快速樣品前處理技術-超高效液相色譜串聯質譜法測定糧谷中7種真菌毒素

殷錫峰,梁紅芳,張文文,吳琴燕

(1. 鎮江市農產品質量檢驗測試中心,江蘇 鎮江 212009;2. 江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所中心實驗室,江蘇 句容 212400)

真菌毒素是真菌在特殊條件下產生的有毒次生代謝產物[1],目前已知真菌毒素有400多種,危害較大的主要有嘔吐毒素(DON)、黃曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)等[2-6],其不易被破壞,在加熱或加工過程中穩定存在[7-10],是重要的慢性飲食危險因素,過度食用會導致機體免疫抑制、器官損傷和生殖紊亂,對人類的生命安全造成嚴重威脅[11]。

目前真菌毒素檢測常用的凈化方法有固相萃取法、免疫親和柱法和超臨界萃取法,這些凈化方法常用于單一類真菌毒素的提取[12],而由美國農業部Anastassiades 教授等于2003年開發的一種快速樣品前處理技術(quick、easy、cheap、effective、rugged和safe,QuEChER)憑借快速、簡單、便宜等優勢,成為真菌毒素前處理的有效手段[13-14];超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)技術具有強大的分離能力和較高的靈敏度,是真菌毒素檢測領域最為可靠的定量定性分析方法[15]。行業標準LS/T 6133—2018《糧油檢驗主要谷物中16種真菌毒素的測定液相色譜-串聯質譜法》中給出了16種真菌毒素的同位素內標液質聯用同時檢測方法,其前處理過程復雜,檢測成本高[16]。因此,確定一種經濟、簡單的多種真菌毒素分析方法對糧食監管和食品安全意義重大。

本研究綜合QuEChERS方法和UPLC-MS/MS技術的優勢,快速凈化糧谷樣品中7種真菌毒素,在保證高回收率的情況下,簡化前處理步驟,以期實現糧谷樣品中7種真菌毒素的快速定性定量測定。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

4份小麥樣品于2021年收獲于鎮江農科院行香科研基地,紅豆、玉米和花生等21份糧谷樣品購于本地零售超市和拼多多網上商城。

試劑及耗材:乙腈(色譜純),美國默克公司;乙酸銨(≥98%,色譜純),德國CNW公司;甲酸(≥99%)、氨水(≥25%)、乙酸按(≥99%),為液質專用試劑,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;質量濃度均為2.00 mg/L的標準品黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2),上海源葉生物科技有限公司;10 mg/L赭曲霉毒素A(OTA)、100 mg/L玉米赤霉烯酮(ZEN)和100 mg/L嘔吐毒素(DON),美國romer國際貿易有限公司;質譜用水為屈臣氏蒸餾水;N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化碳(GCB),上海昕滬實驗設備有限公司。

分別取7種毒素標樣0.2 mL,利用體積分數84%的乙腈水溶液定容至20 mL,制成混合標準品母液。利用初始流動相將混合標準品母液稀釋成適當濃度的混合標準品工作液,現配現用。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290型UPLC系統、ABsciex 4500質譜檢測器,安捷倫科技(中國)有限公司;H2050R型離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;AWL-020I-P型超純水系統,艾科浦儀器有限公司;XP105DR 型電子天平,賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 色譜和質譜條件

液相色譜柱為Agilent C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱溫40 ℃,進樣量1 μL,流速0.25 mL/min。梯度洗脫程序為0～1 min,90%水相(A);1～4.5 min,90%～10%A;4.5～6 min,10%A;6～6.10 min,10%～90%A;6.10～10 min,90%A。

離子源為電噴霧離子源;掃描方式為正負離子切換掃描;檢測方式為質譜多反應監測(MRM),氣簾氣為35;電噴電壓為5 500 V(或-4 500 V);溫度為450 ℃;氣體離子源1溫度為40 ℃;氣體離子源2溫度為40 ℃。其他優化的質譜條件表見表1。

表1 7種真菌毒素的MRM質譜參數

1.4 色譜條件優化及樣品前處理

1.4.1 色譜條件優化

將8 μg/L的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和OTA以及250 μg/L的 DON和ZEN制成混合標準品溶液,以乙腈和水為流動相,考察甲酸、氨水和乙酸銨添加量對水相中離子化效率的影響。

1.4.2 提取溶劑的優化

準確稱取粉碎的小麥樣品5 g于50 mL離心管中,樣品中添加混合標準品母液1 mL,加入提取溶劑乙腈(體積分數84%)的水溶液20 mL,考察提取溶劑中甲酸(0、0.5%、1%、2%、4%和8%)對7種毒素加標回收率的影響[17]。

1.4.3 凈化劑的優化

小麥樣品加標提取后,離心取2 mL上清液,分別按照0、10、20、35和50 mg/g小麥的量加入PSA和GCB,振蕩凈化30 min后,考察凈化劑及其用量對7種真菌毒素加標回收的影響。

2 結果與討論

2.1 流動相優化結果

根據7種毒素化合物的理化性質,選擇乙腈為有機相,水相分別選擇5 mmol/L乙酸銨、5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)和5 mmol/L乙酸銨(含0.01%氨水),正負離子切換掃描,7種毒素的離子響應強度如表2所示。

