一株產表面活性劑菌株的篩選、培養條件優化及產物性質

肖燕然,周爽姿,李 爽,張思宇,李 雪,孟珈同,付永平,韓雪容,

(1. 長春理工大學 生命科學技術學院,吉林 長春 130000;2. 吉林農業大學 植物保護學院 食藥用菌教育部工程研究中心,吉林 長春 130000)

生物表面活性劑是微生物在代謝過程中產生的,具有親水端和疏水端的一類次級代謝產物。根據親水端的結構不同,可分為糖脂類、氨基酸類和磷脂類生物表面活性劑等[1-3]。其中,糖脂類表面活性劑由糖(親水端)和脂肪酸(疏水端)構成。按糖的結構不同,又可分為4類:鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂和甘露糖赤蘚糖醇酯[4]。Pseudomonasaeruginosa、Bacillussubtilis、Aspergillussp.MSF1和BacillussubtilisTU2等不同菌屬的細菌都具有合成鼠李糖脂的能力[5-8]。其中,由Pseudomonasaeruginosa代謝產生的一種含有五碳糖基的鼠李糖脂可以作為化學合成表面活性劑的替代品,是近年來最有希望實現工業化量產的生物表面活性劑[9-10]。

生物表面活性劑在石油開采、環境、醫藥和農業等領域都發揮著重要作用[11]。鼠李糖脂不僅可作為助劑,提高石油的開采量;而且可以促進甲烷水合物的形成,提高能源利用效率[12]。鼠李糖脂和槐糖脂都具有廣普的抗菌活性,可作為食品添加劑在食品工業中被廣泛應用[13]。在醫療領域,雙鼠李糖脂具有殺死肌成纖維細胞的能力;槐糖脂能減弱乳腺癌細胞的遷移;海藻糖則具有調節免疫的作用,可用于瘢痕的治療、抗腫瘤藥物的開發和免疫保健品的研制[14]。甘露糖赤蘚糖醇酯可以促進微生物細胞在葉片表面的分散和固定,因而可以被應用于農業領域[15]。

隨著生物表面活性劑在不同領域的廣泛應用,其市場需求也在不斷增加。然而,利用微生物發酵生產生物表面活性劑面臨著生產菌株有限、菌株生產力低、合成成本高以及合成產物結構多樣等問題[16]。本研究以污水廠底泥為篩選源,使用含糖培養基,篩選出一株具有生產生物表面活性劑的純菌株。利用鏡檢、革蘭氏染色,以確定菌株形態及陰陽性,并根據16S rDNA序列分析鑒定菌株的種屬分類,進一步對菌株的培養條件進行優化。然后利用薄層層析(TLC)和含糖量測定,初步對菌株發酵產物進行鑒定。最后對菌株的發酵產物的乳化性能及表面張力等性質進行評價,以期為豐富生物表面活性劑生產菌,開發發酵生產流程及表面活性劑的應用提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培養基

LB培養基:胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L,純水1 000 mL,pH 7.0。

LB固體培養基:每100 mL LB培養基中加入瓊脂粉1.5 g。

1.1.1.1 無機鹽基礎培養基

母液(g/L):Na2HPO4·12H2O 9.0、KH2PO41.5、NH4Cl 0.5、MgSO4·7H2O 0.2。

1.1.1.2 微量元素(g/L)

FeCl39.7×10-3、CaCl27.8×10-3、CoCl2·6H2O 0.13×10-3、CuSO4·5H2O 0.16×10-3、NiCl3·6H2O 0.12×10-3、CrCl3·6H2O 0.11×10-3。

1.1.1.3 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)固體平板

基礎無機鹽培養基100 mL中加入瓊脂粉1.5 g、亞甲基藍0.005 g和CTAB 0.02 g。

1.1.2 儀器和試劑

1.1.2.1 主要儀器

SPX-250型搖床培養箱,上海市博訊實業有限公司醫療設備廠;5424R型高速冷凍離心機,德國eppendorf公司;P-1型層析缸,廣州市三合化玻儀器部;RE-52A型旋轉蒸發儀,上海市亞榮生化儀器廠;FD-1D-80型凍干機,北京市博醫康實驗儀器有限公司;JYW-200A型自動界面張力儀,承德市精密試驗機有限公司。

