檢測

吸毒人員通常通過一周不吸食毒品的方式逃避檢測,然而毛發里的毒品可以存是3至6個月,是確定長期給藥和推算給藥時間的最佳生物樣本。Park等[28]使用LC-MS/MS法檢測毛發中依托咪酯及其代謝物,選用Kinetex?C18柱(50×3 mm,2.6 μm),柱溫度保持在30°C。流動相A為水溶液和乙腈(均含2 mM甲酸銨),流動相B為0.2%甲酸,流速為400 μL/min,進樣量為3 μl。質譜儀使用電噴霧電離,采用正離子模式掃描,反吹氣(CUR)30 psi;離子噴霧電壓(IS)5500 V,溫度550°C,離子源氣體1為60 psi,離子源氣體2為40 psi。待測的毛發樣本經過蒸餾水和甲醇洗滌以去除可能的污染物,LC-MS/MS檢測條件優化后,色譜分離時間縮短為10 min,依托咪酯和依托咪酯酸的線性范圍分別為25～50 pg/mg和2～250 pg/mg,r2>0.997,依托咪酯和依托咪酯酸的檢測偏差分別在5.36%～8.37%和7.95%～9.88%之間。該方法在低、中、高三個濃度條件下的回收率均高于85%。李雪蕾等[29]采用高效液相色譜-三重四極桿質譜法檢測毛發中的依托咪酯,選用電噴霧離子源(ESI)液相色譜柱(100mm×2.1mm 5μm),流動相A為乙腈,流動相B為20 mM乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液,流速350 μL/min,正離子掃描模式,電噴霧電壓3000 V,離子源溫度550 ℃,去簇電壓30 V;進樣量5 μL,柱溫28 ℃。檢測結果表明依托咪酯的在 0.1～2.0 ng/mg 的范圍內線性良好,r2>0.9991,檢出限為0.05 ng/mg。所配制三個濃度(0.1 ng/mg、0.5 ng/mg和2.0 ng/mg)的添加毛發樣本的回收率在101.35%～112.74%之間,毛發基質無干擾。采用該方法對公安機關送檢的421份涉毒人員毛發和12份實驗室技術人員的空白毛發進行檢測。實驗結果表明,12份空白毛發組均未檢出依托咪酯成分,而涉毒人員毛發組中中有115份檢出依托咪酯,陽性檢出率為 27.3%。該方法為在頭發樣本中進行依托咪酯檢測提供了一個較好的參考。

毛發是非侵入性檢材,更易于收集和儲存,其中毒品和藥物存在穩定,檢測窗口期長可達到半年[30]。因此,為應對當前依托咪酯的濫用現狀,建立一種使用毛發樣本的依托咪酯分析方法在實務取證將具有重要意義。

三、總結與展望

依托咪酯作為傳統毒品替代物被濫用的時間較短,毒品檢測領域內關于該物質的研究尚未受到廣泛關注。被列管后,非法吸食、制販或運輸依托咪酯類產品將構成違法或犯罪,有關依托咪酯的檢測需要也必將日益增加。根據司法實務中所面臨的現實情況及現有檢測技術的發展現狀,認為依托咪酯檢測技術應加強以下三方面的研究:

(一)不同摻雜物及其他毒品對依托咪酯檢測的影響

一方面,市場上非法流通的依托咪酯電子煙類產品中常常摻雜了其他毒品、藥品、香精等成分,這些摻雜物可能會對依托咪酯的檢測產生干擾。這些摻雜物可能包括一些合成毒品,如MDMA、CBD等,這些毒品可能會與依托咪酯產生相互影響,導致依托咪酯的檢測結果出現誤差。此外,一些藥品如利多卡因、羅紅霉素等也可能與依托咪酯發生相互作用,導致檢測結果不準確。另一方面,吸毒人員通常存在不同種類毒品混吸的情況,體內可能能夠檢測出多種毒品成分。這些毒品成分之間可能會相互作用,對依托咪酯的檢測產生影響。例如,一些毒品成分可能會改變依托咪酯在體內的代謝過程,導致其在體內的濃度發生變化,從而影響檢測結果。因此,這些成分的存在是否會干擾依托咪酯的檢測需要引起研究人員的關注。為了解決這個問題,研究人員需要進行深入的研究,了解不同毒品成分對依托咪酯檢測的影響,并探索如何準確檢測依托咪酯的方法。這有助于保障公共安全,打擊毒品犯罪,并為吸毒人員提供更好的治療康復監管。

(二)依托咪酯的現場高通量檢測方法

目前,依托咪酯的檢測技術主要基于血液、尿液和毛發等生物檢材。其中,血液檢測技術的發展較為成熟,起步較早,但前處理程序復雜、檢測成本高、檢測時間長等缺陷限制了其在現場執法中的應用。相比之下,尿液和毛發檢測技術雖然起步較晚,但具有較高的靈敏度和較低的檢測成本,因此在現場執法中具有更好的應用前景。然而,目前尿液和毛發檢測技術的發展仍存在一些問題。例如,尿液檢測的靈敏度較低,可能無法準確檢測出低濃度的依托咪酯;而毛發檢測的前處理程序較為復雜,需要經過多次洗滌和萃取等步驟才能獲得準確的檢測結果。因此,開發一種高效、靈敏、低成本的現場高通量檢測方法成為了司法實務中的迫切需求。納米材料傳感器的發展為實現這一目標提供了新的研究方向和思路。納米材料傳感器具有高靈敏度、高選擇性、低成本等優點,可以實現對生物檢材中的依托咪酯進行快速、高效的檢測。同時,納米材料傳感器的體積較小,方便攜帶,可以適用于各種現場環境。

(三)依托咪酯代謝物和衍生物的檢測研究

目前,大多數現有的檢測技術都未涵蓋對依托咪酯代謝物的深入研究,這使得我們在面對現實中的復雜情況時,難以準確應對。在過去的打擊非法制售芬太尼類和合成大麻素類毒品的工作中,我們發現非法制毒者為了獲得更多類型的毒品以牟取暴利并逃脫法律制裁,很有可能通過改變依托咪酯類物質的空間結構來開發新的衍生物。目前臨床上已經開發出多款依托咪酯衍生物,但關于這些衍生物的檢測研究尚未受到足夠的關注。因此,我們需要針對依托咪酯代謝物和衍生物優化現有的檢測方法,或者開發新的檢測技術。這不僅有助于有效打擊毒品犯罪,也能提高我們在司法實務中的應對能力。綜上所述,依托咪酯代謝物和衍生物的檢測研究在司法實務中具有極其重要的意義,值得我們投入更多的資源和精力去研究和開發更有效的檢測方法和技術。

新興毒品的檢測技術在司法實務和法庭科學研究領域都具有重要的意義。業內研究人員應積極致力于研究開發高效、靈敏的依托咪酯檢測方法,以助力公安機關禁毒工作的開展,同時豐富法庭科學研究內容。