表2 7種真菌毒素的質譜離子響應強度

通過在水相中添加少量的甲酸、乙酸銨和氨水改變流動相的pH,可以改善峰形,提高質譜離子化效應[18],AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和OTA為正離子掃描,在酸性條件下易離子化;DON和ZEN為負離子掃描,在堿性條件下易離子化。由表2可知:由于DON在流動相有甲酸的條件下無信號,而在堿性流動相條件下,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和OTA仍有較高的響應強度。

綜合考慮,采用乙腈和5 mmol/L乙酸銨(含0.01%氨水)為流動相,通過優化洗脫梯度,使色譜峰效果最佳,各毒素的色譜峰如圖1所示。

圖1 7種真菌毒素色譜圖Fig.1 The chromatogram of seven mycotoxins

2.2 方法的線性關系、檢出限和定量限

梯度稀釋標準品母液2、4、8、16、32、64、128和256倍作為標準品溶液,以待測物的質量濃度(X,μg/L)為橫坐標,定量離子的峰面積(Y)為縱坐標,繪制標準曲線,分別以3倍和10倍信噪比(S/N)所對應的待測濃度計算檢出限(LODs)和定量限(LOQs),結果如表3所示。由表3可知:7種毒素在一定的范圍內呈良好的線性關系,相關系數(R2)均大于0.991,LODs為0.02～13.22 μg/L,LOQs為0.08～39.55 μg/L,符合實際檢測要求。

表3 7種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限

2.3 前處理條件優化結果

2.3.1 提取劑的優化結果

由于7種毒素化學結構和理化性質不同,提取溶劑的選擇是檢測過程中最重要的環節,直接影響回收率的高低。赭曲霉毒素和黃曲霉毒素多使用乙腈與水的混合液為提取劑,并加入一定的酸進行酸化[19-20],本研究在提取溶劑中加入0～8.0%甲酸,考察不同酸體積分數提取對7種真菌毒素回收率的影響,結果如表4所示。由表4可知:7種毒素在體積分數0.5%甲酸提取時有較高的加標回收率,AFB2和AFG2的加標回收率均從65%左右分別顯著提高至72.32%和83.76%,而AFB2和AFG1的加標回收率低于80%,需要進一步凈化。

表4 不同酸濃度提取對7種真菌毒素回收率的影響

2.3.2 凈化劑優化結果

因為小麥中存在大量干擾物(如色素、蛋白和糖等),需要對提取液進行凈化,GCB 對色素具有強吸附效果,PSA可除去碳水化合物、有機酸和少量色素,是目前較為常用的凈化劑[12],因此本研究選取GCB和PSA作為QuEChERS凈化劑。2種凈化劑處理小麥加標回收率如圖2所示。由圖2可知:GCB對OTA、ZEN、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2均有強吸附作用,對DON無吸附,適合DON的凈化。當PSA用量為20～50 mg/g時,加標回收率維持在83%～105%,說明PSA適合OTA、ZEN、DON、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2 這7種毒素的凈化。

圖2 2種凈化劑用量對7種毒素加標回收率的影響Fig.2 Effects of dosage of two sorbents on the recoveries of seven mycotoxins

因此,最終確定采用包含體積分數0.5%甲酸的84%乙腈水溶液作為提取劑,PSA作為QuEChERS 凈化吸附劑。

2.4 不同糧谷樣品毒素檢測

2.4.1 不同糧谷加標回收率

采用優化的凈化方法,對小麥、大米、玉米、花生和綠豆這5種市售糧谷樣品進行分析,加標回收率如表5所示。由表5可知:7種真菌毒素的加標回收率在84.15%～103.59%范圍內,均符合檢測要求,該方法適合多種糧谷樣品的真菌毒素檢測。

表5 不同種類糧谷中7種毒素的加標回收率

2.4.2 實際樣品檢測

對市售的豆類、花生、面粉、大米、小麥及其成品粉狀商品共計25份樣品進行檢測,結果如表6所示。由表6可知:DON在18份樣品中均有檢出,檢出率達80%,均未超出限量標準;OTA、ZEN、AFB1和ABF2的檢出率分別為20%、28%、24%和12%;AFG1和AFG2均未檢出。OTA、ZEN和AFB1超標率分別為8%、4%和16%,超標樣品均為粉狀制品,說明糧谷深加工產品的毒素超標風險較大,為確保糧食制品質量安全,在加工環節中對真菌毒素污染物監測具有重要意義。

表6 市售糧谷樣品7種毒素檢測結果

3 結論

建立了基于QuEChERS-UPLC-MS/MS檢測技術的糧谷樣品7種真菌毒素的快速檢測方法。在優化色譜流動相后,7種毒素擁有較好的峰形和較高的響應強度;通過優化提取溶劑和凈化方法,有效提高了方法的加標回收率。該方法中7種毒素在各質量濃度范圍內線性關系良好(R2>0.99),檢出限低,靈敏度高,適用于豆類、花生、玉米、大米和小麥5種樣品的真菌毒素檢測。利用本方法對25份糧谷樣品進行檢測,OTA、ZEN、DON和AFB1檢出率較高。因此,需要加強對這4種真菌毒素的檢測和防護,保障國家食品安全。