1.1.2.2 主要試劑

葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、辛酸鈉、月桂酸鈉、淀粉、石蠟和CTAB,上海市源葉生物科技有限公司;辛酸乙酯、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、苯酚、HCl、H2SO4、NH4Cl、KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4和CH3COONH4,天津市光復精細化工;鼠李糖脂標品,西安市瑞捷生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的篩選

1.2.1.1 樣品的采集

用50 mL滅菌管,取長春市西郊污水廠底泥6份,分別編號后保存于4 ℃冰箱。

1.2.1.2 富集培養

根據文獻[17]的方法,在無菌條件下,將采集到的樣品分別加入30 mL無菌水,180 r/min搖床振蕩混合12 h,于30 ℃靜置30 min后,取上清液5 mL接種到裝有100 mL LB培養基的搖瓶中,放在搖床中以180 r/min、30 ℃振蕩培養14 h,即得富集液。

1.2.1.3 菌株的初篩

根據文獻[18]的方法,取富集液,用無菌水進行10-4、10-6和10-8倍的梯度稀釋后,涂布于含有質量分數1%植物油的LB平板培養基上,于30 ℃培養36 h。挑取有較大排油圈的單菌落,在LB固體平板上得到初篩菌株。

1.2.1.4 菌株的復篩

根據文獻[19]的方法,挑取經初篩純化后的單菌落,以180 r/min、30 ℃,于LB培養基中培養3 d,在5 000 r/min、以4 ℃離心10 min,除去菌體,保留上清液。將上清液滴入裝有液體石蠟膜和蒸餾水的平皿中,形成排油圈,選取排油圈直徑最大的菌株,保存于-80℃冰箱。

1.2.1.5 菌株的種屬鑒定

以篩選菌株基因組DNA為模版,利用通用引物27F/1492R,進行菌株的16S rRNA基因片段的PCR擴增,將提純的DNA片段插入pQE-80L質粒后,轉染E.coliJM109,以獲得菌落。挑取單菌落培養后,提取質粒,進行測序,以獲得分離菌株的16S rRNA基因的堿基序列。獲得的基因堿基序列與NCBI中基因庫的細菌進行同源性比對,利用MEGA (7.0.26)制作系統樹,以確定種屬并命名。

1.2.2 菌株培養條件的優化

1.2.2.1 溫度與pH的優化

根據文獻[20-21]的方法,取保存菌種50 μL,加入 5 mL LB液體培養基中,以27 ℃、180 r/min擴大培養14 h。以體積分數5%的接種量,接種5 mL于裝有100 mL LB培養基的三角燒瓶中,于16、27、37和42 ℃搖床中培養,每隔1 h取1 mL菌液置于石英比色皿中,于595 nm測定吸光度,通過測定的數據繪制該菌的溫度生長曲線。

每個溫度分別進行3組平行實驗,取平均值。用同樣方法優化菌株的pH (6、7、8和9)。每個pH分別進行3組平行實驗,取平均值。

1.2.2.2 碳源與氮源的優化

根據文獻[22]的方法,將5 mL活化后的菌株發酵液以體積分數5%的接種量,分別加入含有質量分數為1%碳源的100 mL無機鹽培養基中(含葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、辛酸鈉、月桂酸鈉、淀粉和食用油),在27 ℃、pH 7.0下培養3 d后,于5 000 r/min條件下離心10 min后,棄去上清,收集菌體后凍干至恒質量。

每組碳源優化分別進行3組平行實驗,取平均值。同樣方法將質量分數為1%的氮源(含NH4Cl、KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4和乙酸銨)加入質量分數為1%葡萄糖的100 mL無機鹽培養基,優化菌株的氮源。每組氮源優化分別進行3組平行實驗,取平均值。

根據文獻[23]的方法,利用酸沉淀-溶劑萃取法,分別提取發酵液中的表面活性劑,真空冷凍干燥至恒質量,測定表面活性劑的產量。

1.2.3 菌株發酵液中產物的提取(酸沉淀-溶劑萃取法)

根據文獻[24]的方法,將20 mL活化菌株接種于以體積分數1%葡萄糖為碳源的1 L無機鹽培養基中,在27 ℃、pH 7.0和180 r/min條件下培養3 d。發酵液在5 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min,除去菌體,收集發酵液。將發酵液調pH至2.0,于4 ℃靜置過夜。將過夜后的發酵液以10 000 r/min、4 ℃離心20 min后,收集絮狀物沉淀。將絮狀物沉淀的pH調至7.0,用乙酸乙酯萃取 3次,通過旋轉蒸發儀去除有機溶劑后,得到黃色黏稠狀物質,真空冷凍干燥至恒質量。

1.2.4 菌株發酵產物荷電性的檢測 (CTAB培養法)

根據文獻[25]的方法,將擴大培養后的菌株發酵液稀釋10-2、10-4和10-6倍后,涂布于含有質量分數1%葡萄糖的CTAB固體平板上,于27 ℃恒溫靜置培養2 d,通過觀察單菌落顏色來判斷菌株發酵產物的電荷性(若產生藍色的單菌落,則為陰離子表面活性劑)。

1.2.5 菌株發酵產物的薄層層析(TLC)檢測

將提取的0.1mg發酵產物和0.1 mg鼠李糖脂標準品分別溶于5 mL氯仿中,展開劑為氯仿與甲醇的混合溶液,體積比為1∶1,顯色劑為苯酚-H2SO4溶液。將展開劑倒入層析缸,靜置20 min,將樣品與鼠李糖脂標準品點樣于硅膠板上,待完全干燥后,放入含有展開劑的層析缸中,至距離硅膠板上方1 cm處時停止。待硅膠板上展開劑揮發干凈后,均勻噴灑顯色劑,并于70 ℃烘箱中加熱20 min,觀察其顏色的變化。

1.2.6 菌株發酵產物糖含量的檢測

分別取鼠李糖脂0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 g/L各0.5 mL,加入0.5 mL體積分數為 6%的苯酚溶液,加2.5 mL濃H2SO4后,置于冰水浴中輕微振蕩并混勻,室溫靜置20 min,于490 nm處測定不同質量濃度鼠李糖的吸光度。根據文獻[26]的方法,以鼠李糖脂質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,制作標準曲線。利用和鼠李糖脂標準品相同的調制方法,制備待測樣品并測定其吸光度,利用標準曲線計算提取物中的鼠李糖脂質量濃度。

1.2.7 菌株發酵產物的分散作用(排油圈法)

根據文獻[27]的方法,在培養皿中加入20 mL蒸餾水和3 mL液體石蠟,待液體石蠟覆蓋蒸餾水表面后,加入質量濃度為0.04 g/mL菌株發酵產物水溶液100 μL與相同濃度、相同體積的鼠李糖脂標準品,于室溫下測量排油圈的直徑。

1.2.8 菌株發酵產物乳化性質的測定

室溫下取2支試管,分別加入3 mL液體石蠟,再分別在2個試管中各加入3 mL質量濃度均為0.04 g/mL的菌株發酵產物水溶液與鼠李糖脂標準品水溶液,振蕩2 min,靜置24 h后,測量試管中乳化層高度 (h1)和液體總高度(h),計算乳化指數E,E=h1/h×100%。

1.2.9 菌株發酵產物表面張力的測定

用去離子水,將菌株發酵產物稀釋成質量濃度為40、50、60、70、80、90、100和110 mg/L的水溶液,作為檢測樣品,進行表面張力的測定(表面張力發生明顯轉折點的濃度即為臨界膠束濃度(CMC)),測試方法為吊環法,于25 ℃測定。

2 結果與分析

2.1 篩選菌株的鑒定與培養條件的優化結果

2.1.1 篩選菌株的形態特征結果

通過初篩與復篩,得到一株排液狀石蠟直徑較大的菌株,結果見圖1。由圖1可知:該菌株在LB平板培養基上菌落較小,呈圓球狀,邊緣規則。該菌株的革蘭氏染色結果表明其為革蘭氏陰性菌(圖2)。

圖1 Pseudomonas libanensi PbA單菌落形態Fig.1 Single colony morphology of Pseudomonas libanensi PbA

圖2 Pseudomonas libanensis PbA革蘭氏染色結果Fig.2 Gram staining results of Pseudomonas libanensis PbA

2.1.2 篩選菌株的種屬鑒定結果

利用Genebank中BLAST對菌株的16S rRNA基因序列(1 397 bp,Genebank ID:MH930445)進行同源性比對,選擇與該菌株相似性較高的菌株構建系統進化樹,發現該菌株與Pseudomonaslibanensis(KT767978)的16S rRNA基因序列相似度達100%,因此,將其命名為PseudomonaslibanensisPbA (圖3)。

圖3 Pseudomonas libanensis PbA的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Pseudomonas libanensis PbA

2.1.3 菌株PseudomonaslibanensisPbA培養條件的優化結果

2.1.3.1 菌株PseudomonaslibanensisPbA溫度和pH的優化結果

PseudomonaslibanensisPbA培養溫度和pH生長曲線見圖4和5。由圖4可知:該菌株可生長的溫度為16 ～37 ℃,溫度升高至42 ℃后,菌株未見增殖。由圖5可知:該菌株可生長的pH為6～9。因此,菌株的最適培養條件為溫度27 ℃、pH 7。

圖4 Pseudomonas libanensis PbA的溫度生長曲線Fig.4 Temperature growth curve of Pseudomonas libanensis PbA

圖5 菌株Pseudomonas libanensis PbA的pH生長曲線Fig.5 pH growth curve of strain Pseudomonas libanensis PbA

2.1.3.2 菌株Pseudomonaslibanensis PbA碳源和氮源的優化結果

菌株PseudomonaslibanensisPbA的碳源優化結果見圖6。由圖6可知:菌株在含有質量分數為1%的蔗糖、葡萄糖、辛酸、果糖、麥芽糖和食用油的無機鹽培養基中均可生長,其中葡萄糖為最佳碳源。此時,菌體干質量為0.74 g/L。Soberon-chavez等[28]的研究結果表明:在菌株的生長過程中,不同氮源會影響菌株產表面活性劑的產量,因此,需優化選擇該菌株的氮源。實驗結果表明:在以葡萄糖為碳源時,菌株PseudomonaslibanensisPbA使用NH4Cl和KNO3生產生物表面活性劑的產量要高于對照組,使用質量分數為1%KNO3為氮源,鼠李糖脂產量可提高14.5% (圖7)。

圖6 Pseudomonas libanensis PbA的碳源優化Fig.6 Carbon source optimization of Pseudomonas libanensis PbA

圖7 Pseudomonas libanensis PbA的氮源優化Fig.7 Nitrogen source optimization of Pseudomonas libanensis PbA

總結以上結果,篩選到一株與Pseudomonaslibanensis16S rRNA基因序列相似度達100%的菌株,將其命名為PseudomonaslibanensisPbA,在27 ℃、 pH 7且含有質量分數為1%葡萄糖和質量分數為1% KNO3的優化培養條件下,表面活性劑產量可達0.54 g/L,比未優化前提高了17%。筆者得到的菌株盡管屬于Pseudomonassp.,但還沒有生產生物表面活性劑的報道,因此對其提取物進行了進一步的分析。

2.2 菌株發酵產物的初步鑒定結果

2.2.1 菌株發酵產物荷電性能的檢測結果

表面活性劑根據其解離能力的不同,可分為陰離子型、陽離子型和非離子型表面活性劑。表面活性劑的荷電性能直接影響其性質及應用領域,使用CTAB培養法鑒定該菌株發酵產物的荷電性能,結果見圖8。由圖8可知:在CTAB固體平板培養基上,菌落周圍形成了深藍色圈,證明該菌株發酵產物為陰離子型,可用于吸附或沉淀帶正電的水污染溶液。

圖8 Pseudomonas libanensis PbA的荷電結果Fig.8 Charging results of Pseudomonas libanensis PbA

2.2.2 菌株發酵產物的TLC結果

為了鑒定該菌株產物的分類,利用TLC初步檢測了其與鼠李糖脂標準品的相似度,結果見圖9。由圖9可知:1為菌株發酵產物樣品;2為鼠李糖脂標準品,二者均出現了一個明顯的棕色斑點,且出現位置相同,證明該菌株發酵產物組分單一,因此,初步判定其為糖脂類物質。

圖9 菌株發酵產物的TLC結果 Fig.9 TLC results of product

2.2.3 菌株發酵產物的糖含量測定結果

將菌株的發酵產物稀釋50倍,鼠李糖脂標準品稀釋100倍后,分別測得490 nm的吸光度為0.14、 0.101。根據鼠李糖脂標準曲線的線性回歸方程Y=2.942 6X+0.000 3,計算得發酵產物及鼠李糖脂標準品中糖含量分別為2.34、3.37 g/L(圖10)。糖含量的測定結果不同,可能因為該產物親水端含有不同于標準品的鼠李糖脂結構。

圖10 鼠李糖脂的標準曲線Fig.10 Standard curve of rhamnose

基于以上分析,初步鑒定該菌株產物為糖脂類表面活性劑。糖脂類表面活性劑的親水端和疏水端結構復雜,親水端可能是單糖、雙糖或多糖的混合物;疏水端可能是飽和或不飽和脂肪酸以及帶羥基的脂肪酸等。因此,鑒定其親水端和疏水端的化學結構需要借助進一步的儀器分析。

2.3 菌株發酵產物的性質測試結果

2.3.1 菌株發酵產物的分散性能測試結果

分散與乳化性能是衡量表面活性劑的重要指標。因此,利用排油圈法測定了菌株發酵產物的分散性能。以沒有任何添加的水溶液作為陰性對照,結果見圖11。由圖11可知:菌株發酵產物和鼠李糖脂標準品的添加質量濃度為0.04 mg/mL時,排油圈直徑分別為5.6和3.7 cm,表明提取物比鼠李糖脂標準品具有更好的分散性能。

圖11 菌株發酵產物的排油圈結果Fig.11 Results of oil drain ring of extracting surfactant

2.3.2 菌株發酵產物的乳化性能結果

利用液體石蠟對表面活性劑的乳化性能結果見圖12。由圖12可知:當發酵產物質量濃度為0.04 mg/mL時,其乳化指數為60.3%,與同濃度鼠李糖脂標準品的乳化指數(62.1%)差別不大,該結果表明,篩選菌株提取的發酵產物的棕黃色膏狀物具有良好的乳化性質。

注:a為鼠李糖脂標準品,b為菌株發酵產物圖12 菌株發酵產物的乳化性質Fig.12 Emulsion property of extracting surfactant

2.3.3 菌株發酵產物表面張力和臨界膠束濃度的測定結果

為了進一步分析菌株發酵產物作為表面活性劑的特性,測定了其表面張力,并計算了其臨界膠束濃度(圖13)。由圖13可知:隨著菌株發酵產物質量濃度從0.4 g/L增加至大于1.1 g/L,溶液的表面張力從65.3 mN/m降低到54.1 mN/m,之后逐漸變得平穩。曲線變化趨勢的拐點代表表面活性劑的CMC,為106 mg/L。其臨界膠束濃度遠小于化學表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS),而與非離子表面活性劑吐溫相差不大。

圖13 菌株發酵產物的表面張力Fig.13 Surface tension of extracted surfactant

基于以上分析,菌株發酵產物的分散性能優于鼠李糖脂標準品,乳化活性與鼠李糖脂標準品相當,其表面張力可降低至54.1 mN/m。朱湧[29]的研究結果表明:鼠李糖脂的表面張力通常為30 mN/m左右。兩者間的顯著差異說明該菌株發酵產物可能是一種具有新型結構的生物表面活性劑,將在以后的研究中進一步分析其化學結構。

3 結論

通過富集、分離篩選,從污水廠底泥中篩選到一株能夠產表面活性劑的菌株,經形態學觀察和分子生物學檢測,鑒定為假單胞菌屬,命名為PseudomonaslibanensisPbA。在27 ℃、 pH 7和質量分數為1%葡萄糖作為碳源的條件下,添加質量分數為1% KNO3,獲得發酵產物為0.54 g/L。該菌株的發酵產物可能為糖脂類陰離子表面活性劑,在質量濃度為0.04 mg/mL時,排油圈直徑為5.6 cm,優于鼠李糖脂標準品,乳化指數為60.3%,與標準品類似。隨著質量濃度的增加,產物的表面張力從65.3 mN/m (質量濃度為0.4 g/L時) 減小至54.1 mN/m(大于質量濃度106 mg/L時);其臨界膠束濃度為106 mg/L,與通常鼠李糖脂的表面張力降低至30 mN/m左右相比,差別較大,后續將對產物繼續進行深入研究,包括成分的鑒定和化學結構的分析,并探尋此差別的原因。本研究為豐富生物表面活性劑生產菌,開發發酵生產流程及表面活性劑的應用提供了基礎數據。